Name: Istituzione di Epstein-Barr Virus Growth-trasformata linee linfoblastoidi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-08T12:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 38 s
Description: Impara a generare linee linfoblastoidi trasformate dal virus Epstein-Barr da cellule B umane. Questo metodo consente di predire il successo della trasformazione entro tre-quattro giorni dall'infezione mediante citometria a flusso.

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Questa ricerca è stata finanziata dal NIH AI062732 K08, K12 HD001401 e 1UL1RR024139-02 e una salute di Grant Bambino Ricerca dalla H. Charles Hood Foundation per SB-M. e dalla Fondazione di Ricerca presso l&#39;Università dello Stato di New York a Stony Brook.

1. EBV magazzino preparazione <ol><li> Subculture in crescita esponenziale B95-8 celle (ATCC # CRL 1612, 13) a 3 x 10 5 cellule / ml in un pallone di 75 centimetri 2 di coltura tissutale con tecnica sterile. Le cellule sono coltivate in RPMI 1640 completo contenente il 10% di siero siero fetale bovino (FBS), penicillina / streptomicina a 100U/ml e 100 mcg / ml, rispettivamente, e amfotericina B a 0,5 mcg / ml a 37 ° C in presenza del 5% di CO 2. </li><li> Quarantotto ore dopo, risospendere le cellule in fresco completo RPMI 1640 con 1 x 10 6 cellule / ml. Per indurre la produzione del virus, stimolano le cellule con acetato di 20ng/ml tetradecanoyl forbolo (TPA) per 1 ora in un incubatore standard di CO 2. Lavare le cellule tre volte con RPMI 1640 per rimuovere TPA. </li><li> Risospendere le cellule del volume originale di completo RPMI 1640 (da 1,2) e posizionare il pallone in CO 2 incubatore per 96 ore. Questo metodo ha dimostrato di produrre alti titoli di par virus infettivoticles 6. </li><li> Centrifugare a 600 x g per 10 minuti a 4 ° C per separare EBV contenenti supernatante della coltura dalle cellule. Surnatante filtrare attraverso un filtro di 0,45 micron, aliquota, e conservare a -70 ° C per più di un anno. Un'alternativa è quella di ottenere il supernatante da B95-8 celle contenenti EBV dalla ATCC (VR-1492) e utilizzare alla diluizione raccomandata dalla ATCC. </li></ol> 2. Isolamento delle cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) <ol><li> Draw 10 ml di sangue da donatore in una siringa eparina o un tubo di sangue eparinato. Diluire il sangue con 20 ml di PBS a temperatura ambiente in una provetta da 50 ml. </li><li> Alla base di sangue diluito con 15 ml di mezzo di separazione Ficoll Hypaque linfociti. Centrifugare a 225 x g senza freno a temperatura ambiente per 30 minuti. </li><li> Rimuovere il buffy coat e trasferire in un nuovo tubo da 50 ml. Aumentare il volume a 50 ml con PBS e spin a 600 xg a temperatura ambiente per 10 minuti. </li><li> Pour off surnatante. Lavare le cellule da risospendere pellet in 50 ml di PBS e filatura a 600 x g a temperatura ambiente per 10 minuti. Lavare due volte in un modo simile. </li><li> Risospendere lavato le cellule in 1 ml di RPMI completo. Usare 5 ml di cellule di preparare una diluizione 1 / 10 in tripan blu. Contare le cellule vive usando un emocitometro. </li><li> Regolare il volume con RPMI completo in un centimetro 25 2 fiasco di coltura per ottenere una concentrazione cellulare di 2 x 10 6 / ml. </li></ol> 3. L'infezione da EBV <ol><li> Aggiungi FK506 (AG scientifico) alla sospensione cellulare da 2.6 a una concentrazione finale di 20 nm. Pallone posto di CO 2 incubatore a 37 ° C per un'ora. </li><li> Scongelare rapidamente una aliquota di EBV. Rimuovere beuta da incubatore e aggiungere EBV nelle cellule di diluizione 1 / 10. In genere, questa diluizione fornisce una MOI di 50-100. Swirl pallone per mescolarne e lo mettono diritto di CO 2 incubatore a 37 ° C. </li></ol> Nota °al punto 4, eseguita per predire l'esito di successo, è un passo opzionale. Se Fase 4 deve essere eseguita, è necessario incubare un pallone aggiuntivo di non-infetti PBMC con 2 x 10 6 cellule / ml come controllo. 