Name: GENPLAT: una piattaforma automatizzata per la scoperta degli enzimi biomassa e ottimizzazione Cocktail (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-10-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 38 s
Description: Scopri come ottimizzare i cocktail enzimatici per la degradazione della biomassa lignocellulosica con la piattaforma automatizzata GENPLAT. Questo metodo consente di identificare combinazioni enzimatiche ottimali per la produzione di biocarburanti.

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Questo lavoro è stato finanziato in parte dal Dipartimento dell&#39;Energia degli Stati Uniti dei Grandi Laghi Bioenergy Research Center (DOE Office of Science BER DE-FC02-07ER64494) e concedere DE-FG02-91ER200021 da parte del Dipartimento dell&#39;Energia degli Stati Uniti, Ufficio di Basic Sciences Energia, Divisione di Scienze Chimiche, Scienze geologiche e Bioscienze. Ringraziamo John Scott-Craig e Melissa Borrusch per il loro materiale e contributi concettuali.

1. Enzima di produzione <ol><li> Producono proteine ​​in Pichia pastoris per la clonazione dei geni corrispondenti in vettori pPICZ o pPICZα e la trasformazione in P. pastoris. Crescere le cellule in lotti da 300 ml in sconcertato da 500 ml palloni con induzione metanolo ogni 24 ore (Banerjee et al. 2010a). </li><li> Concentrato e desalt i filtrati dalla cultura filtrazione a flusso tangenziale. </li><li> Conservare gli enzimi in piccole aliquote nel 20% glicerolo a -80 ° C. L'intervallo di concentrazione è 1-10 mg / ml. </li></ol> 2. Progettazione di Experiment <ol><li> Inserire il numero di enzimi da testare, i loro superiori e inferiori proporzioni (ad esempio una percentuale inferiore al 5% per gli enzimi core), e il tipo di disegno sperimentale (ad esempio, quadratica o cubica) nella progettazione Expertsoftware. </li><li> Calcolare la quantità in mg di ciascun enzima da aggiungere per fare un carico totale di 15 mg / g di glucano, e quindi calcolare la quantità di ciascun enzima in microlitri da aggiungere allaogni reazione. </li><li> Generare fogli di lavoro Excel specificando da laboratorio sorgente, pozzi fonte, da laboratorio di destinazione, pozzi di destinazione e dei volumi di trasferimento per l'erogazione di acqua ed enzimi secondo il disegno sperimentale e importarlo nel software Biomek FXP utilizzando il trasferimento di file funzione. </li></ol> 3. Idrolisi enzimatica <ol><li> Sospendere il liquame biomassa in 50 mM di sodio citrato, pH 4.8, contenente 5 mg / ml di tetraciclina e 5 mg / ml cicloeximide, nel serbatoio pagaia. </li><li> Roboticamente pipetta 200 ul del liquame in ciascun pozzetto di un pozzo profondo 96-pozzetti di reazione mediante Span-8 1000-microlitri puntali con gli ultimi 0,5 centimetri tagliato. Mescolare l'impasto una volta a 100 l / sec e quindi aspirare lo stesso volume dal serbatoio pagaia e distribuire nei piatti. </li><li> Erogare gli enzimi nella piastra stessa utilizzando il programma inserito nel FX Beckman. </li><li> Sigillare le piastre con capmats perforabile. </li><li> Inverti e toccarele piastre più volte di superare la tensione superficiale. Posizionare le piastre a 50 ° C per 48 ore nella ibridazione rotazione incubatore a 10 giri. </li></ol> 4. Determinazione del Glc e Xyl <ol><li> Centrifugare le piastre di reazione per 3 min a 1250 xg in una centrifuga secchio oscillante. </li><li> Trasferire 100 ml di surnatante in regolare piastre con 96 pozzetti utilizzando l'AP96 pod della Biomek FX. </li><li> Incubare le piastre a 90-95 ° C per 10 minuti per inattivare gli enzimi, quindi si centrifuga a 1250 xg per 30 sec. </li><li> Per le misure Glc, trasferire 12 microlitri della surnatanti in regolare piastre a 96 pozzetti. Aggiungere 192 microlitri della ossidasi / perossidasi del glucosio (goPod) reagente. Incubare le piastre a 50 ° C per 20 minuti e leggere le assorbanze a 510 nm in un lettore di micropiastre. Blank è miscela di reazione senza enzima. </li><li> Per le misure Xyl, trasferimento 4 microlitri in piastre da 384 pozzetti. Aggiungere i reagenti e leggere le piastre a 340 nm. Vuotoè la miscela di reazione senza enzima. </li></ol> 5. Analisi dei dati <ol><li> Convertire i valori di assorbanza% Glc loro e rese Xyl basato sul noto Glc e contenuti Xyl della biomassa originale. Importare queste percentuali delle risposte in Design-Expert. Controllare la paramenters statistiche per essere sicuri che i criteri per un robusto modello sono soddisfatte. </li><li> Confermare la previsione miglior modello sperimentale. </li></ol> 6. Risultati rappresentante con GENPLAT: (1) La creazione di miscele ottimizzata di singole proteine ​​pure. I risultati indicano che gli enzimi sono importanti, e in quali proporzioni, e anche che gli enzimi non sono importanti. Alcune proteine ​​che sono abbondanti nel T. reesei secretome (Nagendran et al., 2009), come Cip1 e Cip2, sembrano svolgere alcun ruolo nel Glc comunicato dal mais pretrattati con espansione in fibra di ammoniaca (AFEX) o alcaline hyd Stover Rogen perossido (AHP) (Banerjee et al. 2010b). D'altra parte, alcune proteine ​​sono inaspettatamente importanti. Per esempio, endo-xilanasi delle famiglie glicosil idrolasi 10 e 11 sono entrambi importanti per Glc rilascio, uno xilanasi non può sostituire l'altro (Banerjee et al, 2010b, c).. Cel61A, una proteina minore del T. reesei secretome, è molto importante per Glc ma non Xyl rilascio. Alcuni enzimi sono importanti per il rilascio di entrambi i Glc e Xyl, mentre altri sono necessarie solo per una o l'altra (Banerjee et al. 2010C). Una miscela di sintesi contenente 16 componenti, ciascuna ad una