RNAi mediata Knockdown Gene e Transgenesi dalla microiniezione nel nematode Necromenic Pristionchus pacificus
16 ottobre 2011
In organismi modello, transgenesi in grado di manipolare le funzioni del gene, mentre RNAi può knockdown trascritti di mRNA specifico 1-2. Questo protocollo si propone di illustrare le tecniche necessarie per introdurre in modo stabile il DNA trasmessi e transitori di RNA a doppio filamento nel nematode necromenic Pristionchus pacificus Per gli studi in biologia evolutiva dello sviluppo, e comportamentali.
L'obiettivo generale di questa procedura è trasformare con successo il DNA esogeno e ridurre la funzione genica nei nematodi Priyanka pacificus. Per la trasgenesi, iniziare preparando il DNA genomico appropriato con estremità coesive compatibili.
Per l'interferenza dell'RNA, sintetizzare il gene di interesse utilizzando un kit di trascrizione di RNA a doppio filamento. Successivamente, microiniettare gli individui PRIs DIANCA pacificus con il DNA o con l'RNA a doppio filamento. Analizzare la popolazione F1 per il fenotipo del marcatore selezionato in caso di trasgenesi, oppure selezionare per il fenotipo di silenziamento in caso di interferenza dell'RNA.
Continuare a monitorare i risultati di F due vermi transgenici per ottenere risultati che mostrino espressioni geniche specifiche utilizzando un reporter GFP mediante microscopia a fluorescenza. Ciao, sono Ray Hong, California State University of Northridge, e questa dimostrazione illustrerà i passaggi per la manipolazione genetica in nematodi pristi specifici. In un organismo modello emergente, l'esecuzione di RNAi e di truss Genesis può rispondere a domande fondamentali in biologia dello sviluppo e nel comportamento, caratterizzando le funzioni e le espressioni geniche.
I soggetti alle prime esperienze con questo metodo trarranno beneficio dall'osservare come posizionare il verme sul cuscino di iniezione e come iniettare il verme nel piano focale corretto, dove i gonidi sono visibili. A differenza dei gangli, i gonidi sono specifici per SCA poiché si incrociano dorsalmente e migrano progressivamente mentre il nematode si sviluppa dallo stadio J4 avanzato fino all'adulto. Inoltre, al DNA genomico digerito con enzimi di restrizione compatibili, si dovrà aggiungere il transgene e il marcatore di co-iniezione per preparare la miscela di iniezione.
Jessica Single poin lab nel mio laboratorio illustrerà la microiniezione nei casi PRI specifici per la trasgenesi; sono richiesti costrutti di DNA tridimensionali per l'iniezione del marcatore dominante di co-iniezione. I costrutti di DNA genomico e il transgene reporter bersaglio vengono digeriti con enzimi di restrizione compatibili. I costrutti di DNA vengono raccolti mediante un protocollo di precipitazione con etanolo.
Il mix di iniezione viene preparato alle concentrazioni indicate nella tabella. Verificare le impostazioni della valvola del serbatoio di azoto. Caricare ora uno o due microlitri del mix di iniezione nell'ago.
Posizionare l'ago nel manipolatore per microiniezione. Spezzare la punta dell'ago toccandola leggermente contro il bordo di un capillare sottile posizionato su un vetrino e sistemarlo in posizione di attesa. Versare quindi olio di paraffina per coprire la piastra di J con quattro vermi adulti giovani.
Prelevare un singolo verme e trasferirlo su un cuscino di iniezione. Sotto il microscopio, posizionare l'ovaio del verme in direzione dell'ago con la vulva rivolta lontano dall'ago. Abbassare quindi l'ago nella posizione visibile nel campo del microscopio.
Portare la gonade superiore e l'ago nello stesso piano focale. Pungere delicatamente il verme e iniettare la miscela. Osservare le uova che si separano dirigendosi verso l'estremità distale, segno indicativo di un'iniezione avvenuta con successo.
Riposizionare l'ago per iniettare la gonade inferiore e ripetere l'iniezione. Poiché questa gonade si trova sotto l'intestino, la dispersione delle uova non sarà visibile e pertanto risulterà più difficile valutare il successo dell'iniezione. Tuttavia, dopo l'iniezione, il verme dovrebbe rimanere integro senza ghiandole protrudenti.
