A PCR-based metodo di genotipizzazione di distinguere tra le varietà selvatiche di tipo ornamentale e di Imperata cylindrica

L'obiettivo principale di questa procedura è quello di fornire un protocollo di genotipizzazione molecolare rapido ed economico in grado di differenziare tra varietà di Retta cylindrica, tipicamente chiamate gon grass, che non possono essere distinte solo dalla morfologia. Ciò si ottiene identificando e isolando prima il tessuto da una varietà di gon grass di interesse. Il passo successivo consiste nell'estrarre il DNA nucleare e gesso dal tessuto raccolto.

La successiva reazione a catena della polimerasi viene eseguita sul DNA estratto utilizzando primer specifici per varietà che mirano alle differenze di sequenza nella regione LF del turno di PLA, nonché appropriati controlli positivi e negativi. Il passaggio finale consiste nell'eseguire l'elettroforesi su gel su ciascuna delle quattro reazioni di PCR per visualizzare i prodotti di PCR amplificati. In definitiva, la varietà di gon grass raccolta viene determinata attraverso l'analisi dei divieti di prodotti PCR specifici per varietà risultanti sui piani invasivi che costano agli Stati Uniti circa 3,4 miliardi all'anno, causando danni sostanziali sia alle risorse agricole che a quelle naturali.

L'erba selvatica imparata Electrica, nota anche come Cogan, è una delle 10 erbacce più invasive al mondo. L'erba di Cogan forma una rapida diffusione in mono popolamenti che sostituiscono la vegetazione autoctona e, a loro volta, gli animali che dipendono da quella vegetazione autoctona L'erba GaN attualmente infesta 490 milioni di ettari in tutto il mondo e circa 500.000 ettari negli Stati Uniti e la varietà ornamentale di ti di tus centrica è ampiamente commercializzata con i nomi di tus Centrica, Arbra, Baren rosso e sangue giapponese grossolano come lo chiameremo JBG. Questa varietà è putativamente sterile e non invasiva ed è considerata desiderabile per le sue foglie di colore rosso.

In determinate condizioni, l'erba rossa giapponese può produrre semi vitali e tornare a una forma completamente verde che è indistinguibile dall'erba cogan di tipo selvatico. Come puoi vedere, entrambi possiedono foglie verdi e sono più grandi della varietà ornamentale tradizionale con foglie più grandi. Inoltre, le piante di tipo invertito e selvatico hanno rizomi più grandi e la varietà ornamentale aumenta il suo potenziale riproduttivo asessuato.

L'inversione effettua l'identificazione attraverso la sola morfologia. Un compito impegnativo. I metodi molecolari forniscono un mezzo per distinguere con precisione le piante invasive e i materiali vegetali che non possono essere identificati attraverso i normali mezzi visivi.

I metodi molecolari sono fondamentali per proteggersi dalla diffusione e dall'introduzione di piante invasive. L'applicazione di questo protocollo molecolare fornisce un mezzo per distinguere con precisione i revert dell'erba rossa giapponese dall'erba di Kogan. Questo protocollo può aiutare a prevenire la co-occorrenza con l'erba di Kogan e la possibile formazione di ibridi vitali.

Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto alle tecniche esistenti come il polimorfismo della lunghezza del frammento amplificato, o l'analisi A FLP e cose come il sequenziamento del DNA, è che fornisce una tecnica di genotipizzazione molecolare molto economica e rapida che può facilmente distinguere la differenza tra l'erba kogan di tipo selvatico e le varietà di erba sangue giapponese. A dimostrare la tecnica sarà Joseph Hery, uno studente universitario del nostro laboratorio. Per prima cosa identifica un esemplare da un sito in cui crescono l'erba gon o l'erba rossa giapponese e devono essere distinte l'una dall'altra.

L'erba rossa giapponese si distingue facilmente dall'erba gon di tipo selvatico per le sue foglie rosso vivo. Tuttavia, l'erba rossa giapponese è quasi indistinguibile dall'erba Kogan in quanto entrambe hanno foglie verdi più lunghe, più area fogliare e rizomi più grandi rispetto all'erba rossa giapponese ornamentale. Questo metodo può essere utilizzato su fazzoletti fogliari freschi, congelati e recentemente essiccati.

Se si conservano i tessuti per l'estrazione del DNA in un secondo momento, il metodo migliore è congelare e conservare immediatamente il tessuto a meno 80 gradi Celsius. Se è necessaria una conservazione a secco, inserire il fazzoletto in una busta di carta e conservare la busta in gel di silice disidratato o altri essiccanti attivi a temperatura ambiente. Se si desidera utilizzare tessuto fresco, assicurarsi che il DNA venga estratto entro tre ore dalla raccolta per evitare la degradazione.

Questa procedura utilizza il mini kit per piante DNEZ di Kyogen secondo le istruzioni del produttore con una piccola modifica. Qui. La procedura è stata adattata in modo da utilizzare più di 100 milligrammi di tessuto fresco o congelato o più di 20 milligrammi di tessuto essiccato. Per prima cosa, macinare più di 100 milligrammi di tessuto fogliare fresco o congelato, o più di 20 milligrammi di tessuto fogliare secco in una polvere fine utilizzando tre giri di azoto liquido con macinazione in un mortaio e pestello refrigerati.

