Mappatura ottico dei potenziali d'azione e transitori Calcio nel Cuore mouse
13 settembre 2011
In questo documento i dettagli della procedura di dissezione, la configurazione strumentale, e delle condizioni sperimentali durante la mappatura ottica del potenziale transmembrana (Vm) e calcio intracellulare transitoria (CAT) in intatti Langendorff isolato perfuso cuori mouse.
L'obiettivo generale di questa procedura è quello di mappare contemporaneamente il potenziale transmembrana e il transiente del calcio intracellulare in cuori di topo isolati e perfusi con soluzione LOR. Questo risultato si ottiene innanzitutto rimuovendo il cuore di topo integro, quindi cannulando l'aorta e avviando la perfusione con soluzione LOR. Il passo successivo consiste nell'immobilizzare il cuore caricando un accoppiatore eccitazione-contrazione e successivamente fissando il cuore alla camera di perfusione.
Gli ultimi passaggi consistono nel caricare i coloranti ottici e predisporre le misure per ridurre gli artefatti dovuti al movimento durante l'esperimento. Le immagini ottiche vengono ottenute raccogliendo la luce emessa dal cuore mediante le telecamere my cam Ultima LC Moss. Ehi, mi chiamo di.
Sono uno studente laureato presso l'Università di Washington. Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come l'elettrodo microscopico, è che la mappatura ottica consente una maggiore risoluzione spaziale su tutta la superficie del cuore. Ciao, sono Matt Sulkin.
Sono uno studente laureato presso la Washington University. Questo metodo, se eseguito correttamente, può contribuire a rispondere a numerose domande nell'ambito dell'elettrofisiologia cardiaca, come ad esempio le basi dell'aritmogenesi. Iniziare configurando una pompa peristaltica per far circolare le soluzioni a 40 millilitri al minuto.
Quindi impostare una seconda pompa peristaltica a 80 millilitri al minuto. Questa pompa riporta il Perfuse eight nel serbatoio di mantenimento e ossigenazione. Accendere le pompe e lavare il sistema con un litro di etanolo al 70% per 30 minuti in ricircolo.
Seguire questo lavaggio con due litri di acqua deionizzata senza ricircolazione. Una volta drenata l'acqua, ricircolare due litri di soluzione Tyro e farla passare attraverso un filtro da cinque micron. Riscaldare il perfusato da otto a 37 gradi Celsius mediante un mantello riscaldante ad acqua e immettere nel liquido un gas arricchito di ossigeno mediante bollicce.
Regolare la velocità delle bolle di gas per mantenere il pH a 7,35 più o meno 0,05. Monitorare sia il pH che la temperatura durante l'esperimento. L'apparato di mappatura ottica doppia è costituito da due telecamere ad alta velocità C moss in grado di acquisire un'immagine di 100 per 100 pixel a 3000 fotogrammi al secondo.
Collegare un filtro passa-banda alla telecamera per l'imaging del calcio e un filtro passa-lungo alla telecamera per l'imaging del voltaggio su un supporto per doppia telecamera. Fissare uno specchio dicromatico e una lente in modo che la luce emessa dal cuore venga focalizzata sulla superficie dello specchio attraverso la lente. Inoltre, collegare due telecamere al supporto disponendole in modo perpendicolare l'una rispetto all'altra.
Successivamente, impostare la luce di eccitazione. La luce è generata da una lampada alogena e diretta attraverso una guida luminosa flessibile. Far passare la luce attraverso un filtro termico, un otturatore per limitare l'esposizione e un filtro passa-banda di eccitazione.
Infine, preparare gli elettrodi di argento e cloruro di argento installandoli nella camera. Dopo aver verificato e regolato attentamente i livelli sugli amplificatori e sui filtri, l'apparato è pronto per un cuore. Utilizzare un cocktail di ketamina e xilazina con 100 unità di eparina per anestetizzare un topo prima di procedere.
