Isolamento del RNA Pseudomonas aeruginosa Colonizzare la Murine tratto gastrointestinale
28 settembre 2011
Un metodo affidabile per l'isolamento di RNA Pseudomonas aeruginosa Recuperato da cecums murino è descritto. L'RNA recuperato è di quantità e qualità sufficienti per qPCR successivi, profili di trascrizione, e l'RNA esperimenti Seq. Questa tecnica può essere adattata per l'isolamento di RNA di altri microbi intestinali.
L'obiettivo generale di questa procedura è isolare l'RNA totale di Pseudomonas aerogen recuperato da ECM murini. Questo viene ottenuto innanzitutto raccogliendo il contenuto luminale del sequel. Successivamente, l'RNA batterico viene isolato.
Quindi vengono effettuati il trattamento con D'S e la purificazione dell'RNA. Infine, l'RNA viene quantificato e la purezza dell'isolato viene verificata mediante analisi con bioanalizzatore e analisi spettrofotometrica. In definitiva, è possibile ottenere RNA batterico di qualità e quantità sufficienti per successive valutazioni sperimentali, come ad esempio tramite QPCR, analisi del profilo di trascrizione o esperimenti di sequenziamento dell'RNA.
Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come l'estrazione con triolo, è che questo metodo prevede diversi passaggi di lisi in condizioni di estrazione estremamente rigorose con acido e cloroformio femminile, al fine di garantire un'RNA di alta qualità. Una dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale, poiché i passaggi di lisi ed estrazione sono difficili da apprendere, in quanto i protocolli scritti omettono dettagli minimi ma essenziali per il successo. La procedura sarà dimostrata da Eduardo Lopez Medina, ricercatore postdottorato, e da Megan Neubauer, responsabile del laboratorio, entrambi del mio laboratorio. Prima di iniziare il prelievo, IMSA pulisce il mortaio in acciaio inox in un bagno di azoto liquido.
Quindi, dopo l'eutanasia di un topo C3 HHEN colonizzato da pseudomonas aerogen, di età compresa tra sei e otto settimane, posizionare l'animale in posizione supina su una tavola di polistirolo ed esporre l'addome all'etanolo al 95%. Successivamente, praticare un'incisione longitudinale mediana attraverso la cute, dallo sterno fino al perineo. Poi allontanare la cute e il peritoneo ed esporre la cavità addominale.
Ora resecare l'intero cieco utilizzando pinze. Tenere il cieco sopra il mortaio in acciaio inossidabile e tagliare entrambe le estremità del cieco con forbici da dissezione. Riempire una punta di pipetta P 1000 con un millilitro di buffer di lavaggio finale otto, quindi inserire la punta nell'estremità prossimale del cieco.
Svuotare il tampone di lavaggio sequel e il contenuto luminale di sequel nel mortaio di acciaio inossidabile. A questo punto, macinare il sequel. Lavare il contenuto di eight con un pestello sterile.
Quindi versare etanolo in un contenitore di ghiaccio secco e inserire un tubo conico in polipropilene da 50 millilitri nel bagno di etanolo e ghiaccio secco. Trasferire il contenuto del lume congelato e macinato nel tubo conico e conservare il tubo a meno 80 gradi Celsius. Questa serie di passaggi rappresenta la parte più delicata della procedura.
Data la natura complessa dei materiali prelevati dal cieco MI, sono assolutamente necessarie ripetute estrazioni a freddo con filoforme; potrebbero essere richieste da tre a cinque estrazioni prima che scompaia l'ampia interfaccia tra le fasi acquose e organiche. Trasferire un volume di fenolo acido cloroformio in un tubo da centrifuga Oak Ridge da 50 millilitri. Chiudere saldamente il tappo con del parafilm e quindi riscaldare il tubo in un bagno d'acqua a 65 gradi Celsius.
