Name: Isolamento del RNA Pseudomonas aeruginosa Colonizzare la Murine tratto gastrointestinale (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-28T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 52 s
Description: Impara a isolare RNA di alta qualità da Pseudomonas aeruginosa colonizzante il tratto gastrointestinale murino. Questo metodo rigoroso con estrazione acido-fenolo-cloroformio è ideale per qPCR, profilazione trascrizionale e sequenziamento RNA.

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Questo lavoro è stato finanziato dal National Institutes of Health concede AI62983 (ayk), AI22535 (GPB).

1. Modello murino di P. aeruginosa GI colonizzazione e diffusione <ol><li> Topi C3H/HeN (6-8 settimane vecchio, femmina, Harlan) sono trattati con antibiotici per via orale ad esaurire flora commensale e poi mono-colonizzati da PA come descritto in precedenza 4. </li></ol> 2. La raccolta murini contenuto del cieco Luminal <ol><li> Immergere un mortaio pulito in acciaio inox in una vasca di azoto liquido. </li><li> Euthanize topi per asfissia di anidride carbonica. </li><li> Topo carcassa sicuro su una tavola di polistirolo e doccia con etanolo al 95%. Fai una incisione mediana longitudinale attraverso la pelle dallo sterno al perineo. Riflettono la pelle e peritoneo per esporre la cavità addominale. </li><li> Resecare il cieco intero. Tenere il cieco con una pinza sopra la malta in acciaio inox. Snip entrambe le estremità del cieco con le forbici dissezione. </li><li> Inserire una punta P1000 pipetta riempita con 1 ml di tampone flushate del cieco (10 mM TrisHCl, 1 mM EDTA, 200 mM NaCl) 5 nelle estremità prossimale del cieco. Svuotare il buffer del cieco flushate e del cieco contenuto luminale nel mortaio in acciaio inox. 1 ml di tampone flushate del cieco sarà sufficiente per il lavaggio di tutto il contenuto del cieco. Cecale contenuti flushate si blocca subito dopo entrare in contatto con la malta. </li><li> Macinare il contenuto flushate del cieco con un pestello sterile. </li><li> Terreno posto ghiacciato del cieco contenuto luminale in una provetta 50 ml conica in polipropilene immerso in un ghiaccio secco / etanolo bagno. </li><li> Ripetere i punti 2,2 per 2,7 per ogni mouse aggiuntivo. </li><li> Conservare a -80 ° C. </li></ol> 3. Batteriche RNA Isolation <ol><li> Caldo 1 volume (in base al volume finale di due contenuti del cieco del lume, circa 3 ml) di acido fenolo / cloroformio (5:1, v / v) contenuta in un tubo 50 ml per centrifuga Oak Ridge con il tappo fissato in parafilm in 65 ° C acqua sporca. </li><li> Fate bollire 0,5 volume di tampone di lisi (2% SDS, 16 mM EDTA, 200 mM NaCl) 6 contenuta in un tubo in polipropilene da 50 ml conica per 5 minuti. </li><li> Aggiungi tampone bollente lisi del cieco a contenuto luminale. Omogeneizzare. Fate bollire per 5 minuti con vortex periodica. </li><li> Aggiungere i 100 ° C il contenuto del cieco / campione lisi ai 65 ° C acido fenolo / cloroformio nella provetta da centrifuga Oak Ridge. Con tappo a tenuta con parafilm. </li><li> Incubare a 65 ° C per 10 minuti con vortex periodico (ogni 2 minuti). </li><li> Centrifugare campione a 2.500 g a 4 ° per 15 minuti. </li><li> Con attenzione trasferimento fase acquosa (evitando qualsiasi dell'interfaccia bianco) per un nuovo 50 ml centrifuga Oak Ridge. Il volume della fase acquosa sarà circa il 50% del volume totale dei contenuti del cieco, tampone di lisi, e acido fenolo / cloroformio. Aggiungere un volume equivalente di acido fenolo / cloroformio. </li><li> Con tappo a tenuta con parafilm e mescolare bene nel vortex ad alta velocità. </li><li> Centrifugare campione a 2.500 g a 4 ° per 15 minuti. </li><li> Ripetere i passaggi 3,7-3,9 finché non ci sarà alcuna interfaccia visibile bianco tra le fasi acquosa e organica. </li><li> Con attenzione trasferimento fase acquosa in una nuova centrifuga 50 ml Oak Ridge. Aggiungere un uguale volume di cloroformio / alcool isoamilico (24:1, v / v). </li><li> Guarnizione tappo e mescolare bene nel vortex. </li><li> Centrifugare