Name: Cella singola Profiling trascrizionale dei cardiomiociti adulti mouse (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-12-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 23 s
Description: Impara l'isolamento di cardiomiociti adulti di topo e l'analisi dell'espressione genica a singola cellula mediante qPCR e microarray. Questo metodo consente di studiare la variabilità cellulare con dati di alta qualità.

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Gli autori desiderano ringraziare per l&#39;assistenza tecnica di C. Zambataro durante le riprese di questo protocollo. Noi riconosciamo con gratitudine il sostegno della Fondazione Glenn for Medical Research (SM), La fondazione Hillblom, e il National Institutes of Health per un premio Centro Shock Nathan (P30AG025708) e PO1AG025901. JMF è stato sostenuto da T32AG000266 assegnato al Buck Institute for Research on Aging.

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<li>Elowitz, M., Levine, A., Siggia, E., Swain, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stochastic+gene+expression+in+a+single+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Stochastic gene expression in a single cell.</a> Science. 297 (5584), 1183-1186 (2002).</li>
</ol>

<p class="jove_content"&gt; Accesso libero e la produzione di questo di questo articolo è sponsorizzato Sigma-Aldrich.</p

Questo metodo ha la possibilità di generare cardiomiociti per una serie di funzionali e studi di espressione genica. L&#39;esame di singole cellule è una zona fiorente in analisi di espressione genica. Il vantaggio di esaminare i livelli di trascrizione a livello della singola cellula è che permette l&#39;esame di una popolazione di cellule pure, che non è possibile dal preparazioni tessuto intero. Inoltre, l&#39;analisi singola cella consente per l&#39;esame di variazione stocastica dei livelli di mRNA nelle cellule individuali per definire popolazioni di cellule che in precedenza erano ritenuti omogenei 8,9. Oltre a identificare i geni che sono potenzialmente stocastici nella loro espressione genica 10,11,12, il metodo consente anche per l&#39;identificazione delle popolazioni cellulari rari definito dai profili gene loro espressione. Mentre questo metodo fornisce una serie di entusiasmanti possibilità di utilizzo in analisi di espressione genica, ci sono somavvertimenti e considerazioni e nell&#39;uso di singole cellule. Il limite principale ad analisi singola cella, è la raccolta di cellule sufficiente per l&#39;esperimento di raggiungere una significatività statistica per quanto riguarda la metrica di interesse, per esempio varianza. Nei casi in cui il numero di cellule isolate dal tessuto di interessi non è una limitazione, si può esaminare centinaia di cellule per gruppo, utilizzando approcci come sequenziamento di prossima generazione, o array nanofluidic. Tuttavia, in alcuni casi, ci possono essere difficoltà a ottenere cellule sufficienti dal tessuto di interesse. Questo può in parte essere causato da procedure momento idiosincratico intensivo per la raccolta del tipo di cellula bersaglio. Tuttavia, un&#39;attenta pianificazione e la preparazione prima di procedere con la raccolta singola cellula può ancora consentire una rigorosa analisi singola cellula con limitato errore tecnico. Quando l&#39;esame dei risultati deve essere considerato, che anche se questa procedura per le celle di isolamento è stato utilizzato in numerose Studies (tra cui microscopia, elettrofisiologia, ecc), lo stesso isolamento potrebbe potenzialmente effetto di espressione genica. Come per qualsiasi metodo che manipola i campioni biologici, i risultati delle indagini svolte deve essere attentamente convalidato per garantire l&#39;espressione singola cella è rappresentativo del tessuto stesso e pregiudizi non tecnico. Metodi come ibridazione in situ può risultare utile per verificare questi risultati nel tessuto intatto. Infine, è fondamentale per garantire che i dati generati viene accuratamente controllato per il controllo qualità. I dati riportati in figura 8 dimostra che i test qPCR può essere molto robusti nella loro specificità, come il saggio # 13 (A13) o hanno un elevato livello di variabilità che possono portare a variazioni tecniche come test # 34 (A34).