Assicurarsi che l'animale non presenti riflesso del dolore mediante una pinzatura del dito del piede. Dopo aver effettuato un'incisione mediana sternale, rimuovere rapidamente il cuore e i tessuti circostanti. Quindi, utilizzando rapidamente un microscopio stereoscopico, identificare l'aorta ed eseguire un taglio netto sull'aorta ascendente al di sotto dell'arteria sottoclavia destra.
Ora fissare un breve segmento di aorta a una cannula personalizzata da 21 gauge utilizzando quattro punti di sutura in seta intrecciata nera. Dopo la cannullazione, perfondere retrogradamente e sovrafondere il cuore con soluzione di Tyro. Regolare la velocità di flusso in modo da mantenere la pressione aortica compresa tra 60 e 80 millimetri di mercurio, misurata mediante un trasduttore di pressione.
Ora dissezionare e rimuovere il tessuto polmonare, il timo e il tessuto adiposo circostante. Inserire ora un tubo di silicone nel ventricolo sinistro attraverso le vene polmonari. Fissare il tubo con punti di sutura al tessuto connettivo adiacente.
Questo passaggio molto importante previene la congestione e l'acidificazione del Perfuse eight intrappolato nel ventricolo sinistro, specialmente dopo la soppressione delle contrazioni ventricolari. Per evitare i movimenti cardiaci indotti dal Perfuse eight, fissare il cuore al fondo della camera di perfusione rivestita con paraspigoli mediante un perno applicato al suo apice. Inoltre, stirare e fissare le appendici atriali destra e sinistra per aumentare la superficie degli atri nella configurazione eretta.
Questo massimizzerà l'area superficiale di registrazione. Per effettuare le stimolazioni di pacing, collegare un elettrodo su misura alla superficie del cuore. Per ridurre gli artefatti dovuti al movimento, fissare un piccolo vetrino coprioggetto sopra il cuore, sulla superficie della soluzione.
Eseguire questa operazione inserendo il vetro tra diversi perni. Come ultimi preparativi, focalizzare la luce di eccitazione sul cuore e posizionare le telecamere per ottenere un'immagine ottica, quindi iniziare il caricamento del colorante mentre si caricano i dies. Monitorare continuamente i tracciati ECG per assicurare il normale funzionamento elettrico del cuore.
Iniziare riscaldando gli BLEs statina a temperatura ambiente. Successivamente, mescolare mezzo millilitro di BLEs statina con i profusi otto nel serbatoio di contenimento e diluire il rimanente un decimo di millilitro di BLEs statina in un millilitro di soluzione Tyros. Nell'arco dei successivi 20 minuti, iniettare lentamente gli BLEs statina in Tyros attraverso un porto per farmaci vicino alla cannula.
Lo statina BLE ridurrà gradualmente l'artefatto del movimento. Successivamente, diluire 30 microlitri di colorante sensibile al voltaggio in una soluzione di Tyro da un millilitro e iniettare lentamente questa miscela, nell'arco di cinque-sette minuti, nello stesso porto del farmaco. Quindi preparare nuovamente la stessa miscela.
Questa volta, aggiungere ulteriori 30 microlitri di indicatore del calcio. Applicare lentamente questa miscela nell'arco di cinque-dieci minuti attraverso lo stesso porto. Dopo l'iniezione dell'indicatore del calcio, attendere ancora cinque-dieci minuti affinché la statina BLE sia completamente efficace nel sopprimere il movimento e affinché i coloranti penetrino nelle cellule prima di proseguire con l'esperimento.
È stato eseguito questo preparato cardiaco. Secondo il protocollo, i segnali dell'ECG sono stati registrati durante la stimolazione di pacing ventricolare da stimolazione S uno S uno. I potenziali d'azione e i segnali transitori del calcio sono stati registrati dall'atrio a sinistra e dai ventricoli a destra.
