Istituzione di Epstein-Barr Virus Growth-trasformata linee linfoblastoidi

L'obiettivo generale di questa procedura è generare linee cellulari di linfoblasti trasformati dal virus di Epstein-Barr, o LCL, a partire da linfociti B umani. Questo viene ottenuto isolando innanzitutto le cellule mononucleate del sangue periferico dal sangue umano.

Successivamente, le cellule vengono infettate con il virus di Epstein-Barr eps in presenza di FK506 e agenti immunosoppressori; da tre a quattro giorni dopo l'infezione con il virus di Epstein-Barr EP, emerge una sottopopolazione di cellule caratterizzata da espressione elevata di CD23, positività per CD58 ed è previsto che subisca proliferazione (CD23 alta). Le cellule CD23 alta e CD58 positive possono essere quantificate mediante citometria a flusso come indicatore di esito positivo. Le cellule in proliferazione possono essere ulteriormente identificate, a livello microscopico e macroscopico, attraverso i cluster di linfoblasti che si formano nelle colture cellulari trasformate con successo.

L'ultimo passaggio consiste nell'ampliare le linee cellulari di linfoblasti per la crioconservazione. Nel mio laboratorio, generiamo linee cellulari di linfoblasti, o LCL, per comprendere le interazioni tra l'ospite e il virus di Epstein-Barr. Le linee cellulari di linfoblasti sono inoltre di ampio interesse generale per la comunità scientifica, in particolare per virologi, immunologi e biologi del cancro.

Come ricercatore postdottorato O in un laboratorio du Macintosh, illustrerò la procedura per generare linee cellulari di linfoblasti. Dopo aver prelevato 10 millilitri di sangue da un donatore, aggiungere il sangue eparinizzato in un tubo conico da 50 millilitri e quindi diluirlo uno a due. Aggiungendo 20 millilitri di PBS a temperatura ambiente al tubo, stratificare sotto il sangue diluito 15 millilitri di mezzo di separazione per linfociti FICO HIA, quindi centrifugare il sangue a 225 × g senza freno a temperatura ambiente per 30 minuti al fine di formare un gradiente.

Successivamente, rimuovere il buffy coat e trasferirlo in un nuovo tubo conico da 50 millilitri. Portare il volume a 50 millilitri con PBS e quindi pellettare le cellule a 600 ×g per 10 minuti. Versare il sopranatante, risospendere il pellet in 50 millilitri di PBS e lavare le cellule altre due volte nelle stesse condizioni.

Ora risospendere le cellule in un millilitro di RPM completo. Utilizzo cinque microlitri di cellule per preparare un diluizione da uno a 10 in triam blu e contare le cellule vitali mediante emocitometro, quindi uso RPMI completo per aggiustare il volume al fine di ottenere una concentrazione cellulare di due volte. Centrare le sei cellule per millilitro e trasferire le cellule in un fiasco per coltura tissutale da 25 centimetri quadrati.

Per preparare le cellule all'infezione con il virus di Epstein-Barr, aggiungere FK 5 0 6 alla fiala di coltura cellulare fino a raggiungere una concentrazione finale di 20 M. Quindi collocare la fiala in un incubatore con anidride carbonica al 5% a 37 gradi Celsius per un'ora. Quando le cellule hanno quasi terminato l'incubazione, scongelare rapidamente un'aliquote di virus di Epstein-Barr, ottenuto da cellule B 95 8. Successivamente, rimuovere la fiala dall'incubatore e aggiungere il virus di Epstein-Barr alle cellule in un rapporto di diluizione di 1 a 10; agitare delicatamente la fiala per mescolare il virus di Epstein-Barr nella soluzione, quindi posizionare la fiala in posizione verticale nell'incubatore con il tappo chiuso, ma leggermente allentato, se si utilizza una fiala non ventilata, per due o tre settimane prima dell'espansione della coltura per la crioconservazione.

Una settimana dopo l'infezione da virus di Epstein-Barr (eps), gruppi di cellule sono visibili mediante microscopia ottica, come mostrato in questa figura rappresentativa di aggregati microscopici precoci. Procedendo nel tempo, gli aggregati microscopici aumentano di dimensioni, tanto da diventare visibili macroscopicamente come grumi nel flacone, come osservabile in questa figura in cui si possono notare aggregati più grandi di LCL. Per nutrire le cellule, raddoppiare il volume del mezzo di supporto nel flacone di coltura al giorno 12. Quando il mezzo di coltura diventa giallo, generalmente una volta alla settimana, è il momento di nutrire le cellule; per espandere le cellule, aumentare il volume della coltura da due a tre volte.

Utilizzando RPMI completo, espandere la coltura fino a 70-100 millilitri in un’area di 75 centimetri quadrati nel corso delle prossime settimane per generare cellule da criopreservare. Un esito positivo è predetto dalla presenza di CD23 e di un’elevata percentuale di cellule CD58 positive, come mostrato in questo grafico a dispersione. Circa dal 2 al 3% delle cellule vitali al terzo-quarto giorno dopo l’esposizione all’episoma del virus di Epstein-Barr presenta questo profilo. Altre sottopopolazioni di cellule CD23 positive, CD23 negative, CD58 positive e CD58 negative osservate dopo l’esposizione all’episoma del virus di Epstein-Barr mostrano una proliferazione minima. Le cellule non infette o infettate con un ceppo non immortalizzante del virus di Epstein-Barr non mostrano espressione elevata di CD23.

Cellule positive per CD58. Le cellule possono anche essere visualizzate mediante microscopia ottica. Come menzionato, entro una settimana dall'infezione da virus di Epstein-Barr, piccole aggregazioni di cellule sono visibili nel flacone mediante microscopia ottica.

Con il passare del tempo e lo sviluppo delle cellule in LCL, gli aggregati microscopici diventano più grandi, fino a rendersi visibili macroscopicamente nella provetta. Bene. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come isolare cellule mononucleate del sangue periferico dal sangue umano e generare linee cellulari di linfoblasti trasformate dal virus di Epstein-Barr a partire da linfociti B umani, anche se la generazione di linee cellulari di linfoblasti è stata descritta da altri laboratori.

Il vantaggio del nostro protocollo è che fornisce ai ricercatori un metodo per prevedere un esito positivo già tre o quattro giorni dopo l'infezione delle cellule B con il virus di Epstein-Barr.