Mappatura ottico dei potenziali d'azione e transitori Calcio nel Cuore mouse

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di mappare otticamente simultaneamente il potenziale transmembrana e il transitorio intracellulare del calcio in cuori di topo perfusi LOR isolati intatti. Ciò si ottiene asportando prima il cuore di topo intatto, quindi incannulando l'aorta e iniziando la perfusione LOR. Il passo successivo consiste nell'immobilizzare il cuore caricando una contrazione di eccitazione sull'accoppiatore e quindi bloccando il cuore alla camera di perfusione.

I passaggi finali consistono nel caricare i coloranti ottici e fare i preparativi per ridurre gli artefatti di movimento durante l'esperimento. Le immagini ottiche si ottengono raccogliendo la luce emessa dal cuore con le mie fotocamere cam Ultima LC Moss. Ehi, mi chiamo di.

Sono uno studente laureato alla Washington University. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto al metodo esistente, come il micro elettrodo, è che la mappatura ottica consente una maggiore risoluzione spaziale su tutta la superficie del cuore. Ciao, sono Matt Sulkin.

Sono uno studente laureato alla Washington University. Questo metodo, se eseguito correttamente, può aiutare a rispondere a molte domande in elettrofisiologia cardiaca come le basi dell'aritmogenesi. Iniziare configurando una pompa peristaltica per far circolare le soluzioni a 40 millilitri al minuto.

Quindi impostare una seconda pompa peristaltica a 80 millilitri al minuto. Questa pompa riporta l'otto Perfuse nel serbatoio di contenimento e ossigenazione. Accendere le pompe e lavare l'impianto con un litro, etanolo al 70% per 30 minuti con ricircolo.

Seguire questo lavaggio con due litri di acqua deionizzata senza ricircolo. Una volta evacuata l'acqua, far circolare due litri di soluzione di Tyro e passarla attraverso un filtro da cinque micron. Riscaldare il perfuso da otto a 37 gradi Celsius con una camicia d'acqua e una bolla di circolazione ossigenata nella soluzione.

Regolare la velocità di gorgogliamento del gas per mantenere il pH a 7,35 più o meno 0,05. Monitorare sia il pH che la temperatura durante l'esperimento. Il doppio apparato di mappatura ottica è costituito da due telecamere ad alta velocità in grado di catturare un'immagine di 100 x 100 pixel a 3000 fotogrammi al secondo.

Collegare un filtro passa-banda alla termocamera per imaging del calcio e collegare un filtro passa-lungo alla telecamera per imaging in tensione su un supporto per doppia fotocamera. Fissare uno specchio e una lente diic in modo che la luce di emissione proveniente dal cuore sia focalizzata sullo specchio dalla lente. Inoltre, collegare due fotocamere al supporto e disporle in modo che siano perpendicolari l'una all'altra.

Quindi, imposta la luce di eccitazione. La luce è generata da una lampada alogena e diretta attraverso una guida di luce flessibile. Far passare la luce attraverso un filtro termico, un otturatore per limitare l'esposizione e un filtro passa-banda di eccitazione.

Infine, preparare gli elettrodi di argento e cloruro d'argento installandoli nella camera. Dopo aver ricontrollato e regolato i livelli degli amplificatori e dei filtri, la configurazione è pronta per un cuore. Usa un cocktail di ketamina e xilazina con 100 unità di eparina per anestetizzare un topo prima di procedere.

Assicurati che l'animale non abbia un riflesso del dolore usando un pizzico per le dita dei piedi. Dopo aver praticato un'incisione medio sternale, rimuovere rapidamente il cuore e i tessuti circostanti. Quindi, utilizzando rapidamente il microscopio da dissezione, identificare l'aorta e praticare un taglio netto attraverso l'aorta ascendente sotto l'arteria succlavia destra.

Ora attacca una breve sezione di aorta a una cannula calibro 21 su misura utilizzando quattro suture di seta intrecciate nere Dopo l'incannulamento retrò notevolmente perfu e super fondere il cuore. Con la soluzione Tyro, regolare la portata per mantenere la pressione aortica tra 60 e 80 millimetri. Mercurio misurato da un trasduttore di pressione.