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Commenti </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> NaCl </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 71378 </td><td></td></tr><tr><td> KCl </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 60128 </td><td></td></tr><tr><td> L&#39;acido piruvico </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P4562 </td><td></td></tr><tr><td> Hepes </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 54457 </td><td></td></tr><tr><td> MgCl 2 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M1020 </td><td></td></tr><tr><td> NaH 2 PO 4 monobasico </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P9791 </td><td></td></tr><tr><td> Destrosio </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G6721 </td><td></td></tr><tr><td> NaOH </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 72068 </td><td></td></tr><tr><td> EGTA </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> O3777 </td><td></td></tr><tr><td> CaCl 2 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 21115 </td><td></td></tr><tr><td> Proteasi, Tipo XIV </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P5147 </td><td></td></tr><tr><td> Collagenase, Tipo I </td><td> Worthington </td><td> C9891 </td><td></td></tr><tr><td> 1x Sospensione tampone del DNA (10 mM Tris, pH 8.0, 0.1 mM EDTA) </td><td> TEKnova, </td><td> PN T0221 </td><td></td></tr><tr><td> BSA </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> B8667 </td><td></td></tr><tr><td> Sodio pentobarbital </td><td> Henry Schein Vet. Alimentazione * </td><td> Contattare il fornitore per l&#39;ordinazione </td><td> * Deve essere acquistato attraverso un laboratorio veterinario o animale professionale </td></tr><tr><td> ExoSAP IT </td><td> Affymetrix / USB </td><td> 78201 </td><td></td></tr><tr><td> CellsDirect 2x Mix RXN </td><td> Invitrogen </td><td> 11737-030 </td><td></td></tr><tr><td> SuperScript III RT Platinum Taq Mix </td><td> Invitrogen </td><td> 10928-042 </td><td></td></tr><tr><td> RT-STA Primer Mix </td><td> IDT </td><td> Costume </td><td></td></tr><tr><td> Nucleasi acqua gratis </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> W4502 </td><td></td></tr><tr><td> WTA2 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> WTA2-50rxn </td><td></td></tr><tr><td> QIAquick PCR kit di purificazione </td><td> Qiagen </td><td> 28104 </td><td></td></tr><tr><td> Qiacube </td><td> Qiagen </td><td> 9001292 </td><td></td></tr><tr><td> NanoDrop Spettrofotometro </td><td>NanoDrop </td><td> 2000c </td><td></td></tr><tr><td> Bioanalyzer DNA 7500 Kit </td><td> Agilent </td><td> 7500 kit </td><td></td></tr><tr><td> Un colore kit etichettatura </td><td> Roche-NimbleGen </td><td> 5223555001 </td><td></td></tr><tr><td> Mus musculus 12x135k serie </td><td> Roche-NimbleGen </td><td> 5543797001 </td><td></td></tr><tr><td> GenePix 4200A Scanner </td><td> Molecular Devices </td><td> 4200A </td><td></td></tr><tr><td> TransPlex Completa intero kit di amplificazione trascrittoma (WTA2 Kit) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> WTA2-50RXN </td><td></td></tr></tbody></table>

