Monitoraggio Crawling neutrofili intraluminale, migrazione e chemiotassi transendoteliale in tessuto al microscopio video intravitale

L'obiettivo generale di questo protocollo è utilizzare la microscopia in campo chiaro, la microscopia intravitale e la fotografia video con lapse di tempo per studiare le interazioni dinamiche tra neutrofili e cellule endoteliali durante il reclutamento dei neutrofili in risposta a un chemiotattico per neutrofili in vivo. In questo video, dimostriamo le procedure necessarie per utilizzare la microscopia video intravitale in campo chiaro al fine di visualizzare e determinare il movimento intraluminale dei neutrofili, la migrazione transendoteliale e la chemotassi nel tessuto muscolare cremasterico del topo. Il reclutamento dei leucociti rappresenta la caratteristica distintiva dell'infiammazione.

Questo processo di reclutamento inizia quando i leucociti nel flusso sanguigno cominciano a rotolare sull'endotelio dei venule post-capillari nel sito di infiammazione. In risposta a chemochine o altri chemiottattici presenti sulla superficie endoteliale, questi leucociti in rotolamento si arrestano e aderiscono saldamente all'endotelio. Dopo l'adesione, molti leucociti si muovono strisciando sulla superficie luminale e sembrano cercare un sito ottimale per la trasmissionrazione.

Dopo che i leucociti striscianti attraversano l'endotelio, un processo definito migrazione transendoteliale, i neutrofili migrano nel tessuto extravascolare dirigendosi verso la sorgente del chemiotattico presente nel sito infiammatorio, un processo chiamato chemotassi. Questo video mostra l'esperimento su come utilizzare la videografia intravitale a campo chiaro, la microscopia con riprese a intervalli di tempo e ImageJ per visualizzare, tracciare e determinare lo strisciamento intraluminale dei neutrofili, la migrazione transendoteliale e la migrazione mediante chemotassi nel tessuto muscolare dell'Oma, nonché la risposta alla sorgente di un chemiotattico per neutrofili.

Ciao, sono Lis Liu del Dipartimento di Farmacologia della Facoltà di Medicina dell'Università della Saskatchewan. Oggi vi mostreremo come preparare il chemotratto neutrofilo in gel agarosio e come preparare il muscolo retra muscolare del topo per la microscopia intravitale.

Come tracciare il movimento cellulare utilizzando MEGJ. E infine, come analizzare i parametri del reclutamento dei neutrofili, due studenti laureati del nostro laboratorio, ngel Naja, sh, e Chile vi mostreranno le procedure sperimentali dettagliate. Ciao, sono Naja Sh. Ciao, sono Chile.

Per iniziare questo esperimento, preparare l'attrattante chimico per i neutrofili in un primo pipetta gel agarosio, 10 millilitri di PBS due volte e un tubo conico da 50 millilitri. Riscaldare il tubo ponendolo in un becher contenente acqua calda. Pipettare 10 millilitri di acqua distillata.

Aggiungere 0,4 grammi di polvere di agarosio in un altro tubo conico da 50 millilitri. Riscaldare la miscela fino a ebollizione in un forno a microonde per ottenere un 2% di agarosio in PBS. Aggiungere la soluzione di PBS riscaldata al doppio della concentrazione al tubo contenente la soluzione di agarosio.

Ruotare delicatamente la soluzione mista e mantenerla calda nel becher con acqua calda. Mescolare accuratamente la soluzione di chemioattrattante con tre microlitri di inchiostro India nel coperchio di una provetta da 1,5 millilitri. Evitare di formare bolle d'aria durante il mescolamento.

Tagliare l'estremità di una punta da pipetta da 200 microlitri e pipettare 110 microlitri di soluzione agro a 42 gradi Celsius nel coperchio, mescolando immediatamente e accuratamente. Utilizzando un'altra punta da pipetta, conservare questo gel contenente il chemiottrattante in frigorifero fino al momento dell'uso. Anestetizzare un topo maschio adulto mediante iniezione intraperitoneale di una miscela di xilazina e chetamina.