concentrazione di 0,94 mg / ml (cioè un non ottimizzato miscela), rilasciata il 38% dei disponibili Glc da AFEX pre-trattati con DDG. In condizioni di idrolisi identiche, una miscela ottimizzata, in cui le concentrazioni dei 16 componenti varia da 0% al 32%, rilasciata il 52% del Glc (Fig. 2). Questo esperimento illustra l'utilità della costruzione di miscele definite. _content "&gt; (2) La creazione di cocktail ottimizzata per il pretrattamento diversi / combinazioni substrato. attuali preparazioni cellulasi commerciali sono" one-size-fits-all ". In realtà, i migliori cocktail dipende sia dal substrato e il pretrattamento. Un unico prodotto come Accellerase 1000 dà rese diverse da diversi substrati pretrattati allo stesso modo, e dal substrato stesso esposto a pretrattamenti (Fig. 1). Abbiamo usato GENPLAT per ottimizzare le miscele di enzimi per puro pre-trattamenti multipli e materie prime mutiple (Banerjee et al. 2010C). Figura 2 mostra come le proporzioni degli enzimi ottimale di 16 enzimi puro si distingue per paglia del mais AFEX-pretrattati, AHP-pretrattati paglia del mais, e AFEX pre-trattati con DDG. Solo 11 gli enzimi sono mostrati in fig. 2 perché l'ottimale proporzioni degli altri cinque (Cel61B, AbfB, Cip1, Cip2 e Cel12A) sono risultate pari a 0% (Banerjee et al. 2010C). (3) Novel scoperta degli enzimi T. reesei e A. niger cresciuti su diversi substrati. Un estratto di particolare potenziato resa Glc quando aggiunto al nostro set base. La proteina responsabile era purificata e dimostrato di essere un romanzo glicosil idrolasi non presente in alcun preparato enzimatico commerciale (Banerjee e Walton, risultati non pubblicati). (4) La scoperta di una migliore enzimi. Dopo aver dimostrato con GENPLAT che gli enzimi sono più importanti per la degradazione di unparticolare la biomassa, abbiamo una migliore comprensione di enzimi che dovrebbe essere l'obiettivo di miglioramento. Esempi migliori degli enzimi critica potrebbe essere quella di cercare in natura o resi mediante ingegneria proteica. (Un enzima potrebbe essere "migliore" rispetto al suo omologo T. reesei in diversi modi, a seconda della proprietà desiderata, ad esempio, l'attività più specifiche, una maggiore sinergia, diminuita sensibilità proteolitici, o maggiore stabilità termica). GENPLAT fornisce una piattaforma significativa per saggiare gli enzimi potenzialmente migliore, perché utilizza un cocktail realisticamente complessi (importante perché nessuna enzima biomassa lavora in isolamento) e un substrato realistico (importante perché i risultati con pura cellulosa o altri substrati artificiali non possono essere rilevanti per lignocellulosici naturali materiali). (5) ottimizzazione enzima commerciale. Quantità sufficientemente grande di enzimi puri non esistono ancora nel mondo reale. Finché non lo farà, l'etanolo proproduttori devono fare affidamento su prodotti commerciali come Accellerase 1000 e MultifectXylanase. Tuttavia, miscele di enzimi commerciali in genere un rendimento migliore rispetto a qualsiasi individuo, e GENPLAT può essere usato per progettare cocktail ottimizzato di più enzimi commerciale. La figura 3 mostra l'uso di GENPLAT per ottimizzare una miscela di quattro preparati enzimatici commerciali. Le proporzioni ottimali per il rilascio di Glc da AFEX pre-trattati con DDG sono risultate essere il 47% Accellerase1000, 27% Multifect Pectinasi, 22% Novozyme 188, e il 4% Multifect Xylanase (Banerjee et al. 2010C). Figura 3B mostra le differenze di rendimento Glc da AFEX-DDG con quattro preparati enzimatici, la miscela ottimizzata commerciale dà maggiore rendimento rispetto Glc Accellerase1000 solo, SpezymeCP da solo, o un 16-componente miscela sintetica. Questo esperimento indica anche che l'16-componente miscela sintetica non è presente uno o più enzimi necessari per il rilascio ottimale Glc, che sono presenti in uno o più degli enzimi commerciale. GENPLAT ci può essereed per identificare i componenti del genere. <img src="/files/ftp_upload/3314/3314fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Nessuna preparazione singolo enzima commerciale è ottimale per tutti i sottofondi e tutti i pre-trattamenti. Cinque substrati e tre pre-trattamenti sono stati confrontati in condizioni simili di macinazione (0,5 granulometria mm), enzima di carico (15 mg / g glucani), e le condizioni di idrolisi (48 ore, 50 ° C). A. digestione di diverse AFEX-substrati pretrattati con Accellerase 1000. Digestione B. di paglia del mais pretrattati con tre metodi diversi con Accellerase 1000 (vedi Banerjee et al. 2010C). <img src="/files/ftp_upload/3314/3314fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Proporzione ottimale di 11 enzimi per il rilascio del Glc da AFEX-pretrattati paglia del mais (AFEX-CS), perossido di idrogeno alcalino-pretrattati paglia del mais (AHP-CS), o AFEX-pretrattati secca distillaregrani ERS '(AFEX-DDG). I dati sono da Banerjee et al. (2010C). Numeri lungo la parte superiore delle barre sono le rese Glc come percentuale del totale Glc nel campione biomassa. <img src="/files/ftp_upload/3314/3314fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. A. L'uso di GENPLAT per produrre una miscela ottimizzata di quattro preparati enzimatici commerciali per il rilascio di Glc da AFEX pre-trattati con DDG. Multifect Xylanase fatto il più piccolo contributo (4%) ed è stato quindi omesso da questo diagramma ternario. B. rendimenti Glc da AFEX-DDG con trattamenti enzimatici diversi idrolisi in condizioni identiche (15 mg / g enzima glucano, 48 h, 50 ° C) . "Quattro-componente commerciale" ha le proporzioni stabilite dal l'esperimento mostrato in fig. 3A.