Aggiungere metà volume di buffer di lisi in un tubo conico in polipropilene da 50 millilitri, quindi far bollire il buffer per cinque minuti. Dopo aver prelevato il contenuto del lume SQL dallo stoccaggio a meno 80 gradi Celsius, riscaldare brevemente il tubo con un rapido sfregamento tra le mani e quindi aggiungere il buffer di lisi bollente al tubo. Agitare la miscela per omogeneizzare la soluzione del contenuto lume SQL con il buffer di lisi.
Fare bollire il buffer di lisi e il contenuto luminali di SQL per cinque minuti. Con vorticosazione periodica, aprire il tubo da centrifuga Oak Ridge contenente la soluzione di fenolo-cloroformo e trasferire il campione di lisi del contenuto di SQL nel tubo. Quindi richiudere il tappo con perfil e rimettere il tubo nel bagnomaria a 65 gradi Celsius per 10 minuti, agitando il tubo ogni due minuti.
Centrifugare il campione a 2.500 ×g per 15 minuti a quattro gradi Celsius. Trasferire con attenzione la fase acquosa in un nuovo tubo da centrifuga Oak Ridge da 50 millilitri, evitando qualsiasi traccia dell'interfaccia bianca. Quindi aggiungere un volume uguale di fenolo acido cloroformio al nuovo tubo.
Sigillare il tappo con del perfil e mescolare accuratamente il contenuto agitando il tubo al massimo regime di vortice. Continuare a centrifugare il campione e trasferire la fase acquosa nel tubo da centrifuga. Se il volume della fase acquosa superiore diventa troppo ridotto, può essere trasferito in un tubo di diametro più piccolo.
Continuare questo processo fino a quando non sarà più visibile un'interfaccia bianca tra la fase acquosa e quella organica. Quando l'interfaccia bianca è scomparsa, trasferire con attenzione la fase acquosa in una nuova provetta da centrifuga. Quindi aggiungere un volume uguale di cloroformio e alcol isoamilico nella provetta, sigillare il coperchio e mescolare accuratamente il contenuto mediante vortex.
Successivamente, dopo aver centrifugato nuovamente il campione, trasferire la fase acquosa in un tubo conico in polipropilene da 15 millilitri e aggiungere un volume uguale di isopropanolo. Quindi, incubare la soluzione a meno 20 gradi Celsius per almeno due ore o tutta la notte. Dopo l'incubazione del campione, centrifugare il tubo per 45 minuti.
Dopo aver identificato il pellet di consistenza gelatinosa sul fondo del tubo, rimuovere il soprannatante. Lavare ora il pellet con un millilitro di etanolo al 70% freddo di ghiaccio, agitando il tubo al vortex, quindi centrifugare il campione a 10.000 ×g per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Infine, rimuovere il soprannatante e capovolgere il tubo per far asciugare il pellet all'aria a temperatura ambiente per 10 minuti.
Quindi risospendere il pellet di RNA in 200 microlitri di acqua priva di RNAasi. Aggiungere prima 20 microlitri di tampone DNA 10x turbo e 2 microlitri di turbo DNAasi nel tubo microcentrifuga e mescolare delicatamente la soluzione. Incubare quindi il tubo a 37 gradi Celsius per 20 minuti, quindi aggiungere 20 microlitri di reagente di inattivazione del DNA risospeso nel tubo e mescolare accuratamente.
Incubare ora il tubo per altri cinque minuti a temperatura ambiente, mescolando occasionalmente. Successivamente, centrifugare il pellet in una microcentrifuga a 10.000 ×g per 1,5 minuti, quindi trasferire il soprannatante in un nuovo tubo microcentrifuga. Aggiungere un volume di fenolo acido cloroformio freddo al pellet, quindi mescolare accuratamente la soluzione mediante vortex per un minuto.
Dopo aver centrifugato la soluzione per due minuti a 12.500 ×g, trasferire la fase acquosa in un nuovo tubo e aggiungere un volume di cloroformo alcol isoamilo. Quindi mescolare la soluzione mediante vortex, quindi centrifugare nuovamente la soluzione nelle stesse condizioni. Trasferire la fase acquosa in un nuovo microtubo.