Pesare la polvere congelata da un tessuto fresco o congelato in aliquote da 100 milligrammi. Se si utilizza un fazzoletto fogliare secco, pesare la polvere in aliquote da 20 milligrammi. Dopo questo passaggio, procedere con l'estrazione del DNA secondo le istruzioni del produttore utilizzando uno spettrofotometro come il test dello spettrofotometro NanoDrop, DNA, qualità e quantità buone rese di DNA dovrebbero essere comprese tra 50 e 150 nanogrammi per microlitro con due rapporti 60 su due 80 e 2 32 80 vicini a 2.0 come visto. Qui.

Condurre l'elettroforesi utilizzando un gel AROS standard all'1%. Verificare la presenza di bande relativamente grandi superiori a 10 KB con striature minime o nulle dovute alla contaminazione dell'RNA se la concentrazione di DNA è elevata, diluire i campioni a 70 nanogrammi per microlitro per i passaggi successivi. I primer PCR utilizzati in questo protocollo, indicati dalle frecce rosse e verdi, si basano sulle differenze di sequenza tra la regione del distanziatore LF intonacata dell'erba di Cogan e i genotipi dell'erba del sangue giapponese.

Queste differenze si presentano sotto forma di polimorfismi a singolo nucleotide e inserzioni e delezioni indicate dalle frecce nere verticali, che consentono lo sviluppo di primer specifici per varietà. Localizzando i primer nei siti di sequenze uniche, le sequenze di primer sono contenute nella parte scritta del protocollo per ogni campione di DNA isolato impostato due reazioni PCR da 50 microlitri in provette PCR a parete sottile da 0,2 millilitri su ICE utilizzando ciascun set di primer secondo il protocollo scritto. Se la concentrazione di DNA è bassa, è possibile aggiungere più DNA a ciascuna reazione regolando la quantità di acqua doppia distillata priva di nucleasi in modo che il volume totale della reazione rimanga di 50 microlitri.

Non utilizzare più di cinque microlitri di DNA o il 10% del volume totale per reazione poiché le impurità contenute nei campioni di DNA possono inibire le reazioni PCR per garantire che tutti i reagenti PCR funzionino, impostare bene il controllo positivo. Utilizzando i primer di controllo positivo, impostare il controllo negativo utilizzando lo stesso primer di controllo impostato come il controllo positivo, ma con doppia acqua distillata al posto del DNA estratto a questo punto, ci sono un totale di quattro reazioni PCR per ogni campione da testare. Successivamente, eseguire le amplificazioni PCR in un termociclatore dotato di coperchio riscaldato utilizzando i parametri del ciclo PCR nel protocollo scritto L'ottimizzazione per la temperatura di inginocchiamento primaria, i tempi di estensione e il numero di cicli possono essere necessari a seconda della qualità della polimerasi di adesività dei primer del DNA o del tipo di termociclatore utilizzato.

Una volta completate le reazioni di PCR, separare i prodotti della PCR su un gel all'1% utilizzando l'elettroforesi standard. Far scorrere i campioni a circa 120 volt fino a quando il fronte D raggiunge i tre quarti della lunghezza totale del gel. Visualizza il gel sotto la luce UV e ispeziona le bande risultanti per vedere se un frammento di DNA appropriato è stato amplificato.

Questo gel rappresentativo mostra i risultati dell'elettroforesi dei prodotti PCR derivati da campioni di DNA di Kogan grass, sangue giapponese e sangue giapponese combinati con erba di Kogan e primer specifici JBG, nonché il controllo positivo LF e un controllo negativo senza modello. Il set di primer di controllo positivo turn LF funziona ugualmente bene per l'erba di Cogan, l'erba del sangue giapponese, l'inversione dell'erba del sangue giapponese e altre erbe e si tradurrà in una banda di 890 paia di basi. Se tutti i reagenti PCR sono privi di contaminanti del DNA, la reazione di controllo negativo non si tradurrà in un prodotto PCR.

Se il campione di DNA è derivato da erba kogan di tipo selvatico, una reazione PCR utilizzando il set di primer specifici per l'erba di Kogan risulterà in una singola banda a circa 595 paia di basi, mentre i primer specifici JBG risulteranno in nessuna banda. Allo stesso modo, se il campione di DNA è derivato da JBG o da una reazione J-B-G-A-P-C-R invertita, l'uso del set di primer specifico JBG risulterà in una singola banda a circa 594 coppie di basi. Mentre gli inneschi specifici per l'erba Kogan non risulteranno in alcuna banda.

Poiché il JBG e il JBG invertito hanno una sequenza di acido nucleico identica, avranno quindi modelli di bande identici. Tuttavia, le differenze morfologiche tra JBG e JBG revert sono abbastanza evidenti, quindi mentre i risultati della PCR saranno gli stessi, le varietà JBG sono facili da distinguere a livello di pianta. Il sequenziamento del DNA dei prodotti PCR può identificare possibili cambiamenti nelle sequenze di DNA per diversi ecotipi di erba di cogan.

Lo sviluppo di questa tecnica fornisce il primo metodo molecolare semplificato in grado di distinguere con precisione tra il tipo K selvatico e l'erba e la forma invertita della sua varietà ornamentale, l'erba rossa giapponese. Incoraggiamo gli utenti di questo protocollo a contattarci per segnalare i risultati derivanti dall'uso di questo protocollo. Tali informazioni condivise aiuteranno a fornire informazioni sulla distribuzione dell'erba rossa giapponese.

Ciò aiuterà anche le autorità di regolamentazione dell'USDA a prendere decisioni informate sulle azioni che potrebbero essere necessarie per aggirare la diffusione e la potenziale ibridazione delle varietà di erba Cogan altamente invasive.