4. L'identificazione della popolazione di cellule proliferanti (passo opzionale) <ol><li> Preparare FACS buffer: PBS + 5% FBS. Conservare a 4 ° C. </li><li> Effettuare l'anticorpo seguenti mescola in 50 microlitri di volume ciascuno per la colorazione delle cellule nella fase 4.6. Diluizioni degli anticorpi devono essere effettuati in tampone FACS contenente 1mg/ml del mouse IgG (Sigma) per inibire legame non specifico dagli anticorpi. <ol class="lroman"><li> singolo-colorati con PE coniugato anticorpo anti-CD23 (1 / 50 di diluizione) </li><li> singolo-colorati con FITC coniugato anticorpo anti-CD58 (1 / 50 di diluizione) </li><li> singolo-colorati con PE-Cy5 coniugato anticorpo anti-CD19 (1 / 50 di diluizione) </li><li> triplo macchiato per CD23, CD58 e CD19 (1 / 50 ogni diluizione) </li><li> singolo-colorati con controllo isotipico coniugato PEanticorpi abbinato a CD23-PE (alla stessa concentrazione di anticorpi anti-CD23) </li><li> singolo-colorati con FITC coniugato controllo isotipo abbinato a CD58-FITC (alla stessa concentrazione di anticorpi anti-CD58) </li><li> singolo-colorati con PE-Cy5 coniugato anticorpo di controllo isotipo abbinato a CD19-PE-Cy5 (alla stessa concentrazione di anticorpi anti-CD19) </li><li> tre colorate con tutti gli anticorpi isotipo controllo a tre. </li></ol> Memorizzare temporaneamente la mescola a 4 ° C al buio. </li><li> In tre giorni post-esposizione ad EBV, delicatamente fiasco agitare per ottenere una sospensione cellulare più uniforme. Rimuovere da 2ml matraccio in un tubo di 2 ml Eppendorf. Spin tubo in una microcentrifuga a 3000 rpm a temperatura ambiente per 3 minuti. </li><li> Aspirare il surnatante e risospendere le cellule in tampone FACS a 5 x 10 6 a 1 x 10 7 cellule / ml. </li><li> Rimuovere otto aliquote 50μl in singoli tubi Eppendorf o un 96-well V-parte inferiore della piastra. Tubi di rotazione o la piastra a 1500 x gper 3 minuti. </li><li> Eliminare il surnatante e tubi vortex / piastra. Risospendere le cellule in ogni tubo / pozzetto in 50 ml di tampone FACS contenente diluizioni degli anticorpi adeguati preparati in 4.2. </li><li> Incubare le provette / piastre in ghiaccio al buio per 30 minuti. Cellule centrifugare a 3000 rpm per 3 minuti, togliere il surnatante e aggiungere 200 ml di tampone FACS. Centrifugare le cellule di nuovo e rimuovere il surnatante per completare il lavaggio. Ripetere due lavaggi più. </li><li> Risospendere le cellule in 200 microlitri di buffer FACS ed acquisire i dati utilizzando un citofluorimetro, l'acquisizione di 20.000 eventi / tubo. </li><li> Analizzare i dati utilizzando WinMDI (freeware per l'analisi FACS dati su PC). Porta su cellule vive usando i profili scatter in avanti e laterale. Poi, le cellule porta dal vivo per l'espressione di CD19 + (cellule B marker) dopo il confronto con le cellule colorate con anticorpo di controllo isotipo abbinato a degli anticorpi anti-CD19. Plot CD19 + vivere cellule B con intensità di fluorescenza per CD23 su asse x e l'intensità di fluorescenza per CD58 su asse y. Determinare CD23 + CD58 + e cellule confrontando per EBV-esposto le cellule colorate con anticorpi isotipo di controllo abbinati. Presenza di CD58 + CD23 hi cellule EBV-esposti cultura (Figura 2C) predice escrescenza successo di EBV-infettate crescita delle cellule trasformate. Al contrario, le cellule CD23 + CD58 hi non emergono quando le cellule non siano esposti a EBV (Figura 2A) o esposti ad un non-immortalando ceppo EBV (Figura 2B). Hi CD58 delle cellule CD23 + sono stati sperimentalmente dimostrato di subire proliferazione e successivamente stabilire LCL (14). </li></ol> 5. Espansione e crioconservazione di LCL <ol><li> Visualizzazione delle cellule mediante microscopia ottica: per una settimana dopo l'infezione da EBV, gruppi di cellule sono visibili al microscopio ottico. La figura 3 mostra un esempio dei primi gruppi microscopici (Figura 3B) in un pallone. </li><li> Col passare del tempo, diventano più grandi ammassi microscopici grumi in modo che siano visibilimacroscopicamente nel pallone. Figura 3C mostra grandi ammassi di cellule stabilito LCL al microscopio ottico. </li><li> Alimentazione celle: doppio del volume del terreno di coltura nel pallone cultura il giorno 12. Successivamente, espandere la cultura aumentando il suo volume 2-3 volte con RPMI completo. </li><li> Periodicità di cellule di alimentazione deve essere determinato sulla base del tasso di crescita delle cellule. Quando il terreno di coltura diventa giallo, è generalmente il momento di sostituire i mezzi di comunicazione di cui sopra. Tipicamente, questo accade una volta alla settimana. Tuttavia, alcune linee cellulari può avere bisogno di essere alimentato più o meno frequentemente. Espandere la cultura di 75-100 ml nelle settimane prossime. </li><li> Crioconservazione: congelamento Quando le cellule, le cellule centrifugare a 600 x g per 10 minuti a temperatura ambiente. Rimuovere il surnatante e risospendere pellet di cellule in