cella singola profiling trascrizionale dei cardiomiociti adulti mouse

Single Cell Transcriptional Profiling of Adult Mouse Cardiomyocytes

Mentre numerosi studi hanno esaminato i cambiamenti di espressione genica da omogenati di tessuto cardiaco, questo impedisce studiando la variazione inerente stocastica tra le cellule all&#39;interno di un tessuto. Isolamento delle popolazioni di cardiomiociti pura attraverso una perfusione collagenasi dei cuori del mouse facilita la generazione di microarray singola cella per tutta l&#39;espressione genica trascrittoma, o qPCR di obiettivi specifici utilizzando gli array nanofluidic. Descriviamo qui una procedura per esaminare le singole cellule profili di espressione genica dei cardiomiociti isolati dal cuore. Questo paradigma permette per la valutazione delle metriche di interesse che non dipendono dalla media (per esempio la varianza tra le cellule all&#39;interno di un tessuto) che non è possibile quando si utilizza tessuti tradizionali flussi di lavoro intero per la valutazione dell&#39;espressione genica (Figura 1). Abbiamo raggiunto l&#39;amplificazione robusta del trascrittoma microgrammi singola cellula cedimento di cDNA doppio filamento che facilita l&#39;uso di microarray su icellule ndividual. Nella procedura viene descritto l&#39;uso di array NimbleGen che sono stati selezionati per la loro facilità d&#39;uso e possibilità di personalizzare il loro design. In alternativa, un trascrittasi inversa - amplificazione del target specifico (RT-STA) di reazione, permette di qPCR di centinaia di obiettivi da parte nanofluidic PCR. Utilizzando uno di questi due approcci, è possibile esaminare la variabilità di espressione tra le cellule, così come l&#39;esame di profili di espressione di tipi di cellule rare all&#39;interno di un tessuto. Nel complesso, il singolo gene approccio cellula espressione permette la generazione di dati che sono potenzialmente in grado di identificare profili di espressione idiosincratica che sono tipicamente mediati in sede di esame l&#39;espressione di milioni di cellule da omogenati tipici generati dai tessuti interi.

Singoli profili di espressione delle cellule consente la dettagliata analisi di espressione genica di cellule singole. Noi descrivere i metodi per l&#39;isolamento dei cardiomiociti, e preparare il lisati risultante sia per microarray intero trascrittoma o qPCR di obiettivi specifici.

Cella singola Profiling trascrizionale dei cardiomiociti adulti mouse

Sebbene numerosi studi abbiano esaminato le variazioni dell'espressione genica a partire da omogenati di tessuto cardiaco, tale approccio impedisce di studiare la variazione stocastica intrinseca...