<ol><li>Anderson, M. J., Whitcomb, P. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAnderson%2C+MJ+%22DOE+Simplified%3A+Practical+Tools+for+Effective+Experimentation%22">DOE Simplified: Practical Tools for Effective Experimentation</a>. , 2nd Edition, Productivity Press. New York. (2007).</li>
<li>Banerjee, G., Car, S., Scott-Craig, J. S., Borrusch, M. S., Aslam, N., Walton, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+enzyme+mixtures+for+biomass+deconstruction%3A+production+and+optimization+of+a+core+set%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Bioengineer%22%5BJournal%5D)">Synthetic enzyme mixtures for biomass deconstruction: production and optimization of a core set.</a> Biotechnol. Bioengineer. 106, 707-720 (2010).</li>
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<li>Banerjee, G., Car, S., Scott-Craig, J. S., Borrusch, M. S., Walton, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+optimization+of+enzyme+mixtures+for+deconstruction+of+diverse+pretreatment%2Fbiomass+feedstock+combinations%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Biofuels%22%5BJournal%5D)">Rapid optimization of enzyme mixtures for deconstruction of diverse pretreatment/biomass feedstock combinations.</a> Biotechnol. Biofuels. 3, 22-22 (2010).</li>
<li>Berlin, A., Maximenko, V., Gilkes, N., Saddler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+enzyme+complexes+for+lignocellulose+hydrolysis%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Optimization of enzyme complexes for lignocellulose hydrolysis.</a> Biotechnol. Bioeng. 97, 287-296 (2007).</li>
<li>Decker, S. R., Brunecky, R., Tucker, M. P., Himmel, M. E., Selig, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+throughput+screening+techniques+for+biomass+conversion%5BTitle%5D)+AND+%22Bioenerg.+Res%22%5BJournal%5D)">High throughput screening techniques for biomass conversion.</a> Bioenerg. Res. 2, 179-192 (2009).</li>
<li>Gao, D., Chundawat, S. P., Krishnan, C., Balan, V., Dale, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mixture+optimization+of+six+core+glycosyl+hydrolases+for+maximizing+saccharification+of+ammonia+fiber+expansion+%28AFEX%29+pretreated+corn+stover%5BTitle%5D)+AND+%22Bioresour.+Technol%22%5BJournal%5D)">Mixture optimization of six core glycosyl hydrolases for maximizing saccharification of ammonia fiber expansion (AFEX) pretreated corn stover.</a> Bioresour. Technol. 101, 2770-2781 (2010).</li>
<li>Harris, P. V., Welner, D., McFarland, K. C., Re, E., Poulsen, J. C. N., Brown, K., Salbo, R., Ding, H., Vlasenko, E., Merino, S., Xu, F., Cherry, J., Larsen, S. Y., LoLeggio, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stimulation+of+lignocellulosic+biomass+hydrolysis+by+proteins+of+glycoside+hydrolase+family+61%3A+Structure+and+function+of+a+large%2C+enigmatic+family%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Stimulation of lignocellulosic biomass hydrolysis by proteins of glycoside hydrolase family 61: Structure and function of a large, enigmatic family.</a> Biochemistry. 49, 3305-3316 (2010).</li>
<li>Kim, E., Irwin, D. C., Walker, L. P., Wilson, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factorial+optimization+of+a+six-cellulase+mixture%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Factorial optimization of a six-cellulase mixture.</a> Biotechnol. Bioeng. 58, 494-501 (1998).</li>
<li>King, B. C., Donnelly, M. K., Bergstrom, G. C., Walker, L. P., Gibson, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optimized+microplate+assay+system+for+quantitative+evaluation+of+plant+cell+wall-degrading+enzyme+activity+of+fungal+culture+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">An optimized microplate assay system for quantitative evaluation of plant cell wall-degrading enzyme activity of fungal culture extracts.</a> Biotechnol. Bioeng. 102, 1033-1044 (2009).</li>
<li>Nagendran, S., Hallen-Adams, H. E., Paper, J. M., Aslam, N., Walton, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+genomic+potential+for+secreted+plant+cell-wall-degrading+enzymes+in+the+ectomycorrhizal+fungus+Amanita+bisporigera%2C+based+on+the+secretome+of+Trichoderma+reesei%5BTitle%5D)+AND+%22Fung.+Genet.+Biol%22%5BJournal%5D)">Reduced genomic potential for secreted plant cell-wall-degrading enzymes in the ectomycorrhizal fungus Amanita bisporigera, based on the secretome of Trichoderma reesei.</a> Fung. Genet. Biol. 46, 427-435 (2009).</li>
<li>Rosgaard, L., Pedersen, S., Langston, J., Akerhielm, D., Cherry, J. R., Meyer, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+minimal+Trichoderma+reesei+cellulase+mixtures+on+differently+pretreated+barley+straw+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Prog%22%5BJournal%5D)">Evaluation of minimal Trichoderma reesei cellulase mixtures on differently pretreated barley straw substrates.</a> Biotechnol. Prog. 23, 1270-1276 (2007).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

