Un protocollo Chelex semplice per l'estrazione del DNA da Anopheles Spp.

L'obiettivo generale di questa procedura è estrarre il DNA della malaria, del parassita e della zanzara dalle sezioni dell'intestino medio e delle ghiandole salivari di anomalie, campioni. Ciò si ottiene tagliando prima la zanzara esattamente all'articolazione tra l'addome e il torace, separando così l'intestino medio dalla sezione della ghiandola salivare. Successivamente, ogni sezione viene macinata separatamente in acqua deionizzata.

Quindi la sospensione tissutale viene lieta e lavata e il pellet cellulare viene recuperato. Infine, il pellet cellulare viene ricostituito e bollito e il DNA viene estratto. In definitiva, è possibile ottenere risultati che mostrano che il DNA delle zanzare e del parassita della malaria è di alta qualità, adatto per l'uso come modello per identificare anomalie, specie vettori e infezioni da malaria genotipiche attraverso la PCR e la digestione con enzimi di restrizione allelica specifici.

Quindi il vantaggio principale di questa tecnica molto semplice rispetto a quelle esistenti come l'estrazione organica e i metodi di selezione è che utilizza pochissimi reagenti sicuri e prontamente disponibili e anche molto meno tempo di lavorazione. Per iniziare a sezionare la zanzara, posizionala su un piccolo pezzo di paraforma e montala su un microscopio da dissezione. Copritelo con una goccia di acqua deionizzata.

Per ammorbidire le dimensioni del tessuto, la carcassa della zanzara si trova proprio all'articolazione tra il torace e l'addome. Intaccando così la testa e il torace dalla sezione addominale. Trasferire ogni sezione di zanzara sezionata in un'autoclave pulita, una provetta da microcentrifuga da 1,5 millilitri pre-etichettata con il numero ID della zanzara e la sezione del corpo, scartare il parafilm e, utilizzando una salvietta Kim inumidita con alcol al 70%, pulire accuratamente il tavolino del microscopio prima di passare alla zanzara successiva per estrarre il DNA della zanzara, prima di pipettare 20 microlitri di acqua deionizzata nella provetta del campione.

E usa la punta della pipetta per macinare la sezione sommersa della zanzara in una sospensione uniforme. Aggiungere 100 microlitri di un'autoclave, una soluzione di saponina XPBS all'1% all'omogeneizzato del campione e agitare delicatamente per mescolare. Incubare il campione a temperatura ambiente per 20 minuti.

Quindi centrifugare a 20.000 G per due minuti e scartare il surnatante. Risospendere il pellet in 100 microlitri uno XPBS. Quindi ripeti la centrifuga.

Aggiungere 75 microlitri di acqua deionizzata sterile e 25 microlitri di 20% in peso per volume. Sospensione di resina Cellex 100 in acqua deionizzata e vortice delicato per risospendere il pellet utilizzando un ago ipodermico sterile calibro 23 fiammato in bruciatore bunsen. Praticare un foro nel coperchio del tubo del campione.

Far bollire la sospensione campione in un blocco riscaldante per 10 minuti. Centrifugare a 20.000 G per un minuto e trasferire la soluzione di DNA in una fiala di conservazione pre-marcata da utilizzare come stampo nelle reazioni PCR per verificare la qualità del DNA estratto, amplificare una regione del gene della subunità quattro della nicotinammide dinucleotide deidrogenasi dell'artropode mi mitocondriale che dovrebbe produrre un frammento di 400 coppie di basi. Successivamente, per differenziare tra le specie di Ananais Gambia, amplificare una regione che fiancheggia gli SNP nella regione intergenica dello spaziatore che dovrebbe produrre dimensioni di 390 coppie di basi per Ananais Gambia Sens Stricto e 315 coppie di basi per Ananais api.

Ansis quindi al genotipo p falciparum anti folato polimorfismi di resistenza ai farmaci. Eseguire la PCR nidificata per amplificare la regione che fiancheggia i codoni di amminoacidi 16, 51, 59, 108 e 164. Nei parassiti il gene diidro folato reduttasi effettua la digestione allelica specifica dell'amplicone per rilevare la resistenza ai farmaci antifolati.

Polimorfismi associati. Controlla le reazioni su un esame in gel 2%AROS. Esempi di risultati di saggi PCR per la qualità dell'estratto di DNA di zanzara, l'analisi dell'identificazione molecolare RABIS e la genotipizzazione di p falciparum mostrano che il metodo Kelex semplificato produce risultati simili al protocollo standard di salatura nonostante il minor numero di passaggi e meno di un quarto del tempo con una qualità del DNA comparabile nei rispettivi estratti, non sorprende che i tassi di positività del campione rispetto alle anomalie, Le specie sorelle del Gambia, così come i tassi di infezione da parassiti, non erano statisticamente diversi in base al test del chi quadrato di McNear.

L'aggiunta di BSA alle miscele di reazione si traduce in un aumento generale dei positivi alla PCR grazie alla rimozione degli inibitori della PCR sia per il kelex semplificato che per il protocollo di salatura regolare. Tuttavia, questo aumento non era statisticamente significativo, tranne che per la qualità del DNA sugli estratti di chelex. La digestione dell'enzima di restrizione allele specifica dell'amplicone p falciparum consente la genotipizzazione delle infezioni della malaria dell'intestino medio e delle ghiandole salivari per gli alleli di resistenza ai farmaci Una volta padroneggiato.

Questa tecnica dovrebbe essere in grado di essere eseguita in circa 37 minuti se eseguita correttamente.