Gli obiettivi di questa presentazione sono illustrare innanzitutto l'isolamento di cardiomiociti vitali da topo adulto e successivamente dimostrare due metodi di analisi dell'espressione genica a singola cellula. Dopo aver dissezionato il cuore da un topo, il cuore viene perfuso con una soluzione digestiva a base di collagenasi per ottenere cellule singole. Per la PCR quantitativa su singole cellule, le cellule purificate vengono sottoposte direttamente a saggi di QPCR.I cardiomiociti isolati possono essere utilizzati anche per l'analisi con microarray. L'analisi con microarray di singole cellule prevede l'estrazione dell'mRNA, l'amplificazione dell'intero trascrittoma tramite una libreria plex, seguita da un'amplificazione limitata e, infine, etichettatura ed ibridazione su un chip per microarray. L'ultimo passaggio di entrambe le procedure consiste nel garantire dati di alta qualità.Queste procedure dimostrano che è possibile effettuare un'analisi robusta dell'espressione genica a partire da cardiomiociti adulti isolati singolarmente. Il vantaggio di questo metodo rispetto ai metodi esistenti, come il profilo dell'espressione genica di omogeneizzato tissutale totale, è che l'espressione genica a singola cellula permette di ottenere informazioni sull'espressione all'interno di una singola cellula, nonché sulla variabilità dell'espressione tra le cellule. Iniziare con un sistema di isolamento preparato, comprese le soluzioni e i tamponi necessari, sedare definitivamente un topo mediante iniezione intraperitoneale di 0,25 millilitri di soluzione di pentobarbital sodico e accertarsi che il topo sia incosciente e non reagisca a stimoli dolorosi.Non utilizzare anidride carbonica o dislocazione cervicale per eutanasizzare il topo prima che il topo si fermi. Tagliare con attenzione durante la respirazione. Aprire la cavità toracica lungo il margine toracico attraverso il diaframma.Quindi effettuare un'incisione superiore verso l'alto e riflettere la gabbia toracica anteriore. Aspirare delicatamente il cuore in una pipetta di plastica pre-tagliata ed escindere il cuore dal torace. Immergere il cuore nella soluzione di digestione fredda su ghiaccio.Buffer A e risciacquare via il sangue dopo 15-45 secondi, eseguire un secondo risciacquo rapido in buffer A, quindi trasferire il cuore nella piastra di Petri contenente buffer A e posizionarlo sotto un microscopio per dissezione. Isolare con attenzione l'aorta e le sue ramificazioni. Tagliare l'aorta appena al di sotto dell'ultima branca.Inserire la punta della cannula nell'aorta al di sopra delle arterie coronarie e fissarla con una sutura 4 oh o 6 oh. Iniziare la perfusione utilizzando il buffer di digestione A. L'effluente passerà dal rosso al chiaro man mano che il sangue viene eliminato dal cuore. Il tempo impiegato tra l'eutanasia dell'animale e il collegamento del cuore al sistema di perfusione è fondamentale.È preferibile mantenere questa fase inferiore ai cinque-dieci minuti. Inoltre, la temperatura del fluido che scorre attraverso il sistema di perfusione deve essere mantenuta a 37 gradi Celsius. Se è troppo caldo o troppo freddo, questo distruggerà il tessuto.Una volta che il sangue è stato lavato dal cuore, passare all'uso della soluzione di digestione. Perfundere il cuore con il buffer B per due o tre minuti, fino a quando l'organo inizia a perdere la sua forma e assume un aspetto più arrotondato. Il miocardio dovrebbe apparire più chiaro man mano che la perfusione procede; a questo punto, asportare i ventricoli e tritarli in pezzi più piccoli.Posizionare il tessuto ventricolare in un tubo conico da 50 millilitri contenente 15 millilitri di buffer di raccolta tiepido. Mescolare delicatamente il tessuto nel buffer con una pipetta di plastica per ottenere una miscela di cardiomiociti singoli. Dopo un minuto, trasferire la miscela in un nuovo tubo e lasciarla sedimentare una volta formato il pellet.Scartare il sopranatante e risospendere. Sospendere le cellule in pellet in cinque millilitri di tampone di lavaggio di neutralizzazione. Le cellule sono ora pronte per essere selezionate per l'analisi di singola cellula.Diluire le cellule in una piccola capsula di Petri in modo che possano essere selezionate singolarmente. Al microscopio, selezionare singole cellule sane utilizzando una pipetta tirata collegata a un airlock. Quando si prelevano le cellule, assicurarsi di evitare contaminazioni e di ridurre al minimo il volume di cattura a meno di due microlitri.Posizionare le singole cellule sul fondo di provette PCR singole e congelarle immediatamente su anidride carbonica solida. Successivamente, conservare le cellule a meno 80 gradi Celsius per iniziare a risospendere tutte le coppie di primer per i geni di interesse a 100 micromolari e un buffer di sospensione XDNA, unire e diluire le coppie di primer a 20 micromolari. Infine, diluire tutte le coppie di primer in un'unica soluzione con una concentrazione finale di 200 nanomolari.Con le soluzioni di primer pronte, preparare immediatamente il master mix, prelevare le cellule congelate dal congelatore e centrifugarle alla forza massima per 30 secondi. Aggiungere quindi nove microlitri del master mix in ogni provetta ed eseguire la PCR. Rimuovere le provette dal termociclatore e aggiungere quattro microlitri di esoni a ciascuna reazione.Eseguire quindi ogni reazione per 15 minuti a 37 gradi Celsius, seguiti da 15 minuti a 80 gradi Celsius. Concludere mantenendo i campioni a quattro gradi Celsius. Successivamente, diluire i campioni da uno a cinque con tampone di sospensione del DNA.I campioni sono ora pronti per l'analisi di PCR quantitativa. Utilizziamo ora questo materiale e il sistema fluido IMS BIOMARK con array di espressione genica a 48 punti 48 o a 96 punti 96. È possibile utilizzare formati QPCR più tradizionali come piastre a 96 pozzetti e a 384.Il formato a pozzetti, tuttavia, limita il numero di saggi che possono essere eseguiti a partire da una singola cellula. Questo processo utilizza il kit WTA two di Sigma, che può amplificare il cDNA a doppio filamento sia da pellet che da singole cellule. Il kit innanzitutto rompe la membrana delle singole cellule e successivamente amplifica i messaggi in due cicli.Dopo aver eseguito il passaggio di preparazione della libreria, aggiungere un quinto del campione di libreria a 70 microlitri del master mix di amplificazione WTA due e amplificare i campioni per 25 cicli utilizzando i parametri del kit. Successivamente, purificare i campioni utilizzando il kit di purificazione PCR Kayak Quick ed elaborarli sul Cain's Kayak Cube. Al termine, concentrare i campioni purificati a cinque microlitri utilizzando un vuoto ad alta velocità e utilizzare il kit WTA due per sottoporre i campioni a ulteriori 17 cicli di amplificazione, usando gli stessi parametri dell'amplificazione precedente.Purificare i campioni come fatto in precedenza e verificarne la qualità utilizzando uno spettrofotometro NanoDrop e il kit Agilent Bioanalyzer DNA 7500. Etichettare ora due microgrammi di DNA a doppio filamento da ciascun campione cellulare amplificato utilizzando il kit di etichettatura monocolore di NimbleGen, quindi ibridare cinque microgrammi del campione etichettato con CY3 su un array di espressione genica NimbleGen. Dopo l'ibridazione, lavare e asciugare il vetrino in modo che possa essere analizzato. Utilizzare uno scanner Molecular Devices GenePix 4200 con le impostazioni calibrate a 100 POW e 300-350 PMT.Analizzare le gene chip, quindi generare file di coppie per ogni array utilizzando il software NimbleGen's NimbleScan ed eseguire l'analisi dei dati. Un cuore perfuso con successo ha prodotto un'alta percentuale di cellule cardiache sane che hanno mantenuto la loro tipica morfologia rettangolare. Se la perfusione non fosse riuscita adeguatamente, molte cellule sarebbero morte.Le cellule sono state amplificate mediante il metodo WTA due e la qualità dei prodotti finali è stata testata. Il campione ha mostrato un'amplificazione robusta sia nella lettura dello spettrofotometro nano drop spec, sia nel tracciato elettroferetico ottenuto dal chip del bioanalizzatore. In sintesi, molti geni sono risultati espressi in modo robusto nei cardiomiociti.Tuttavia, non tutti i saggi sono ugualmente affidabili, come mostrato in questa mappa termica delle temperature di picco di fusione ottenute da un sottoinsieme di dati QPCR con fluidica nano. Ogni riga di questa mappa rappresenta un singolo campione cellulare analizzato in 43 saggi QPCR separati. Alcuni saggi risultano piuttosto variabili e probabilmente meno affidabili rispetto a quelli che hanno mostrato una maggiore specificità della PCR.Quando si esegue questa procedura, è importante ricordare che è necessario ottenere cellule di qualità fin dall'inizio. Questo garantirà la qualità del profilo di espressione genica nelle fasi successive. Una volta acquisita padronanza, la procedura di isolamento di singole cellule può essere completata in meno di due ore e mezza, e il profilo di espressione genica da queste cellule può essere completato in meno di due giorni.