E &#39;ampiamente riconosciuto che la riduzione del costo di enzimi è importante per lo sviluppo di un settore economico di etanolo lignocellulosiche. Attualmente sono disponibili cocktail di enzimi commerciali sono miscele complesse e scarsamente definita di molte proteine ​​(Nagendran et al., 2009), e si adattano soprattutto per l&#39;uso su pre-trattati con acido paglia del mais. Al fine di accelerare lo sviluppo di cocktail di enzimi meglio, diversi laboratori hanno sviluppato piattaforme high-throughput per la scoperta e la caratterizzazione degli enzimi. Sforzi in questo campo hanno incorporato una o più delle seguenti proprietà anche in GENPLAT: erogazione robotica di enzimi e fanghi di biomassa, il modello statistico di sperimentazione, e / o determinazione automatica di Glc e Xyl (Berlin et al, 2007; Decker et. al, 2009;. Kim et al, 1998;. King et al, 2009).. GENPLAT estende questi sforzi in precedenza, la maggior parte in modo significativo nella complessità delle miscele enzima che può essere analizzata da un massimo di 6 componenti ini primi studi a oltre 16 nel nostro ultimo lavoro (Banerjee et al. 2010C). Altre caratteristiche chiave del GENPLAT sono l&#39;uso di una camera di miscelazione tallone (serbatoio paddle), che può mantenere fanghi paglia sospesi durante l&#39;erogazione, la miscela dolce durante la digestione entro la fine del-over-end di rotazione; e automatizzato determinazione colorimetrica di Glu e Xyl.