campione a 2.500 g a 4 ° per 15 minuti. Rimuovere fase acquosa (volume sarà circa il 50% del volume totale di reazione) a 15 tubo di polipropilene ml e aggiungere un uguale volume di isopropanolo. </li><li> Incubare a -20 ° per almeno 2 ore o durante la notte. </li><li> Centrifugare campione a 2.500 g a 4 ° per 45 minuti. Un gel-like pellet si forma sul fondo della provetta. Rimuovere il surnatante. </li><li> Lavare il pellet con 1 ml di ghiacciata etanolo al 70%. Vortex. Centrifugare a campione a 10.000 g a 4 ° per 5 minuti. </li><li> Rimuovere il supernatante e invertire il tubo per far asciugare il pellet a temperatura ambiente per 10 minuti. </li><li> Risospendere il pellet di RNA in 200 ml di acqua RNase-free. </li></ol> 4. DNasi Trattamento (Turbo DNA-Free, Applied Biosystems) <ol><li> Aggiungere 20 ml di tampone 10X Turbo DNasi e 2 microlitri Turbo DNasi e mescolare delicatamente. </li><li> Incubare a 37 ° per 20 minuti. </li><li> Aggiungere 20 ml di reagente risospeso inattivazione DNasi e mescolare bene. </li><li> Incubare 5 minuti a temperatura ambiente, mescolando di tanto in tanto. </li><li> Centrifugare a 10.000 g a temperatura ambiente per 1,5 minuti e trasferire il surnatante in una provetta da microcentrifuga nuovo. </li><li> Aggiungere un volume di freddo (4 °) L'acido fenolo / cloroformio e mescolare accuratamente vortexando per 1 minuto. </li><li> Centrifugare a 12.500 g a temperatura ambiente per 2 minuti. </li><li> Trasferire la fase acquosa in una nuova provetta e aggiungere 1 volume di cloroformio / alcool isoamilico (49:1 v / v), vortice. </li><li> Centrifugare a 12.500 g a temperatura ambiente per 2 minuti. </li><li> Trasferire la fase acquosa (circa il 50% del volume totale di reazione) in una nuova provetta. </li><li> Aggiungere 0,1 volumi di acetato di sodio 3M pH 5.5 e2,5 volumi di ghiaccio freddo etanolo al 100%. Vortex. </li><li> Incubare a -20 ° per almeno 2 ore oa -80 ° per 30 minuti. </li><li> Centrifugare a 12.000 g per 30 minuti a 4 ° </li><li> Rimuovere il surnatante. </li><li> Lavare il pellet con 1 ml di ghiacciata etanolo al 70% per centrifugazione per 5 minuti a 10.000 g a 4 °. </li><li> Rimuovere il surnatante e l'aria secca per 10 minuti. </li><li> Risospendere il pellet in 100 ml di acqua RNase-free. Potrebbe essere necessario posto nel 65 ° di durezza bagno per risospendere e sciogliere il precipitato. </li><li> Per testare l'efficacia del trattamento DNasi, una RT-PCR, reazione standard per l'amplificazione di una proteina ribosomiale (o gene altro riferimento) potrebbe essere eseguito per campioni trattati e non trattati, con nessun controllo RT. </li></ol> 5. RNA sottofase di cancellazione (Qiagen, RNeasy Kit) <ol><li> Fare riferimento alle pagine 56-57 della Qiagen RNeasy Mini Handbook (4 ª edizione, aprile 2006). Seguite le indicazioni fornite. </li></ol> 6. Rappresentante Risultati La quantità di RNA batterico totale recuperati utilizzando questo protocollo è di circa 2-3 mg da due cecums. L'RNA recuperato è di quantità e qualità sufficienti per qPCR successivi, profili di trascrizione, e l'RNA esperimenti Seq. Purezza RNA è normalmente valutata misurando il rapporto 260nm/280nm 7 del campione, ma questo metodo non fornisce alcuna informazione circa l'integrità di RNA. Il Bioanalyzer Agilent è una piattaforma basata su microfluidica per il dimensionamento, la quantificazione e il controllo della qualità del DNA, RNA, proteine ​​e cellule, e utilizza una metrica integrità RNA conosciuta come numero di integrità dell'RNA (RIN) 8. RNA estratto con questo protocollo produce 260/280 rapporti che vanno dal 1,7-2,0 e valori RIN ≥ 7.0. Un esempio di analisi Agilent Bioanalyzer dell'RNA batterico recuperato da questo protocollo è illustrato nella figura 1. <img src="/files/ftp_upload/3293/3293fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Agilent Bioanalyzer elettroferogramma e gel-come immagine di Pseudomonas aeruginosa totale del campione di RNA isolati e recuperati da topo contenuti del cieco. RIN 8.0.