Rimettere l'ago nella posizione di riposo. Aggiungere una goccia di buffer M nine per recuperare il verme utilizzando alcuni batteri OP 50 su un'ansa. Toccare il verme con gli OP 50 in modo che aderisca.
Ora trasferire il verme su una piastra con gocce da 50 microlitri di OP50. Conservare i vermi iniettati a 20 gradi Celsius per circa quattro giorni, per consentire loro di deporre e far sviluppare la progenie F1. Ora esaminare i vermi per il fenotipo selezionato.
Selezionare singole F1 con il fenotipo osservato e trasferirle in una nuova piastra seminata, quindi conservare a 25 gradi Celsius. Infine, per le linee transgeniche, trasferire singole F2 in piastre individuali. Conservare le generazioni successive a 20 gradi Celsius.
La manipolazione della funzione genica a livello dell'organismo mediante RNAi e transgenesi rappresenta un aspetto fondamentale del modello Ppac pacificus per la biologia evolutiva dello sviluppo; rispetto a un verme di tipo selvatico mostrato a sinistra, la linea transgenica stabile F four PPR L three determina un fenotipo dominante "roller" che esprime GFP nei neuroni della testa. Al contrario, questo esperimento di RNAi genera mutanti PRL one che mostrano un completo silenziamento della locomozione rotatoria normalmente osservata nel mutante PRL one "roller" con acquisizione di funzione TU 92. Una volta acquisita padronanza, ogni iniezione può essere completata in cinque minuti. È importante ricordare che tutti gli F2 derivanti da linee transgeniche F1 indipendenti devono essere isolati singolarmente per stabilire linee F2 promi indipendenti.
Ciò è dovuto al fatto che abbiamo riscontrato un'espressione di GFP altamente variabile tra le linee F2 e che la trasmissione del fenotipo roller non correla con il livello di espressione di G.
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Panoramica
Questo protocollo illustra le tecniche per l'introduzione di DNA strettamente trasmesso e RNA a doppio filamento transitorio nel nematode necromenico Pristionchus pacificus. Questi metodi sono essenziali per manipolare le funzioni geniche e studiare diversi processi biologici.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Genetica
- Biologia dello sviluppo
Sfondo
- La trasgenesi permette la manipolazione delle funzioni geniche negli organismi modello.
- L'interferenza dell'RNA (RNAi) viene utilizzata per ridurre trascritti specifici di mRNA.
- Pristionchus pacificus rappresenta un modello per studi evolutivi e comportamentali.
- Comprendere la funzione genica è fondamentale per ottenere informazioni sui processi di sviluppo.
Scopo dello studio
- Trasformare con successo DNA esogeno in Pristionchus pacificus.
- Abbattere la funzione genica utilizzando tecniche di interferenza dell'RNA.
- Facilitare studi in biologia evolutiva, dello sviluppo e comportamentale.
Metodi Utilizzati
- Preparazione del DNA genomico con estremità coesive compatibili per la trasgenesi.
- Sintesi di RNA a doppio filamento per l'interferenza dell'RNA.
- Microiniezione di DNA o RNA a doppio filamento nei gonadi di Pristionchus pacificus.
- Selezione della popolazione F1 per fenotipi marcatore selezionati.
Risultati principali
- Trasformazione riuscita di DNA esogeno nei nematodi.
- Silenziamento efficace della funzione genica mediante RNAi.
- Identificazione di cambiamenti fenotipici nella generazione F1.
- Dimostrazione dell'utilità di Pristionchus pacificus negli studi genetici.
Conclusioni
- Le tecniche descritte sono efficaci per la manipolazione genetica nei nematodi.
- Questi metodi possono far progredire la ricerca in diversi campi biologici.
- Pristionchus pacificus è un organismo modello prezioso per lo studio della funzione genica.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Metodo
Lo sviluppo di tecniche affidabili di manipolazione genetica in organismi modello emergenti come Pristionchus pacificus amplia le capacità di validazione degli obiettivi al di là dei sistemi tradizionali. Questo metodo consente la riduzione del rischio meccanicistica di vie evolutivamente conservate attraverso l'abbattimento genico diretto e la trasgenesi stabile. Supporta lo sviluppo di modelli preclinici fornendo un sistema geneticamente accessibile per lo screening fenotipico e la scoperta di biomarcatori in saggi basati su nematodi.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Bersaglio
- Valore scientifico: Consente l'analisi di ipotesi terapeutiche mediante silenziamento genico mediato da RNAi di alleli dominanti come prl-1(tu92) per valutare la funzione genica in fenotipi di locomozione.