Apparecchiature e software utilizzati: <ol><li> Design-Expert, versione 8.0 (Stat-Ease, Inc., Minneapolis, MN) ( <a href="http://www.statease.com">http://www.statease.com</a> ) </li><li> Biomek FXP laboratorio di automazione workstation (Beckman-Coulter, Fullerton, CA) </li><li> Biomek FXP software, Versione 3.3 (Beckman-Coulter, Fullerton, CA) </li><li> Pale serbatoio (modello VP-756C 1P100, V &amp; P Scientific Inc., San Diego) </li><li> Piatti, 96-profondo (1,5 ml) e (Abgene, Fisher Scientific, Epson, UK) </li><li> Capmats perforabile (USA scientifico, Ocala, FL) </li><li> Rotazione ibridazione incubatore (modello 5420, VWR) </li><li> Swinging-bucket centrifuga (Model 5810R, Eppendorf, Amburgo, Germania) </li><li> Piatti, Costar a 96 pozzetti (Abgene, Fisher Scientific, Epson, UK) </li><li> Piatti, da 384 pozzetti (BD Falcon, BD Biosciences, San Jose, CA) </li></ol> Reagenti utilizzati: <ol><li> Pichia pastoris e vettori: tensione X33, e pPICZ e pPICZα (Invitrogen, Carlsbad, CA) </li><li> T. reesei e vettori: ceppo QM9414 (US Department of Agriculture Centro Nazionale per la Ricerca Agricola utilizzo, Peoria, IL), e pCB1004-EV (Banerjee et al, 2010b). </li><li> Accellerase 1000 (numero di lotto 1600844643) (Genencor, Inc., Rochester, NY) </li><li> 50 mM tampone citrato di sodio, pH 4,8 </li><li> Tetraciclina magazzino: 10 mg / ml </li><li> Cicloeximide magazzino: 10 mg / ml </li><li> GoPod test kit, catalogo K-Gluc (Megazyme, Bray, Irlanda) </li><li> Xilosio test kit, catalogo K-XYLOSE (Megazyme, Bray, Irlanda) </li></ol>

genplat: una piattaforma automatizzata per la scoperta degli enzimi biomassa e ottimizzazione cocktail

GENPLAT: an Automated Platform for Biomass Enzyme Discovery and Cocktail Optimization

L'elevato costo degli enzimi per la degradazione della biomassa rappresenta un ostacolo significativo per la conversione economica delle materie prime lignocellulosiche in carburanti liquidi per il trasporto, come l'etanolo. Abbiamo sviluppato una piattaforma integrata ad alta produttività, denominata GENPLAT, per la scoperta e lo sviluppo di nuovi enzimi e miscele enzimatiche finalizzati al rilascio di zuccheri da diverse combinazioni di biomassa e pretrattamenti. GENPLAT comprende quattro elementi: enzimi puri singoli, progettazione statistica degli esperimenti, pipettaggio robotizzato di sospensioni di biomassa ed enzimi e determinazione automatizzata colorimetrica di Glc e Xyl rilasciati. Gli enzimi singoli vengono prodotti mediante espressione in Pichia pastoris o Trichoderma reesei, oppure mediante purificazione cromatografica da miscele commerciali o da estratti di nuovi microrganismi. I modelli di miscuglio a reticolo simplex (fattoriali frazionari) vengono progettati utilizzando un software statistico commerciale per la progettazione degli esperimenti. Le miscele enzimatiche ad alta complessità vengono assemblate mediante pipettaggio robotizzato in formato a 96 pozzetti. La misurazione di Glc e Xyl rilasciati viene automatizzata impiegando saggi colorimetrici accoppiati a enzimi. Miscele enzimatiche ottimizzate, contenenti fino a 16 componenti, sono state testate su diverse combinazioni di materia prima e pretrattamento.