<ol><li>Bodey, G. P., Bolivar, R., Fainstein, V., Jadeja, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infections+caused+by+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22Rev+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Infections caused by Pseudomonas aeruginosa.</a> Rev Infect Dis. 5, 279-279 (1983).</li>
<li>Bertrand, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endemicity%2C+molecular+diversity+and+colonisation+routes+of+Pseudomonas+aeruginosa+in+intensive+care+units%5BTitle%5D)+AND+%22Intensive+Care+Med%22%5BJournal%5D)">Endemicity, molecular diversity and colonisation routes of Pseudomonas aeruginosa in intensive care units.</a> Intensive Care Med. 27, 1263-1268 (2001).</li>
<li>Koh, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Utility+of+in+vivo+transcription+profiling+for+identifying+Pseudomonas+aeruginosa+genes+needed+for+gastrointestinal+colonization+and+dissemination%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Utility of in vivo transcription profiling for identifying Pseudomonas aeruginosa genes needed for gastrointestinal colonization and dissemination.</a> PLoS One. 5, e15131-e15131 (2010).</li>
<li>Koh, A. Y., Priebe, G. P., Pier, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virulence+of+Pseudomonas+aeruginosa+in+a+murine+model+of+gastrointestinal+colonization+and+dissemination+in+neutropenia%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Virulence of Pseudomonas aeruginosa in a murine model of gastrointestinal colonization and dissemination in neutropenia.</a> Infect Immun. 73, 2262-2272 (2005).</li>
<li>Alexander, R. J., Raicht, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+total+RNA+from+human+stool+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Dig+Dis+Sci%22%5BJournal%5D)">Purification of total RNA from human stool samples.</a> Dig Dis Sci. 43, 2652-2658 (1998).</li>
<li>Fitzsimons, N. A., Akkermans, A. D., de Vos, W. M., Vaughan, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+gene+expression+detected+in+human+faeces+by+reverse+transcription-PCR%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microbiol+Methods%22%5BJournal%5D)">Bacterial gene expression detected in human faeces by reverse transcription-PCR.</a> J Microbiol Methods. 55, 133-140 (2003).</li>
<li>Manchester, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+UV+methods+for+measurement+of+protein+and+nucleic+acid+concentrations%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Use of UV methods for measurement of protein and nucleic acid concentrations.</a> Biotechniques. 20, 968-970 (1996).</li>
<li>Schroeder, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RIN%3A+an+RNA+integrity+number+for+assigning+integrity+values+to+RNA+measurements%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">The RIN: an RNA integrity number for assigning integrity values to RNA measurements.</a> BMC Mol Biol. 7, 3-3 (2006).</li>
<li>Turnbaugh, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+core+gut+microbiome+in+obese+and+lean+twins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A core gut microbiome in obese and lean twins.</a> Nature. 457, 480-484 (2009).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Il metodo di estrazione di RNA qui descritto consente il recupero di una quantità sufficiente di alta qualità RNA totale Pseudomonas aeruginosa raccolte dal tratto GI murino. Questo metodo non si limita a P. aeruginosa e possono potenzialmente essere applicato ad altri batteri. Il recupero di organismi microbici sufficiente da parte dell&#39;intestino varia significativamente da un organismo all&#39;altro. Nel nostro modello murino, P. aeruginosa tipicamente colonizza il tratto gastrointestinale murino a livelli tra 5 x 10 7 a 5 x 10 8 CFU / g feci 4. Dal momento che il contenuto recuperato del cieco sono circa 0,5 grammi, il numero stimato di P. aeruginosa recuperato da due cecums è compresa tra 5 x 10 7 a 5 x 10 8 cfu. Se altri microrganismi vengono utilizzati, sarebbe