La freccia indica il punto in cui si è verificata la dispersione del segnale dai ventricoli. Raggruppando le registrazioni della telecamera in unità di tre pixel per tre pixel, è possibile visualizzare un array di transitori di calcio e potenziali d'azione dai dati dell'array. Può essere costruita una figura che mostra la conduzione del potenziale d'azione. I dati provenienti da tre punti consecutivi lungo gli assi trasversale e longitudinale mostrano la variazione dell'ampiezza con la propagazione del potenziale d'azione sulla superficie ventricolare.
Allo stesso modo, può essere costruita una figura che mostra la durata del potenziale d'azione e dei transitori di calcio. A sinistra è mostrata una condizione di controllo, a destra. È stata somministrata un'iniezione di isoproterenolo al cuore, che riduce chiaramente la durata sia dei transitori di calcio sia dei potenziali d'azione.
Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere completata in due o tre ore seguendo questa procedura. Altri metodi, come il protocollo di stimolazione, possono essere eseguiti per rispondere ad altre domande, ad esempio quelle relative al periodo refrattario del nodo AV.
Panoramica
Questo studio presenta una procedura dettagliata per la mappatura ottica del potenziale transmembrana e dei transitori di calcio intracellulare in cuori di mouse isolati perfusi con tecnica di Langendorff. Il metodo migliora la risoluzione spaziale rispetto alle tecniche tradizionali, fornendo informazioni dettagliate sulla elettrofisiologia cardiaca.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Elettrofisiologia cardiaca
- Tecniche di mappatura ottica
- Modelli di cuore di topo
Sfondo
- La mappatura ottica consente la misurazione simultanea di Vm e CaT.
- Metodi tradizionali come i microelettrodi presentano limitazioni nella risoluzione spaziale.
- Questa tecnica può aiutare a indagare l'aritmogenesi.
- La perfusione di Langendorff mantiene la vitalità cardiaca per gli esperimenti.
Scopo dello studio
- Sviluppare un metodo affidabile per la mappatura ottica nei cuori di topo.
- Migliorare la comprensione dell'attività elettrica cardiaca.
- Facilitare la ricerca sui meccanismi delle aritmie.
Metodi Utilizzati
- Escissione e canulazione del cuore di topo per la perfusione.
- Utilizzo di telecamere ad alta velocità per acquisire immagini ottiche.
- Caricamento di coloranti ottici per visualizzare il potenziale transmembranario e i transitori di calcio.
- Monitoraggio del pH e della temperatura durante l'esperimento.
Risultati principali
- Mappatura ottica riuscita del Vm e del CaT nel cuore isolato.
- Dimostrata una riduzione degli artefatti di movimento con l'applicazione del colorante.
- Registrazione efficace di potenziali d'azione e segnali transitori del calcio.
- Validato il metodo per futuri studi elettrofisiologici.
Conclusioni
- La tecnica di mappatura ottica fornisce un'elevata risoluzione spaziale.
- Questo metodo può favorire la ricerca in elettrofisiologia cardiaca.
- Studi futuri potranno sfruttare questa tecnica per esplorare l'aritmogenesi.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
La mappatura ottica del potenziale transmembrana e dei transitori del calcio in cuori di topo fornisce dati spaziali e temporali ad alta risoluzione, fondamentali per la riduzione del rischio meccanicistica nella validazione di bersagli cardiovascolari. Questo approccio consente una valutazione quantitativa dei fenotipi elettrofisiologici, sostenendo la previsione affidabile nei modelli preclinici di aritmia e insufficienza cardiaca. Catturando simultaneamente la dinamica di Vm e CaT, il metodo collega la biologia della scoperta all'allineamento di biomarcatori traslazionali in sistemi rilevanti per la malattia.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Prima Fase della Scoperta e Validazione del Target
- Valore scientifico: Permette l'analisi di ipotesi terapeutiche mappando la dinamica del potenziale d'azione e dei transitori del calcio attraverso il tessuto cardiaco.