GENPLAT è adattabile a miscele di enzimi puri, miscele di prodotti commerciali (ad es. Accellerase 1000 e Novozyme 188), estratti di microrganismi nuovi o combinazioni di questi. Per preparare e testare miscele di &tilde;10 enzimi puri richiedono meno di 100 &mu;g di ciascuna proteina e meno di 100 reazioni totali, quando si opera a un carico totale finale di 15 mg di proteina/g di glucano. Utilizziamo enzimi provenienti da diverse fonti. Gli enzimi possono essere purificati da fonti naturali come colture fungine (ad esempio, Aspergillus niger, Cochliobolus carbonum, e Galerina marginata), oppure possono essere prodotte mediante l'espressione dei geni codificanti (ottenuti dal numero crescente di sequenze genomiche microbiche) in ospiti come E. coli, Pichia pastoris, o un fungo filamentoso come T. reeseiLe proteine possono inoltre essere purificate da miscele enzimatiche commerciali (ad esempio, Multifect Xylanase, Novozyme 188). Un numero crescente di enzimi puri, inclusi glicosidi idrolasi, esterasi attive sulla parete cellulare, proteasi e liasi, è disponibile da fonti commerciali, ad esempio Megazyme, Inc. (www.megazyme.com), NZYTech (www.nzytech.com) e PROZOMIX (www.prozomix.com).
Il software Design-Expert (Stat-Ease, Inc.) viene utilizzato per creare progetti a reticolo semplice e per analizzare le risposte (in questo caso, il rilascio di Glc e Xyl). Le miscele contengono da 4 a 20 componenti, la cui proporzione può variare tra lo 0 e il 100%. I punti del saggio includono tipicamente i vertici estremi con un numero sufficiente di punti intermedi per generare un modello valido. Nella terminologia della progettazione sperimentale, la maggior parte dei nostri studi sono esperimenti di "miscela", il che significa che la somma di tutti i componenti corrisponde a un carico proteico totale fisso (espresso come mg/g di glucano). Il numero di miscele nel reticolo semplice dipende sia dal numero di componenti nella miscela sia dal grado del polinomio (quadratico o cubico). Ad esempio, un esperimento a 6 componenti prevede 63 reazioni distinte con un modello cubico speciale aumentato, in grado di rilevare interazioni a tre vie, mentre sono necessarie soltanto 23 reazioni individuali con un modello quadratico aumentato. Per miscele contenenti più di otto componenti, un disegno sperimentale quadratico è più pratico e, secondo la nostra esperienza, tali modelli sono generalmente validi dal punto di vista statistico.
Tutti i carichi enzimatici sono espressi come percentuale del carico totale finale (che nei nostri esperimenti è tipicamente di 15 mg di proteina/g di glucano). Per gli enzimi "core", il limite inferiore è fissato al 5%. Questo limite deriva dalla nostra esperienza, in cui rese di Glc e/o Xyl risultavano molto basse se un enzima core era presente allo 0%. Modelli scadenti derivano da un numero eccessivo di campioni che mostrano rese molto basse di Glc o Xyl. L'impostazione di un limite inferiore determina di conseguenza un limite superiore. Cioè, in un esperimento a sei componenti, se il limite inferiore per ciascun componente singolo è fissato al 5%, allora il limite superiore per ciascun componente singolo sarà del 75%. I limiti inferiori per tutti gli altri enzimi considerati "accessori" sono fissati allo 0%. Le denominazioni "core" e "accessorio" sono in parte arbitrarie e possono variare a seconda del substrato, ma nei nostri studi gli enzimi core per il rilascio di Glc dal residuo di mais comprendono i seguenti enzimi di T. reesei: CBH1 (noto anche come Cel7A), CBH2 (Cel6A), EG1(Cel7B), BG (β-glucosidasi), EX3 (endo-β1,4-xilanasi, GH10) e BX (β-xilosidasi).
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GENPLAT (Enzyme GLBRC Platform) è una piattaforma automatizzata per la scoperta e l&#39;ottimizzazione di cocktail di enzimi per la degradazione della biomassa. Può essere adattato alle materie prime più e miscele di enzimi contenenti più componenti.