prudente per verificare i livelli di colonizzazione GI e quindi calcolare il numero di cecums necessari per recuperare il numero mirato di cfu. E &#39;anche importante notare che quando si utilizza questo particolare modello murino, topi trattati con antibiotico non infettati con PA non quantificabile quantità di RNA isolati dal loro contenuto cecale. Il nostro modello murino di colonizzazione Pseudomonas aeruginosa gastrointestinale e tentativi di diffusione di emulare la patogenesi di P. aeruginosa batteriemia nel cancro e pazienti sottoposti a trapianto di cellule staminali. In questa popolazione di pazienti, la flora commensale è spesso impoverito secondaria al trattamento con antibiotici o chemioterapici (ad esempio l&#39;esaurimento antibiotico di GI flora commensale) con conseguente proliferazione di microbi patogeni (ad esempio mono-associazione con P. aeruginosa) e successiva diffusione, dopo la soppressione immunitaria. I vantaggi ei limiti di questo modello murino sono già stati affrontati in precedenza 4. Lo scopo di questo studio è di fornire una metodologia per isolare microbica RNA totale dal tratto GI. Questo protocollo può essere facilmente adattato ad altri modelli murini che lo studio di altri aspetti della patogenesi microbica nel tratto gastrointestinale (per esempio la flora commensale interazioni, effetti batterica sulle malattie infiammatorie intestinali, ecc.) Un vantaggio di questo metodo è l&#39;incorporazione di passi lisi multiple compreso gelo / disgelo, distruzione meccanica (polverizzando con malta / pestello, omogeneizzazione), bollitura, e lisi chimica (per esempio, SDS). Nonostante la moltitudine di passi lisi, alcuni microrganismi (in particolare batteri Gram-positivi e funghi / lievito) possono richiedere ulteriori rottura meccanica. Dopo il caldo lisi / acido fenolo-cloroformio incubazione (Step 3.5), l&#39;aggiunta di perline (0,1 mm per i batteri e / o di 0,5-0,7 mm per lievito) e una successiva perline battendo passo dovrebbe essere sufficiente per lisare questi organismi 9, 10. Data la natura complessa del materiale recuperato dal topo cieco, le ripetute freddo estrazioni acid-phenol/chloroform (Passo 3,7-3,9) sono assolutamente necessari per ottenere qualità accettabile RNA e l&#39;integrità per ulteriori reazioni a valle. Tra i 3-5 freddo estrazioni acid-phenol/chloroform può essere richiesto prima che l&#39;interfaccia bianca tra le fasi acquosa e organica è eliminata. Infine, la combinazione di entrambi i trattamenti DNasi (punto 4) e il protocollo di pulizia RNeasy (Fase 5) sono essenziali per la rimozione del DNA contaminante e piccoli non-mRNA (5s e tRNA). Come affermato in precedenza, l&#39;RNA recuperato utilizzando questo protocollo è di quantità e qualità sufficienti per il profiling di trascrizione successivi 3, qPCR (inedito), e RNA Seq (inedito) esperimenti.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome del reagente </th><th> Azienda </th><th> Numero di catalogo </th></tr><tr><td> Mortaio e pestello </td><td> Pescatore </td><td> 12-947-1 </td></tr><tr><td> Omogeneizzatore </td><td> Omni </td><td> TM-125 </td></tr><tr><td> Oak Ridge provette (50 ml) </td><td> Nalgene </td><td> 3119-0050 </td></tr><tr><td> Acido fenolo / cloroformio </td><td> Ambion </td><td> AM9720 </td></tr><tr><td> Cloroformio </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C2432 </td></tr><tr><td> L&#39;alcol isoamilico </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> W205702 </td></tr><tr><td> Isopropanolo </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 190764 </td></tr><tr><td> Dietil pirocarbonato (DEPC) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 40718 </td></tr><tr><td> DNasi </td><td> Ambion </td><td> AM2238 </td></tr><tr><td> RNeasy Kit </td><td> Qiagen </td><td> 74104 </td></tr><tr><td> 3M sodio acetato </td><td> Ambion </td><td> AM9740 </td></tr><tr><td> 100% di etanolo </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> E7023 </td></tr></tbody></table>