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Qui si descrive l'isolamento di cardiomyoctyes adulte di topo mediante un sistema di perfusione Langendorff. Le cellule risultanti sono Ca2 +-tolerant, elettricamente quiescente e può essere colta e trasfettate con-adeno o lentivirus per manipolare l'espressione genica. La loro funzionalità può anche essere analizzato con il sistema MMSYS e tecniche di patch clamp.

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Isolamento e Cultura del topo adulto Cardiomyocytes per Cell Signaling e<em&gt; In vitro</em&gt; Cardiaca Ipertrofia

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Isolamento, cultura e trasduzione di topo adulto cardiomiociti

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Valutare cardiomiociti sottotipi A seguito di riprogrammazione Fattore di trascrizione-mediata di fibroblasti embrionali di topo

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Isolamento simultaneo e cultura di miociti atriali, miociti ventricolari e non miociti da un cuore di topo adulto

Qui, descriviamo un protocollo per isolare una quantità sufficiente di singoli non cardiomiociti con elevata vitalità da un cuore di topo post-infarto miocardico (MI). Questo può essere utilizzato per il successivo sequenziamento di singole cellule, l'analisi della citometria a flusso e la coltura cellulare primaria.

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Cella singola Profiling trascrizionale dei cardiomiociti adulti mouse

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