Quindi aggiungere 0,1 volumi di acetato di sodio tre molare ed 2,5 volumi di etanolo al 100% freddo di ghiaccio. Vortexare il tubo per mescolare. Incubare il campione a meno 80 gradi Celsius per 30 minuti.
Quindi, dopo aver centrifugato a 12.000 ×g per 30 minuti a quattro gradi Celsius, rimuovere il soprannatante. Infine, lavare il pellet con un millilitro di etanolo al 70% freddo di ghiaccio. Rimuovere il soprannatante e lasciare asciugare il pellet all'aria per 10 minuti.
Sospendere quindi il pellet in 100 microlitri di acqua priva di RNA. L'Agilent Bioanalyzer è una piattaforma basata sulla microfluidica per la determinazione della dimensione, della quantificazione e del controllo di qualità di DNA, RNA, proteine e cellule, e utilizza un parametro di integrità dell'RNA noto come numero di integrità dell'RNA o RIN. L'RNA estratto con questo protocollo presenta rapporti 260/280 compresi tra 1,7 e 2,0 e valori di RIN maggiori o uguali a 7,0.
Un esempio di elettroferogramma dell'RNA batterico ottenuto con un bioanalizzatore Agilent è mostrato qui a sinistra, mentre un'immagine simile a quella di un gel di *Pseudomonas arosa* recuperata dal contenuto intestinale di topi è mostrata qui a destra. A seguito di questa procedura, altri metodi come la PCR quantitativa o il sequenziamento dell'RNA possono essere eseguiti per rispondere ad ulteriori domande, come un profilo più dettagliato dell'espressione genica.
Panoramica
Questo articolo descrive un metodo affidabile per isolare l'RNA da Pseudomonas aeruginosa recuperato dai ciechi murini. La tecnica produce RNA di qualità sufficiente per qPCR, profilazione della trascrizione e sequenziamento dell'RNA.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Microbiologia
- Biologia Molecolare
- Tecniche di Isolamento dell'RNA
Sfondo
- Pseudomonas aeruginosa è un patogeno significativo in varie infezioni.
- L'isolamento di RNA di alta qualità è fondamentale per lo studio dell'espressione genica.
- I metodi esistenti potrebbero non fornire la qualità desiderata dell'RNA.
- Questo metodo incorpora passaggi rigorosi di lisi ed estrazione.
Scopo dello studio
- Sviluppare un metodo affidabile per l'isolamento dell'RNA da Pseudomonas aeruginosa.
- Garantire che l'RNA sia adatto per applicazioni successive.
- Dimostrare l'efficacia del metodo mediante dimostrazione visiva.
Metodi Utilizzati
- Prelevamento del contenuto luminale dai ciechi di topi.
- Passaggi multipli di lisi ed estrazione utilizzando fenolo acido cloroformio.
- Quantificazione e valutazione della purezza dell'RNA.
- Dimostrazione visiva del protocollo da parte del personale di laboratorio.
Risultati principali
- Un RNA di alta qualità è stato isolato con successo dai campioni.
- Il metodo si è rivelato più efficace rispetto alle tecniche tradizionali.
- L'RNA era adatto per qPCR e altre analisi.
- Gli strumenti visivi hanno migliorato la comprensione della procedura complessa.
Conclusioni
- Il metodo sviluppato è affidabile per l'isolamento di RNA da Pseudomonas aeruginosa.
- Può essere adattato per altri microrganismi intestinali.
- Studi futuri potranno sfruttare questa tecnica per diverse applicazioni.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
L'isolamento di RNA di alta qualità da patogeni che colonizzano il tratto gastrointestinale consente la riduzione meccanicistica dei rischi associati a bersagli di virulenza in modelli preclinici. Questo metodo supporta la validazione dei bersagli collegando l'espressione genica batterica a modifiche dello stato immunitario dell'ospite. Fornisce una previsione affidabile per la priorizzazione di candidati anti-infettivi prima dell'identificazione del capostazione.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Indaga ipotesi terapeutiche catturando gli stati trascrizionali in vivo di Pseudomonas aeruginosa durante la modulazione immunitaria dell'ospite.