isolamento del rna pseudomonas aeruginosa colonizzare la murine tratto gastrointestinale

RNA Isolation of Pseudomonas aeruginosa Colonizing the Murine Gastrointestinal Tract

Pseudomonas aeruginosa (PA) causa infezioni in significativa morbidità e mortalità in host con sistema immunitario compromesso, come i pazienti affetti da leucemia, gravi ustioni, o trapianti di organi 1. Nei pazienti ad alto rischio di sviluppare infezioni del sangue PA, il tratto gastrointestinale (GI) è il principale serbatoio per la colonizzazione 2, ma i meccanismi con cui transizioni PA da un microbo ad una colonizzazione asintomatica invasiva, e spesso mortale, patogeno non sono chiare. In precedenza, abbiamo effettuato esperimenti in vivo profilazione trascrizione mRNA PA attraverso il recupero di cellule batteriche residenti nel cecums di topi colonizzati 3, per identificare i cambiamenti nell&#39;espressione genica batterica durante alterazioni dello stato immunitario dell&#39;ospite. Come con qualsiasi esperimento profilazione trascrizione, il fattore limitante è l&#39;isolamento di una sufficiente quantità di mRNA di alta qualità. Data l&#39;abbondanza di enzimi, detriti, residui di cibo, e particolato nel tratto gastrointestinale, la sfida di isolamento dell&#39;RNA è scoraggiante. Qui, vi presentiamo un metodo per l&#39;isolamento affidabile e riproducibile di RNA batterico recuperato dal tratto GI murino. Questo metodo utilizza un consolidato modello murino di colonizzazione PA GI e neutropenia indotta dalla diffusione 4. Colonizzazione volta GI con PA è confermata, i topi sono contenuti eutanasia e del cieco vengono recuperati e flash congelati. L&#39;RNA viene poi estratta usando una combinazione di distruzione meccanica, bollitura, fenolo / cloroformio estrazioni, trattamento DNase, e cromatografia di affinità. Quantità e la purezza sono confermati da spettrofotometria (Tecnologie NanoDrop) e Bioanalyzer (Agilent Technologies) (Fig. 1). Questo metodo di isolamento microbico GI RNA può essere facilmente adattato ad altri batteri e funghi, come pure.

Un metodo affidabile per l&#39;isolamento di RNA<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; Recuperato da cecums murino è descritto. L&#39;RNA recuperato è di quantità e qualità sufficienti per qPCR successivi, profili di trascrizione, e l&#39;RNA esperimenti Seq. Questa tecnica può essere adattata per l&#39;isolamento di RNA di altri microbi intestinali.

Isolamento del RNA Pseudomonas aeruginosa Colonizzare la Murine tratto gastrointestinale

Le infezioni da Pseudomonas aeruginosa (PA) causano una significativa morbilità e mortalità negli ospiti con sistemi immunitari compromessi, come i pazienti con ...

