In vivo doppio substrato Bioluminescent Imaging

Questa procedura visualizza e quantifica la ran e la luciferasi della lucciola. Nello sviluppo di tumori ortotopici in vivo, iniziare costruendo linee cellulari stabili che esprimono la luciferasi ran, quella della lucciola o entrambe. Successivamente, verificare funzionalmente la regolazione in vitro del costrutto reporter espressa in modo stabile.

Il passo successivo consiste nell'impiantare le cellule nel cuscinetto adiposo mammario ed eseguire l'acquisizione e la quantificazione dei segnali provenienti dalla ran e dalla luciferasi della lucerna. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come l'immunohistochimica, è che consente una visione longitudinale e dinamica della regolazione genica in vivo durante la progressione tumorale e le metastasi. Iniziare trasfettando quattro cellule carcinoma T una memoria con un vettore di espressione che codifica per la luciferasi vanilla in coltura.

Trasfettare in una concentrazione ottimizzata di antibiotico per diversi giorni. Quindi selezionare circa 10 singole colonie esprimenti luciferasi ran vanilla per monitorare il grado di espressione. Continuare ad amplificare le colonie che esprimono elevate quantità di luciferasi ran vanilla per analisi funzionali.

Clonare il regione promotrice di interesse in un plasmide reporter di luciferasi PGL4 che ospita un marcatore selezionabile distinto da quello utilizzato per la selezione dell'espressione stabile di vanilla, trasfettare le cellule maligne e selezionare una popolazione policlonale stabile di luciferasi del lucciolo; verificare mediante saggi tradizionali in vitro basati su cellule in piastre a 96 pozzetti che le cellule DBR regolino l'espressione della luciferasi del lucciolo in modo concorde con quanto osservato nelle cellule parentali trasfettate in maniera transiente. Con questi vettori, posizionare le cellule su un agitatore orbitale per 15 minuti per lisare le cellule.

Verificare inoltre che l'espressione di vanilla sotto il promotore del CMV non sia regolata da diverse stimolazioni cellulari o condizioni di trattamento. Coltivare le cellule di carcinoma metastatico DBR quattro uno con bassa confluenza il giorno precedente quello previsto. Per il passaggio di inoculazione in vivo, dissociare le cellule quattro uno mediante tripsina prima dell'inoculazione.

Lavare accuratamente nel mezzo di crescita e diluire immediatamente le cellule in PBS. Conservare sul ghiaccio. Anestetizzare topi femmina bowel C di quattro-sei settimane con isoflurano.

Utilizzando una pinzetta, afferrare delicatamente e sollevare il quarto cuscinetto adiposo inguinale. Posizionare con attenzione un ago da 27,5 G con il bisello rivolto verso l'alto ed iniettare nel cuscinetto adiposo direttamente sotto il capezzolo.

Avendo particolare cura a non spingere l'ago nella cavità addominale. Rilasciare la ghiandola e iniettare lentamente 50 microlitri della sospensione cellulare nel pad adiposo della memoria mentre i topi sono ancora anestetizzati. Iniettare 100 microlitri di rosso elettivo nella vena laterale della coda.

Posizionare immediatamente il topo nel sistema di imaging IVUS 200 ed acquisire un'immagine luminosa di un minuto. Riportare il topo nella sua gabbia per circa un'ora, in modo da assicurare che qualsiasi segnale residuo di ran vanilla Lucifer si sia dissipato. Somministrare ora il sale potassico di D Lucifer mediante iniezione intraperitoneale dopo cinque minuti, quindi anestetizzare il topo utilizzando isoflurano.

Trasferire all'IVUS 200 in una posizione analoga a quella dell'acquisizione dell'immagine originale RAN in modalità vaniglia. Utilizzando il software per immagini in tempo reale IVUS impostato sulla modalità fotoni. Stabilire i valori sia per l'acquisizione firefly che per quella precedente.

Le cellule altamente aggressive 41 formano tumori palpabili entro una settimana. Pertanto, ogni settimana iniettare nei topi la red eject cine per monitorare la crescita generale del tumore e le metastasi. Successivamente, iniettare d Lucifer per monitorare il segnale specifico della via durante le varie fasi dello sviluppo tumorale.

Monitorare la crescita del tumore primario normalizzando le acquisizioni di luciferasi RAN alle prime misurazioni effettuate al momento dell'inoculazione delle cellule tumorali. Ancora più importante, calcolare i valori RLR nel tempo per stabilire la regolazione temporale dei singoli sistemi di segnalazione in relazione alla crescita e progressione del tumore. Confrontare ora i valori RLR polmonari con quelli calcolati per il tumore primario per determinare la regolazione spaziale dei singoli sistemi di segnalazione in relazione alla crescita tumorale e alla metastasi.

Immagini biioluminescenti vengono utilizzate per visualizzare e monitorare i cambiamenti nella composizione cellulare all'interno del tumore primario. Innanzitutto, si mescolano cellule 4T1 che esprimono la luciferasi vanillina con le loro controparti non metastatiche e isogeniche 4T07 che esprimono la luciferasi della lucciola, quindi si iniettano diverse proporzioni di queste popolazioni miste di cellule tumorali del seno nel cuscinetto adiposo mammario, come mostrato in precedenza. Si acquisiscono immediatamente sia le immagini della luciferasi della lucciola che della luciferasi vanillina per stabilire un rapporto iniziale RS rappresentativo di una data miscela di cellule inoculate.

Continuare ad acquisire immagini longitudinali duali di bioluminescenza per rappresentare la composizione cellulare all'interno del tumore primario. Valutare inoltre la metastasi spaziotemporale di ciascun derivato del carcinoma mammario in relazione alla crescita e al progresso del tumore. Poiché ogni immagine è internamente coerente e controllata, il segnale persistente proveniente dal tumore primario costituisce un parametro importante per valutare l'insuccesso complessivo di ciascuna acquisizione dati vanilla e firefly.

Il substrato linina è altamente sensibile all'ossidazione, con conseguente auto-luminescenza. In questo caso, un'iniezione endovenosa fallita di linina produce un segnale non specifico proveniente dal tratto intestinale, anziché dal tumore primario. In questa acquisizione renale riuscita di un topo portatore di 41 tumori primari e di metastasi polmonari, misurazioni del segnale specifico del percorso possono essere derivate dall'imaging della luciferasi della lucciola.

Questi dati permettono il calcolo della RS sia dal tumore primario sia dalle sue metastasi polmonari. Al termine di questo esperimento, altre tecniche come l'immunohistochimica e l'ibridazione in situ possono essere utilizzate per verificare che l'mRNA e la proteina siano regolati in modo analogo al costrutto da voi riportato.