- Valore operativo: Permette la validazione funzionale di bersagli grazie al recupero riproducibile di RNA patogeno da matrici gastrointestinali complesse.
- Valore predittivo: Supporta la selezione di portafogli correlando le variazioni nell'espressione genica batterica al rischio di disseminazione in modelli neutropenici.
Sviluppo di Screening e Saggi
- Valore scientifico: Prepara sistemi biologici validati per analisi successive, producendo RNA idoneo per applicazioni di qPCR e sequenziamento.
- Valore operativo: Affronta la standardizzazione dei saggi attraverso rigorosi passaggi di lisi ed estrazione che riducono al minimo la variabilità tra lotti in campioni complessi.
- Scalabilità: Evidenzia il potenziale di riutilizzo della piattaforma, poiché il metodo può essere adattato ad altri batteri e funghi intestinali per analisi mirate su ampia scala.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Collega la scoperta attraverso una continuità preclinica, consentendo l'isolamento di RNA da un modello murino di colonizzazione gastrointestinale rilevante per la malattia.
- Valore operativo: Supporta decisioni di avanzamento basate sulla valutazione del rischio fornendo metriche quantificabili dell'integrità dell'RNA (RIN ≥7,0, 260/280 compreso tra 1,7 e 2,0) per criteri di prosegui/non prosegui.
- Allineamento del biomarcatore traslazionale: Facilita la riduzione del rischio meccanicistico collegando l'espressione batterica dipendente dalle condizioni dell'ospite al potenziale invasivo.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si inserisce nel percorso di scoperta che va dalla verifica delle ipotesi nella fase iniziale della scoperta alla validazione meccanicistica nel lavoro preclinico, consentendo letture basate sull'RNA per la conferma dell'obiettivo.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi e la chiarificazione dei percorsi isolando l'RNA da batteri presenti nel cieco murino in condizioni immunitarie definite.
- Screening: Garantisce prontezza per saggi e risultati quantitativi mediante spettrofotometria e conferma della purezza e resa dell'RNA tramite bioanalizzatore.
- Analisi: Produce parametri misurabili (RIN, rapporti 260/280) che consentono a team multidisciplinari di confrontare la coerenza dell'isolamento tra diverse condizioni.
- Ricerca traslazionale: Si collega alla continuità preclinica utilizzando un modello di disseminazione indotta da neutropenia, rilevante per popolazioni di pazienti immunocompromessi.
- Riutilizzo aziendale: Presenta il protocollo come una metodica riutilizzabile per l'isolamento di RNA da matrici gastrointestinali complesse in diverse campagne di screening di patogeni.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Affidabilità predittiva nella validazione degli obiettivi, riduzione dell'ambiguità meccanicistica nella selezione dei fattori di virulenza.
- Valore operativo: Standardizzazione, riproducibilità e scalabilità tra laboratori grazie a passaggi definiti di lisi, estrazione e controllo qualità.
- Valore strategico: Decisioni più accurate su prosegui/non prosegui, efficienza del capitale e riduzione del rischio biologico in fase avanzata nei programmi anti-infettivi.
- Impatto sul portafoglio: Prioritizzazione e decisioni di avanzamento corrette per il rischio basate su dati di interazione con l'obiettivo confermati dalla qualità dell'RNA.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze in sicurezza microbiologica, manipolazione dell'RNA e tecniche di estrazione fenolo-cloroformo.
- Necessita di strumentazione come bagni di azoto liquido, vortex, centrifughe (a 4°C e a temperatura ambiente), spettrofotometri e bioanalizzatori.
- Richiede standardizzazione tra i gruppi di lavoro riguardo ai tempi di lisi, all'accuratezza nella separazione delle fasi e alla costanza del trattamento con DNasi.
- Comporta considerazioni di adattamento relative alla carica batterica variabile, alla carica fecale e alla viscosità del campione nei diversi sistemi modello.
- Include limitazioni pratiche come la durata dell'estrazione, che prevede più passaggi, e la dipendenza da una rigorosa separazione delle fasi per evitare contaminazioni.