Ora seziona e rimuovi il timo polmonare circostante e il tessuto adiposo. Ora inserisci un tubo di silicone nel ventricolo sinistro attraverso le vene polmonari. Sutura il tubo al tessuto connettivo vicino.

Questo passaggio molto importante previene la congestione e l'acidificazione di Perfuse otto intrappolato nel ventricolo sinistro, soprattutto dopo la soppressione delle contrazioni ventricolari. Per evitare che Perfuse otto movimenti cardiaci indotti, fissare il cuore al fondo della camera di perfusione rivestita con protezione del davanzale all'apice. Inoltre, allungare e fissare le appendici atriali destra e sinistra per aumentare la superficie degli atri nella configurazione verticale.

Ciò massimizzerà la superficie di registrazione. Per condurre le stimolazioni di stimolazione, collegare un elettrodo su misura alla superficie del cuore. Per ridurre gli artefatti da movimento, fissare un piccolo vetro di copertura sopra il cuore sulla superficie della soluzione.

Fallo incuneando il vetro tra diversi perni. Come preparazione finale, focalizzare la luce di eccitazione sul cuore e posizionare le telecamere per ottenere un'immagine ottica, quindi iniziare con il caricamento del colorante durante il caricamento degli stampi. Monitora continuamente le registrazioni ECG per garantire la normale funzione elettrica del cuore.

Inizia con il riscaldamento della statina BLE a temperatura ambiente. Quindi mescolare mezzo millilitro di statina BLEs nell'abbondante otto nel serbatoio di contenimento e diluire il restante 10° millilitro di statina BLEs in un millilitro di soluzione di Tyros. Nei successivi 20 minuti, iniettare lentamente la statina BLEs in tyros attraverso una porta del farmaco vicino alla cannula.

La statina BLE ridurrà gradualmente l'artefatto da movimento. Successivamente, diluire 30 microlitri di colorante sensibile alla tensione in una soluzione di tyro da un millilitro e iniettare lentamente questa miscela nell'arco di cinque o sette minuti nella stessa porta del farmaco. Quindi rifare lo stesso composto.

Questa volta, aggiungendo altri 30 microlitri di indicatore di calcio. Applicare lentamente questa miscela per cinque-10 minuti attraverso la stessa porta. Dopo che l'indicatore di calcio è stato iniettato, attendere altri 5-10 minuti affinché la statina BLE sopprima completamente il movimento e che i coloranti entrino nelle cellule prima di procedere con l'esperimento.

Questa preparazione del cuore è stata fatta. Secondo il protocollo, i segnali ECG sono stati registrati durante la stimolazione ventricolare dalla stimolazione S one S one. I potenziali d'azione e i segnali transitori del calcio sono stati registrati dagli atri a sinistra e dai ventricoli a destra.

La freccia mostra dove si è verificata la dispersione del segnale dai ventricoli raggruppando le registrazioni dalla telecamera in unità di tre pixel per tre pixel, una serie di transitori di calcio e potenziali d'azione possono essere visualizzati dai dati dell'array. È possibile costruire una figura che mostri la conduzione del potenziale d'azione. I dati provenienti da tre punti consecutivi sull'asse trasversale e longitudinale mostrano la variazione di ampiezza con la propagazione del potenziale d'azione su una superficie ventricolare.

Allo stesso modo, è possibile costruire una figura che mostri il potenziale d'azione e la durata dei transitori del calcio. Viene visualizzata una condizione di controllo a sinistra a destra. È stata somministrata un'iniezione di isoproterenolo al cuore, che riduce chiaramente la durata sia dei transitori del calcio che dei potenziali d'azione.

Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere completata in due o tre ore Dopo questa procedura. Altri metodi, come il protocollo di stimolazione, possono essere eseguiti per rispondere a domande aggiuntive, come quelle relative al periodo refrattario del nodo AV.