- Valore operativo: Supporta la riduzione del rischio biologico mediante la visualizzazione simultanea dei parametri dell'accoppiamento eccitazione-contrazione.
- Valore predittivo: Aumenta la fiducia sul bersaglio collegando perturbazioni molecolari a risposte funzionali di tipo elettrofisiologico.
Sviluppo di screening e saggi
- Prontezza del saggio: Prepara sistemi biologici validati per la valutazione di composti mediante acquisizione standardizzata di segnali ottici.
- Output quantitativi: Genera misurazioni riproducibili della durata del potenziale d'azione, della velocità di conduzione e dell'ampiezza del transiente del calcio.
- Scalabilità: Consente il riutilizzo della piattaforma in diversi modelli di malattie cardiache grazie a protocolli costanti di perfusione Langendorff e di caricamento del colorante.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Rilevanza per le malattie: Applicabile a studi di scompenso cardiaco, aritmie e malattie metaboliche mediante modelli murini geneticamente modificati.
- Continuità traslazionale: Collega le scoperte meccanicistiche della fase di ricerca alla validazione preclinica attraverso il mantenimento dell'architettura tissutale e della perfusione fisiologica.
- Decisioni basate sul rischio: Fornisce indicazioni sui criteri di avanzamento quantificando precocemente il rischio elettrofisiologico nel percorso della scoperta.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si integra nel percorso di scoperta, dalla verifica dell'ipotesi sul bersaglio fino all'identificazione del composto promettente e alla valutazione dell'efficacia preclinica, consentendo un affinamento iterativo dei candidati cardiovascolari basato su letture funzionali di tipo elettrofisiologico.
- Biologia della scoperta: Supporta la chiarificazione dei percorsi e la riduzione del rischio meccanicistico correlando interventi genetici o farmacologici con modelli elettrofisiologici spaziali.
- Screening: Fornisce standardizzazione del saggio e output quantitativi essenziali per uno screening affidabile di composti nella scoperta di canali ionici e modulatori.
- Analisi: Offre misurazioni spazio-temporali del potenziale di membrana (Vm) e del transiente del calcio (CaT) che permettono analisi comparative tra diverse condizioni sperimentali e genotipi.
- Ricerca traslazionale: Mantiene la rilevanza fisiologica attraverso la perfusione di Langendorff, favorendo l'estrapolazione alle risposte dell'organo integro.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una capacità riutilizzabile di fenotipizzazione elettrofisiologica applicabile a diversi progetti cardiovascolari e classi di bersagli.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva nella validazione degli obiettivi riducendo l'ambiguità meccanicistica nell'elettrofisiologia cardiaca.
- Valore operativo: Garantisce standardizzazione e riproducibilità attraverso parametri definiti di perfusione, carico del colorante e acquisizione delle immagini.
- Valore strategico: Migliora le decisioni di avanzamento o interruzione identificando precocemente i rischi elettrofisiologici prima di investimenti significativi.
- Impatto sul portafoglio: Permette la priorizzazione dei candidati in base al rischio, basandosi su profili quantitativi del potenziale d'azione e dei transitori del calcio.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nella dissezione cardiaca, nella perfusione Langendorff e nei sistemi di imaging ottico.
- È dipendente da telecamere CMOS ad alta velocità, sorgenti di luce di eccitazione e set di filtri ottici per la rilevazione a doppio canale.
- Necessita di una standardizzazione condivisa tra i gruppi di lavoro per i protocolli di carico del colorante e le strategie di riduzione degli artefatti da movimento.
- Comporta considerazioni di adattamento quando si passa a ceppi di topi diversi o a modelli di malattia con fisiologia cardiaca alterata.
- Comprende limitazioni pratiche come la tossicità del colorante, lo sbiancamento fotochimico e la necessità di una rigorosa soppressione del movimento per mantenere la qualità dei dati.