L'obiettivo generale di questa procedura è isolare l'RNA totale di Pseudomonas aerogen recuperato da ECM murini. Questo viene ottenuto innanzitutto raccogliendo il contenuto luminale del sequel. Successivamente, l'RNA batterico viene isolato.Quindi vengono effettuati il trattamento con D'S e la purificazione dell'RNA. Infine, l'RNA viene quantificato e la purezza dell'isolato viene verificata mediante analisi con bioanalizzatore e analisi spettrofotometrica. In definitiva, è possibile ottenere RNA batterico di qualità e quantità sufficienti per successive valutazioni sperimentali, come ad esempio tramite QPCR, analisi del profilo di trascrizione o esperimenti di sequenziamento dell'RNA.Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come l'estrazione con triolo, è che questo metodo prevede diversi passaggi di lisi in condizioni di estrazione estremamente rigorose con acido e cloroformio femminile, al fine di garantire un'RNA di alta qualità. Una dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale, poiché i passaggi di lisi ed estrazione sono difficili da apprendere, in quanto i protocolli scritti omettono dettagli minimi ma essenziali per il successo. La procedura sarà dimostrata da Eduardo Lopez Medina, ricercatore postdottorato, e da Megan Neubauer, responsabile del laboratorio, entrambi del mio laboratorio. Prima di iniziare il prelievo, IMSA pulisce il mortaio in acciaio inox in un bagno di azoto liquido.Quindi, dopo l'eutanasia di un topo C3 HHEN colonizzato da pseudomonas aerogen, di età compresa tra sei e otto settimane, posizionare l'animale in posizione supina su una tavola di polistirolo ed esporre l'addome all'etanolo al 95%. Successivamente, praticare un'incisione longitudinale mediana attraverso la cute, dallo sterno fino al perineo. Poi allontanare la cute e il peritoneo ed esporre la cavità addominale.Ora resecare l'intero cieco utilizzando pinze. Tenere il cieco sopra il mortaio in acciaio inossidabile e tagliare entrambe le estremità del cieco con forbici da dissezione. Riempire una punta di pipetta P 1000 con un millilitro di buffer di lavaggio finale otto, quindi inserire la punta nell'estremità prossimale del cieco.Svuotare il tampone di lavaggio sequel e il contenuto luminale di sequel nel mortaio di acciaio inossidabile. A questo punto, macinare il sequel. Lavare il contenuto di eight con un pestello sterile.Quindi versare etanolo in un contenitore di ghiaccio secco e inserire un tubo conico in polipropilene da 50 millilitri nel bagno di etanolo e ghiaccio secco. Trasferire il contenuto del lume congelato e macinato nel tubo conico e conservare il tubo a meno 80 gradi Celsius. Questa serie di passaggi rappresenta la parte più delicata della procedura.Data la natura complessa dei materiali prelevati dal cieco MI, sono assolutamente necessarie ripetute estrazioni a freddo con filoforme; potrebbero essere richieste da tre a cinque estrazioni prima che scompaia l'ampia interfaccia tra le fasi acquose e organiche. Trasferire un volume di fenolo acido cloroformio in un tubo da centrifuga Oak Ridge da 50 millilitri. Chiudere saldamente il tappo con del parafilm e quindi riscaldare il tubo in un bagno d'acqua a 65 gradi Celsius.Aggiungere metà volume di buffer di lisi in un tubo conico in polipropilene da 50 millilitri, quindi far bollire il buffer per cinque minuti. Dopo aver prelevato il contenuto del lume SQL dallo stoccaggio a meno 80 gradi Celsius, riscaldare brevemente il tubo con un rapido sfregamento tra le mani e quindi aggiungere il buffer di lisi bollente al tubo. Agitare la miscela per omogeneizzare la soluzione del contenuto lume SQL con il buffer di lisi.Fare bollire il buffer di lisi e il contenuto luminali di SQL per cinque minuti. Con vorticosazione periodica, aprire il tubo da centrifuga Oak Ridge contenente la soluzione di fenolo-cloroformo e trasferire il campione di lisi del contenuto di SQL nel tubo. Quindi richiudere il tappo con perfil e rimettere il tubo nel bagnomaria a 65 gradi Celsius per 10 minuti, agitando il tubo ogni due minuti.Centrifugare il campione a 2.500 ×g per 15 minuti a quattro gradi Celsius. Trasferire con attenzione la fase acquosa in un nuovo tubo da centrifuga Oak Ridge da 50 