GENPLAT: una piattaforma automatizzata per la scoperta degli enzimi biomassa e ottimizzazione Cocktail

L'elevato costo degli enzimi per la decostruzione della biomassa rappresenta un ostacolo significativo alla conversione economica di materie prime lignocellulosiche in combustibili liquidi...

In questa procedura, le miscele enzimatiche per convertire la biomassa lignocellulosica in zuccheri liberi vengono ottimizzate mediante un sistema automatizzato noto come piattaforma enzimatica A-G-L-B-R-C o gen plat. In primo luogo, viene progettato un modello di miscelazione in cui da quattro a diciotto enzimi distinti vengono combinati in fino a 96 rapporti diversi utilizzando un software di progettazione degli esperimenti. Successivamente, la biomassa e gli enzimi vengono trasferiti in piastre da 96 pozzetti profondi mediante un sistema robotico per la manipolazione dei liquidi.Le piastre vengono sigillate e incubate per 48 ore a 50 gradi Celsius. Al termine dell'incubazione, i pozzetti vengono campionati mediante un sistema automatizzato di gestione dei liquidi, e il glucosio e il xilosio liberi vengono misurati utilizzando un saggio enzimatico accoppiato colorimetrico. Successivamente, un software per la progettazione degli esperimenti viene utilizzato per determinare quali combinazioni di enzimi producono la massima quantità di glucosio libero e silossani.L'obiettivo generale di questa procedura è testare contemporaneamente l'efficienza di diverse miscele enzimatiche nel convertire materiali lignocellulosici in zuccheri fermentabili per l'etanolo, con l'obiettivo complessivo di ridurre i costi di produzione dei biocarburanti. Sebbene utilizziamo questo metodo principalmente per analizzare miscele enzimatiche su pannocchie di mais sottoposte a pretrattamento alcalino, esso è adattabile a qualsiasi pretrattamento e qualsiasi materia prima, come pioppo, gramigna e crusca secca da distilleria trattati con acido. Questa tecnica può essere impiegata per scoprire nuovi enzimi importanti per la degradazione della biomassa e per individuare varianti migliori degli enzimi già noti.Sebbene gli enzimi utilizzati per le gemme piantali possano provenire da diverse fonti, gli enzimi impiegati in questa dimostrazione sono prodotti esprimendo PPIC o PPIC alpha in cellule di Pia Pastis gro in lotti da 300 millilitri e in fiaschi baffati da 500 millilitri per tre giorni. Successivamente, nei quattro giorni seguenti, effettuare un'induzione con metanolo ogni 24 ore a partire dall'ultimo giorno di induzione con metanolo. Versare i campioni in un sistema di filtrazione a flusso tangenziale dotato di una membrana con cutoff di 10 kilodalton per concentrare e desalinizzare la coltura.I filtrati vengono quindi sottoposti a un cambio di tampone con cinque volumi di acetato di sodio 25 millimolari a pH 5 e il campione viene concentrato fino a raggiungere un volume compreso tra 10 e 25 millilitri. Misurare la concentrazione proteica mediante il metodo BCA utilizzando BSA come standard; la concentrazione finale delle soluzioni stock dell'enzima dovrebbe essere compresa tra 0,5 e 10 milligrammi per millilitro. Conservare gli enzimi in piccole aliquote con il 20% di glicerolo a meno 80 gradi Celsius per creare disegni sperimentali a reticolo semplice.Aprire innanzitutto il programma Design Expert su un PC. Inserire il numero di enzimi da testare e le proporzioni superiori e inferiori. Ad esempio, una proporzione inferiore del 5% per gli enzimi principali, quindi indicare se il disegno sperimentale è quadratico o cubico.Quadratic è necessario per le miscele con più di otto componenti in Excel. Calcolare la quantità in microgrammi di ciascun enzima da aggiungere per caricare un totale di 15 milligrammi per grammo di glucano per campione. Quindi calcolare la quantità di ciascun enzima in microlitri da aggiungere a ciascuna reazione in base alle concentrazioni proteiche delle soluzioni stock.Generare ulteriori fogli di lavoro di Excel, specificando le pozzette sorgente nel LabWare, il LabWare di destinazione, le pozzette di destinazione e i volumi di trasferimento per l'erogazione di acqua ed enzimi in base al disegno sperimentale. Infine, importare il foglio di lavoro nel software Biome FX utilizzando la funzione di trasferimento da file per generare una sospensione di biomassa di stufa di mais pretrattata. Versare la biomassa essiccata in un mulino Wiley e macinarla fino a farla passare attraverso un setaccio da 0,5 millimetri.Raccogliere la biomassa macinata in un becher. Il contenuto di glucano viene misurato con metodi standard come descritto nell'analisi compositiva completa delle pareti cellulari vegetali, parte uno lignina, pubblicata da JoVE. Una volta determinato il contenuto di glucano, mescolare la biomassa con tampone citrato di sodio in modo che la concentrazione finale di glucano sia dello 0,5%. Accendere il serbatoio con paletta e versare la sospensione di biomassa al suo interno.Ora, anche se gli enzimi sono tenuti sul ghiaccio, la quantità di ciascun enzima necessaria dipende dalle dimensioni dell'esperimento per dispensare la biomassa. Le sospensioni vengono generate utilizzando punte wide bore, ottenute tagliando con una lametta l'ultimo 0,5 centimetro di otto punte per pipetta da 100 microlitri.I puntali tagliati dello SPAN eight possono essere riutilizzati. Dopo il taglio, posizionare i puntali in una scatola per pipette in modo che possano essere prelevati automaticamente dallo SPAN eight. Questo strumento è dotato di un modulo SPAN eight con funzione di puntale monouso, in grado di dispensare singole soluzioni in singole pozzette, e di un modulo fisso AP 96, che può trasferire contemporaneamente 96 soluzioni identiche in una piastra a 96 pozzette; successivamente, organizzare la