- Valore operativo: Fornisce un protocollo riproducibile di microiniezione per generare linee transgeniche stabili che esprimono reporter GFP sotto promotori specifici per tessuto.
- Valore predittivo: Facilita la chiarificazione dei percorsi molecolari consentendo l'osservazione diretta degli effetti del silenziamento genico su fenotipi neurali e muscolari nella progenie di prima generazione (F1).
Sviluppo di screening e saggi
- Prontezza del saggio: Produce popolazioni F1 sincronizzate adatte allo screening ad alto contenuto di fenotipi di silenziamento genico mediante marcatori visibili come la locomozione di tipo roller.
- Output quantitativo: Permette la quantificazione basata sulla fluorescenza dell'espressione del transgene (ad esempio, GFP) nelle generazioni F2 per analisi di dose-risposta e di penetranza.
- Riutilizzo della piattaforma: Stabilisce un protocollo standardizzato di microiniezione applicabile a multipli transgeni e costrutti di RNAi in P. pacificus.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Rilevanza per le malattie: Supporta studi sull'evoluzione della conservazione di vie neurogeniche e metaboliche rilevanti per modelli di malattie umane.
- Continuità traslazionale: Permette il passaggio dall'abbattimento genico in F1 all'ottenimento di linee stabili in F2 per la valutazione fenotipica longitudinale.
- De-risking meccanicistico: Riduce i falsi positivi nella validazione del bersaglio confermando il collegamento tra fenotipo e genotipo mediante analisi di recupero e di segregazione.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si integra nei flussi di lavoro della fase iniziale di scoperta consentendo la valutazione della funzione genica prima dell'identificazione del capostazione, con risultati che informano la selezione del bersaglio e i successivi studi meccanicistici.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi mediante silenziamento genico reversibile e sovraespressione stabile per chiarire le relazioni tra geni e fenotipi.
- Screening: Genera ceppi transgenici pronti per saggi con reporter rilevabili per studi sulla sensibilità ai composti e sulle interazioni genetiche.
- Analisi: Fornisce output quantitativi di fluorescenza e valutazione fenotipica per confrontare condizioni genetiche e valutare la penetranza.
- Ricerca traslazionale: Collega la manipolazione genica agli esiti fenotipici in un sistema con percorsi di sviluppo conservati.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una piattaforma di microiniezione trasferibile per la validazione iterativa di bersagli su più geni e ceppi.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia nella validazione dell'obiettivo consentendo una perturbazione genetica diretta in un modello di nematode geneticamente modificabile.
- Valore operativo: Fornisce protocolli standardizzati e riproducibili per la trasgenesi e l'RNAi, con parametri di iniezione definiti e tempistiche di screening.
- Valore strategico: Migliora le decisioni di avanzamento o interruzione del progetto riducendo l'ambiguità meccanicistica nei percorsi dell'obiettivo attraverso il recupero fenotipico e la segregazione.
- Impatto sul portafoglio: Permette la priorizzazione dei bersagli in base al rischio, basandosi sulla funzione conservata e sulla farmacabilità in modelli evolutivamente distanti.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nella dissezione di nematodi e nelle tecniche di microiniezione per il rilascio specifico nell'ovaio.
- È dipendente da un apparato per microiniezione, dalla regolazione della pressione dell'azoto e dalla preparazione di aghi capillari.
- Necessita di protocolli standardizzati per la preparazione di DNA/RNA, inclusa la digestione con enzimi di restrizione e la precipitazione con etanolo.
- Richiede coordinamento tra gruppi di lavoro per la manutenzione dei ceppi, lo screening fenotipico e il tracciamento delle generazioni.
- È limitato dalla migrazione ventrale degli ovari didelfi, che richiede un'iniezione bilaterale per ottenere una trasmissione germinale costante.