millilitri, evitando qualsiasi traccia dell'interfaccia bianca. Quindi aggiungere un volume uguale di fenolo acido cloroformio al nuovo tubo.Sigillare il tappo con del perfil e mescolare accuratamente il contenuto agitando il tubo al massimo regime di vortice. Continuare a centrifugare il campione e trasferire la fase acquosa nel tubo da centrifuga. Se il volume della fase acquosa superiore diventa troppo ridotto, può essere trasferito in un tubo di diametro più piccolo.Continuare questo processo fino a quando non sarà più visibile un'interfaccia bianca tra la fase acquosa e quella organica. Quando l'interfaccia bianca è scomparsa, trasferire con attenzione la fase acquosa in una nuova provetta da centrifuga. Quindi aggiungere un volume uguale di cloroformio e alcol isoamilico nella provetta, sigillare il coperchio e mescolare accuratamente il contenuto mediante vortex.Successivamente, dopo aver centrifugato nuovamente il campione, trasferire la fase acquosa in un tubo conico in polipropilene da 15 millilitri e aggiungere un volume uguale di isopropanolo. Quindi, incubare la soluzione a meno 20 gradi Celsius per almeno due ore o tutta la notte. Dopo l'incubazione del campione, centrifugare il tubo per 45 minuti.Dopo aver identificato il pellet di consistenza gelatinosa sul fondo del tubo, rimuovere il soprannatante. Lavare ora il pellet con un millilitro di etanolo al 70% freddo di ghiaccio, agitando il tubo al vortex, quindi centrifugare il campione a 10.000 ×g per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Infine, rimuovere il soprannatante e capovolgere il tubo per far asciugare il pellet all'aria a temperatura ambiente per 10 minuti.Quindi risospendere il pellet di RNA in 200 microlitri di acqua priva di RNAasi. Aggiungere prima 20 microlitri di tampone DNA 10x turbo e 2 microlitri di turbo DNAasi nel tubo microcentrifuga e mescolare delicatamente la soluzione. Incubare quindi il tubo a 37 gradi Celsius per 20 minuti, quindi aggiungere 20 microlitri di reagente di inattivazione del DNA risospeso nel tubo e mescolare accuratamente.Incubare ora il tubo per altri cinque minuti a temperatura ambiente, mescolando occasionalmente. Successivamente, centrifugare il pellet in una microcentrifuga a 10.000 ×g per 1,5 minuti, quindi trasferire il soprannatante in un nuovo tubo microcentrifuga. Aggiungere un volume di fenolo acido cloroformio freddo al pellet, quindi mescolare accuratamente la soluzione mediante vortex per un minuto.Dopo aver centrifugato la soluzione per due minuti a 12.500 ×g, trasferire la fase acquosa in un nuovo tubo e aggiungere un volume di cloroformo alcol isoamilo. Quindi mescolare la soluzione mediante vortex, quindi centrifugare nuovamente la soluzione nelle stesse condizioni. Trasferire la fase acquosa in un nuovo microtubo.Quindi aggiungere 0,1 volumi di acetato di sodio tre molare ed 2,5 volumi di etanolo al 100% freddo di ghiaccio. Vortexare il tubo per mescolare. Incubare il campione a meno 80 gradi Celsius per 30 minuti.Quindi, dopo aver centrifugato a 12.000 ×g per 30 minuti a quattro gradi Celsius, rimuovere il soprannatante. Infine, lavare il pellet con un millilitro di etanolo al 70% freddo di ghiaccio. Rimuovere il soprannatante e lasciare asciugare il pellet all'aria per 10 minuti.Sospendere quindi il pellet in 100 microlitri di acqua priva di RNA. L'Agilent Bioanalyzer è una piattaforma basata sulla microfluidica per la determinazione della dimensione, della quantificazione e del controllo di qualità di DNA, RNA, proteine e cellule, e utilizza un parametro di integrità dell'RNA noto come numero di integrità dell'RNA o RIN. L'RNA estratto con questo protocollo presenta rapporti 260/280 compresi tra 1,7 e 2,0 e valori di RIN maggiori o uguali a 7,0.Un esempio di elettroferogramma dell'RNA batterico ottenuto con un bioanalizzatore Agilent è mostrato qui a sinistra, mentre un'immagine simile a quella di un gel di *Pseudomonas arosa* recuperata dal contenuto intestinale di topi è mostrata qui a destra. A seguito di questa procedura, altri metodi come la PCR quantitativa o il sequenziamento dell'RNA possono essere eseguiti per rispondere ad ulteriori domande, come un profilo più dettagliato dell'espressione genica.