Rasi con cura l'area sovrastante la giugulare esterna destra e la faccia anteriore dello scroto usando cloridrato. Con un rasoio elettrico dopo l'anestesia, è fondamentale prestare particolare attenzione e cura al topo anestetizzato. Si può utilizzare una lampada a calore per evitare che il topo vada in ipotermia.

Il topo non deve presentare il riflesso del dolore. Eseguire un'incisione orizzontale, individuare e cateterizzare la vena giugulare utilizzando un tubo PE 10 riempito con soluzione salina eparinizzata da 100 unità per millilitro. Collegare la piastra a un circolatore d'acqua a 37 gradi Celsius per mantenere caldi il muscolo cremaster e il resto del corpo.

Fissare le zampe posteriori del topo con nastri ombelicali, posizionando l'animale in modo che la superficie più estesa sia rivolta verso l'alto sulla piastra del muscolo cremasterico. Praticare un'incisione nella cute scrotale per esporre il muscolo cremasterico sinistro. Dissezionare con attenzione il muscolo dalla fascia associata.

Superfondere il muscolo cremasterico con soluzione salina tamponata al bicarbonato riscaldata a 37 gradi Celsius. Fissare un punto di sutura 4.0 all'estremità distale del muscolo cremasterico per mantenerlo premuto sulla piattaforma di vetro trasparente del supporto per muscolo cremasterico. Cauterizzare longitudinalmente il muscolo cremasterico mediante elettrocauterizzazione con un filo da 4.0.

Tenere il muscolo piatto e fissarlo lungo i bordi sulla base. Separare il testicolo e l'epididimo dal muscolo sottostante e spostarli nella cavità addominale. Aggiungere uno strato sottile di grasso da vuoto ai bordi opposti di un vetrino di 22 per 22 millimetri.

Quindi coprire il muscolo esposto con il vetrino di copertura in vetro. Posizionare la piastra muscolare principale sul palco del microscopio. Esaminare il muscolo al microscopio e individuare un capillare postcapillare adatto.

Selezionare il vaso con una velocità di taglio normale e un diametro compreso tra 25 e 40 micrometri. Regolare la videocamera in modo che il vaso sia visualizzato in posizione verticale su uno dei due lati, destro o sinistro, del monitor televisivo. Dopo 30 minuti, registrare le immagini video del vaso postcapillare selezionato come dati di controllo di base utilizzando un dispositivo di registrazione video, come un registratore DVD.

Queste sono le immagini video di controllo di base del venule postcapillare. Prima di posizionare il gel contenente il chemiotattico sulla superficie del muscolo cremaster, arrestare la superfusione e rimuovere il vetrino di copertura dal muscolo. Prelevare, dal coperchio del tubo Eppendorf, un gel contenente chemiotattico delle dimensioni di un millimetro cubo. Utilizzando l'estremità tagliata di una punta da pipetta da 200 microlitri, posizionare il gel contenente chemiotattico, precedentemente prelevato, sulla superficie del muscolo cremaster in un'area preselezionata, a 350 micrometri dal venule postcapillare osservato.

Aggiungere un coprioggetto per mantenere il gel in posizione e sovrafondere lentamente il tessuto muscolare a un ritmo molto lento, inferiore o uguale a 10 microlitri al minuto, in modo da permettere la formazione di un gradiente di chemiotattante che viene rilasciato e generato gradualmente dal gel. Registrare l'immagine video per 90 minuti dopo l'aggiunta del gel contenente il chemiotattante. Durante la registrazione, regolare e mantenere la messa a fuoco del microscopio sui leucociti aderenti, in migrazione, transmigranti e chemiotattici all'interno del vaso e del tessuto muscolare.

Dopo l'esperimento, importare il file video su un computer. Per l'analisi su computer, estrarre e convertire il video in formato VI. Ad esempio, utilizzare un software gratuito per computer come un bit ripper per convertire un video da DVD in un file A VI.

Utilizzare un software di editing video, ad esempio Windows Movie Maker, per creare un filmato in time-lapse a partire dal video originale in tempo reale, convertire e salvare il filmato in time-lapse in formato DV AVI. Registrare le immagini del micrometro di calibrazione con lo stesso settaggio del microscopio. Importare le immagini sul computer.