superficie del sistema di gestione dei liquidi.Questo comprende una piastra di reazione deep well da 96 pozzetti, un coperchio con alloggiamento per puntali contenente acqua, un portaprovette per enzimi contenente gli enzimi in provette eppendorf da 1,5 millilitri e diversi contenitori pieni di puntali nelle posizioni del deck programmate durante la configurazione dello strumento. Una volta che il deck è pronto, verificare il programma per eventuali errori. Avviare il Beckman fx.Il braccio SPAN a otto canne preleverà prima 200 microlitri della sospensione di biomassa e li trasferirà in ogni pozzetto delle piastre di reazione deep well a 96 pozzetti. Il modulo SPAN a otto canne provvederà quindi a dispensare gli enzimi in ciascun pozzetto, secondo il foglio elettronico importato nel software Biome FX. Al termine della pipettaggio, rimuovere la piastra deep well a 96 pozzetti dal deck.Sigillare la piastra con una pellicola adesiva o un tappo a matrice. Quindi capovolgere la piastra e batterla una o due volte per rompere la tensione superficiale. Posizionare la piastra nel forno di ibridazione per 48 ore, seguendo la centrifuga di incubazione.Centrifugare la piastra a 96 pozzetti profondi per tre minuti a 1.500 ×g in una centrifuga con rotor a cestello oscillante mentre la piastra ruota. Programmare il Beckman FX per utilizzare il modulo AP 96 per prelevare 100 microlitri da ogni pozzetto e trasferirli in una piastra standard a 96 pozzetti. Successivamente alla centrifugazione, posizionare la piastra nell'apparecchio e avviare il pipettaggio.Al termine della pipettaggio, incubare le piastre a 100 gradi Celsius per 10 minuti su un termoblocco per inattivare gli enzimi; quindi centrifugare la piastra a 1.500 ×g per 30 secondi. Per le misurazioni di GLC, aggiungere innanzitutto 192 microlitri del reagente glucosio ossidasi-perossidasi, utilizzando un programma scritto per il modulo AP 96 del Beckman fx.Quindi utilizzare il pod AP 96 per trasferire 12 microlitri del campione in una piastra standard da 96 pozzetti. Incubare le piastre a 50 gradi Celsius per 20 minuti e misurare l'assorbanza a 510 nanometri con un lettore per micropiastre. Per le misurazioni di xlo, aggiungere i reagenti del saggio seguendo le istruzioni del kit.Quindi utilizzare il pod AP 96 per trasferire quattro microlitri di ogni pozzetto in piastre a 384 pozzetti e misurare l'assorbanza a 340 nanometri. Eseguire l'analisi dei dati come descritto nel documento allegato utilizzando il software Design Expert. Cinque substrati e tre pretrattamenti sono stati confrontati in condizioni simili di macinazione con dimensione delle particelle di 0,5 millimetri, carico enzimatico di 15 milligrammi per grammo di glucano e condizioni di idrolisi.48 ore a 50 gradi Celsius, come si può vedere qui. Esistono differenze evidenti tra le materie prime e tra i diversi pretrattamenti. È chiaro che il cocktail enzimatico da solo, anche se accelera di 1000 volte, non riesce a gestire tutta la variabilità osservata nei pretrattamenti e nelle materie prime.Questo esperimento confronta un forno a mais pretrattato con A FEX, indicato come A-F-E-X-C-S, perossido alcalino, forno a mais pretrattato, A-H-P-C-S e grani secchi da distillazione pretrattati con A FEX, A-F-E-X-D-D-G. I numeri lungo la parte superiore delle barre rappresentano le rese di glucosio come percentuale del glucosio totale presente nel campione di biomassa. Si noti che la composizione dei cocktail varia notevolmente a seconda del pretrattamento e del substrato di biomassa.Sebbene l'uso principale di gem plat sia la creazione di miscele sintetiche di enzimi puri, può essere utilizzato anche per produrre miscele ottimizzate di preparati enzimatici commerciali. Il pannello A mostra un diagramma a settori di quattro enzimi ottimizzati per il rilascio di glucosio da A-F-E-X-D-D-G; il pannello B mostra i rendimenti risultanti utilizzando questa miscela ottimizzata rispetto a tre altri preparati enzimatici. Abbiamo appena dimostrato l'utilizzo di gen plat per facilitare la degradazione della biomassa mediante enzimi puri individuali.Ogni enzima possiede una specifica attività catalitica che contribuisce alla completa degradazione delle pareti cellulari vegetali in zuccheri singoli. Tuttavia, non è necessario conoscere l'attività catalitica precisa di un enzima per valutarne l'importanza nella destrutturazione della biomassa. Utilizzando Gen pla, sapere quali enzimi sono importanti e in quali proporzioni è fondamentale per indirizzare la bioprospezione.Per nuovi enzimi nell'ingegneria proteica e nello sviluppo di organismi per la biotecnologia integrata, a volte i risultati sono sorprendenti. Ad esempio, abbiamo scoperto che per il rilascio di glucosio da Conover, una combinazione di due Xin ais non correlate è superiore a ciascun Xin da solo. Abbiamo inoltre scoperto che una migliore manasi è importante per il rilascio di glucosio dal grano secco di distilleria.Anche se questo materiale presenta un basso rendimento e contenuto, questo metodo aprirà la strada ai ricercatori per sviluppare cocktail enzimatici ancora migliori per una varietà di condizioni. Non è nemmeno necessario conoscere quale sia l'attività enzimatica specifica di una determinata proteina per testarne il contributo alla degradazione della lignocellulosa.

genplat-an-automated-platform-for-biomass-enzyme-discovery-cocktail

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Bioingegneria

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Una schermata di High Throughput per Biomining attività Cellulase da librerie metagenomiche

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High-throughput per l&#39;analisi Saccarificazione materiali lignocellulosici

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