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Immunologia e Infezioni

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Fonte: Taylor, M. N., et.al. Utilizzo dei dati di un singolo verme per quantificare l'eterogeneità nelle interazioni Caenorhabditis elegans-batterio. J. Vis. Exp. (2022)Questo video dimostra l'esposizione di vermi Caenorhabditis elegans privi di germi e di età corrispondente a un ceppo batterico per la colonizzazione intestinale. Spiega la rimozione selettiva dei batteri esterni e non aderenti, lasciando solo i batteri vitali aderiti all'epitelio intestinale per la quantificazione.

Valutazione della colonizzazione batterica intestinale in C. elegionsprivi di germi

Viene descritta la colonizzazione del nasofaringe murino con streptococco pneumoniae e la successiva estrazione di cellule aderenti o reclutate. Questa tecnica prevede il lavaggio del nasofaringe e la raccolta del fluido attraverso i nares ed è adattabile per varie letture, tra cui la quantificazione differenziale delle cellule e l'analisi dell'espressione dell'mRNA in situ.

Caratterizzazione delle risposte infiammatorie durante la colonizzazione intranasale con streptococco pneumoniae

Il wormsorter facilita schermi genetiche in Caenorhabditis elegans di classificare vermi secondo l'espressione di giornalisti fluorescenti. Qui, descriviamo un nuovo utilizzo: ordinamento secondo la colonizzazione da un agente patogeno-GFP che esprimono, e ci avvaliamo di esaminare il ruolo poco compreso del riconoscimento patogeno in avvio risposte immunitarie.

Separazione automatica di<em&gt; C. elegans</em&gt; Variabilmente Colonizzato da un batterio patogeno

Qui, una procedura è descritta per la creazione di infezione sistemica nel ratto neonatale con colture di Escherichia coli K1. Questa procedura non invasiva consente colonizzazione del tratto gastrointestinale, traslocazione del patogeno alla circolazione sistemica, e l'invasione del sistema nervoso centrale al plesso coroide.

Non invasiva Modello di neuropatogeno Escherichia coli L'infezione neonatale nel ratto

Qui, descriviamo un protocollo semplice e riproducibile del modello murino di infezione per valutare l'attenuazione dei ceppi geneticamente modificati di Pseudomonas aeruginosa rispetto alla Escherichia coli approvata dalla FDA (Food and Drug Administration) degli Stati Uniti per applicazioni commerciali.

Generazione di mutanti di eliminazione genica in-frame in Pseudomonas aeruginosa e test per l'attenuazione della virulenza in un semplice modello di infezione del mouse

Viene dimostrato un modello murino di inoculazione transuretrale uropatogena di E. coli (UPEC) per stabilire serbatoi latenti della vescica intracellulare e la successiva esposizione della vescica a G. vaginalis per indurre UPEC UTI ricorrente. Sono inoltre dimostrati l'enumerazione dei batteri, la citologia delle urine e la fissazione e l'elaborazione della vescica in situ per la microscopia elettronica a scansione.

Infezione ricorrente del tratto urinario da Escherichia coli innescata dall'esposizione alla vescica di Gardnerella vaginalis nei topi

Il protocollo presenta un modello murino di colonizzazione vaginale con batteri vaginali umani coltivati anaerobicamente. Ci concentriamo su Gardnerella vaginalis, includendo suggerimenti per Prevotella bivia e Fusobacterium nucleatum. Questo protocollo può anche essere utilizzato come guida per le inoculazioni vaginali e il recupero vitale di altri batteri cresciuti anaerobicamente.

Modelli di colonizzazione vaginale murina da parte di batteri cresciuti anaerobicamente

Caenorhabditis elegans è una delle principali specie modello in biologia, ma quasi tutte le ricerche vengono eseguite in assenza dei suoi microbi naturalmente associati. I metodi qui descritti aiuteranno a migliorare la nostra comprensione della diversità dei microbi associati come base per la futura ricerca funzionale di C. elegans.

Isolamento e caratterizzazione del microbiota naturale del nematode modello Caenorhabditis elegans

Questo protocollo descrive i passaggi necessari per la colonizzazione di topi con pks+ Escherichia coli in condizioni non infiammatorie, nonché metodi non invasivi per la validazione della colonizzazione e la valutazione dell'espansione di pks+ E. coli nelle feci.

Colonizzazione con Escherichia coli di Murine pks+ in condizioni non infiammatorie

Impara a isolare RNA di alta qualità da Pseudomonas aeruginosa colonizzante il tratto gastrointestinale murino. Questo metodo rigoroso con estrazione acido-fenolo-cloroformio è ideale per qPCR, profilazione trascrizionale e sequenziamento RNA.

Isolamento del RNA Pseudomonas aeruginosa Colonizzare la Murine tratto gastrointestinale

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