Aprire le immagini con ImageJ. Misurare le dimensioni dello schermo lungo entrambi gli assi X e Y e calcolare il numero di pixel per micrometro. Per importare il filmato, aprire ImageJ. Nuovamente, fare clic su File, quindi Importa utilizzando il plugin per filmati QuickTime, selezionare il filmato da analizzare e fare clic su OK nell'interfaccia del lettore QT. Fare clic su Plugin. Tracciamento manuale per tracciare le cellule: compilare le informazioni pertinenti nei campi nella parte inferiore dello schermo prima di iniziare il tracciamento. I seguenti parametri devono essere determinati prima del tracciamento temporale.

L'intervallo in secondi corrisponde all'intervallo di tempo totale diviso per 30; la calibrazione xy è la misura in micrometri per pixel ottenuta dalla calibrazione dell'immagine del micrometro; la calibrazione z è impostata a zero; la dimensione del quadrato di ricerca per il centraggio è pari a uno. È necessario selezionare nel video registrato un punto stabile e ben definito come punto di riferimento. Questo punto di riferimento può essere qualsiasi piccolo dettaglio strutturale nitido che rimanga invariato e stabile per tutta la durata dell'esperimento.

Fare clic su "aggiungi traccia" per tracciare il punto di riferimento dal primo all'ultimo fotogramma. Quindi fare clic e tracciare una per una le neutrofili che strisciano e migrano. Fare clic su "aggiungi traccia" per tracciare la cellula dalla sua comparsa nel tessuto alla sua scomparsa in ciascun fotogramma.

Quindi fare clic e tracciare per completare e salvare i risultati in Microsoft Excel. Aprire il file dei risultati in Microsoft Excel. Iniziare ad analizzare i dati.

È importante considerare i movimenti del punto di riferimento nell'analisi. Durante il tracciamento dei neutrofili e della migrazione endoluminale, determiniamo la distanza di migrazione dei neutrofili e la velocità di migrazione. Nell'analisi della migrazione transendotheliale dei neutrofili, misuriamo il tempo di trasemigrione dei neutrofili e il tempo di distacco.

Quando si determina la chemiotassi dei neutrofili nel tessuto muscolare, misuriamo la distanza e la velocità della migrazione dei neutrofili e della chemiotassi nel muscolo, e stabiliamo anche l'indice di chemiotassi durante la chemiotassi dei neutrofili nel tessuto muscolare. Le definizioni di questi parametri mostrati sullo schermo sono fornite in dettaglio nel nostro protocollo scritto. In questo esperimento, illustriamo le procedure per utilizzare la microscopia intravitale a campo chiaro al fine di visualizzare e determinare lo strisciamento intraluminale dei neutrofili, la migrazione attraverso l'endotelio e la migrazione in chemiotassi.

In risposta al chemiotattico per i neutrofili in vivo, abbiamo utilizzato sia MIP-2 (CXCL2) sia il peptide sintetico W-K-Y-M-V-M, preparato in un gel di agarosio, per indurre il reclutamento dei neutrofili nel tessuto muscolare CMA del topo. Come possiamo osservare da questa figura, MIP-2 a 0,5 µM e W-K-Y-M-V-M a 0,1 mM hanno indotto la migrazione intraluminale dei neutrofili con velocità simili. La migrazione transendoteliale dei neutrofili e il distacco dal venulo sono risultati comparabili per durata.

Questi due chemiotattici inducono anche il movimento e la chemiotassi dei neutrofili nel tessuto muscolare con velocità quasi identica e con indici di chemiotassi neutrofila simili. La microscopia intravitale è uno strumento prezioso per l'osservazione diretta del processo di reclutamento dei neutrofili e per la determinazione quantitativa delle funzioni di cellule e molecole in ciascun passaggio del reclutamento. Mediante l'uso della fotografia video in time-lapse e del software ImageJ, la migrazione intraluminale, l'attraversamento endoteliale e la migrazione nei tessuti dei leucociti in condizioni di chemiotassi possono essere misurati in campo chiaro mediante microscopia intravitale, utilizzando inibitori selettivi, topi transgenici e chemiotattici selettivi.

Il sistema di saggio può aiutarci a svelare le funzioni di proteine specifiche nel reclutamento dei leucociti.