medium freddo gelido contenente 90% FBS e il 10% dimetilsolfossido a 1 x 10 7 cellule / ml. Tubo posto in azoto liquido. </li></ol> 6. Rappresentante dei risultati: Risultato positivo è previsto per la presenza di CD23 hi cellule CD58 +. Circa il 2-3% di cellule vive per 3-4 giorni dopo l'esposizione a EBV dovrebbe avere questo profilo (Figura 2C). Altri sotto-popolazioni di CD23 +, CD23 -, CD58 +, CD58 e - cellule osservata dopo l'esposizione a EBV mostrare proliferazione minimo 14. Un cellule infettate (Figura 2A) e le cellule esposte a EBV da HH514-16 cellule (Figura 2B), l'ospitare un non-immortalando ceppo EBV, non dimostrano hi CD58 + CD23 delle cellule. Si può anche visualizzare le cellule al microscopio ottico per il monitoraggio dell'esito positivo: Come accennato in precedenza, entro una settimana dopo l'infezione da EBV, piccoli gruppi di cellule nel pallone sono visibili al microscopio ottico (Figura 3B). Col passare del tempo e le cellule si sviluppano in LCL, cluster microscopico diventano più grandi (Figura 3C) tale che macchie sono visibili macroscopicamente nel pallone. Figura 1. Flusso di lavoro per la generazione e la crioconservazione di linee cellulari linfoblastoidi. Sangue periferico viene centrifugato da un gradiente di Ficoll. PBMC presenti nel buffy coat di un gradiente stabilito sono esposti a FK506 seguita da aggiunta di EBV. EBV-esposto le cellule sono coltivate a 37 ° C in presenza del 5% di CO 2 a stabilire e successivamente espandere LCL per la crioconservazione. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3321/3321fig2.jpg"> Figura 2. Identificazione di una sotto-popolazione di linfociti B dovrebbe subire proliferazione dopo l'esposizione a EBV. Un-infettati PBMC (A) o PBMC esposti a EBV derivati ​​da HH514-16 cellule (B) o da cellule B95-8 (C) in presenza di FK506 sono state raccolte al giorno 3. Le cellule sono state colorate con fluorocromo-coniugati anticorpi diretti contro CD19, CD23 e CD58. Dopo gating su cellule vives, non-infetti (A) e EBV-esposti (B e C) delle cellule B CD19 + sono stati esaminati per l'espressione di CD23 e CD58. Un sub-popolazione di linfociti B che esprimono livelli elevati di CD58 e CD23 (CD23 hi CD58 +), osservata solo nelle cellule esposte alla trasformazione competente EBV (derivati ​​da cellule B95-8), è raffigurato. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3321/3321fig3.jpg"> Figura 3. Visualizzazione di gruppi di cellule in cellule infettate da EBV. PBMC sono stati trattati con FK506 e infettati con EBV. Un-infetti (A) e EBV-esposte (B), le cellule sono state esaminate uno settimane dopo l'infezione mediante microscopia a contrasto di fase (ingrandimento 10x). Cinque settimane di vecchia linea di cellule linfoblastoidi è mostrato in C.

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<li>Tosato, G., Cohen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+Epstein-Barr+virus+%28EBV%29-immortalized+B+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Generation of Epstein-Barr virus (EBV)-immortalized B cell lines.</a> Current Protocols of Immunology. Chapter 7, 22-22 (1991).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Il metodo descritto in questo articolo genera LCL da donatore di sangue periferico con immortalizzazione rapidi e tempi di crioconservazione. Attraverso l&#39;uso di FK506, una cellula T immunosoppressiva, e alti titoli del virus infettivo, siamo in grado di promuovere la proliferazione di cellule infettate da EBV-B a partire da cellule mononucleate del sangue periferico. Questi interventi rendono il metodo descritto più efficiente, con conseguente rapida espansione delle cellule per gli esperimenti successivi. Tradizionalmente, la trasformazione la crescita è stata monitorata attraverso la visualizzazione di gruppi di cellule mediante microscopia ottica circa una settimana dopo l&#39;esposizione a EBV 6, 15. Tuttavia, il raggruppamento delle celle non è un indicatore specifico di EBV trasformazione mediata della crescita. Abbiamo già dimostrato di identificazione consistente della popolazione di cellule proliferanti mediante citometria di flusso 14, fornendo un metodo accurato e specifico per determinare la buona riuscita già a tre giorni di poppaer l&#39;esposizione delle cellule B di EBV.

<table border="1"><tbody><tr><td></td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td></tr><tr><td> Amfotericina B </td><td> Fisher Bioreagents </td><td> BP 928-250 </td></tr><tr><td> Dimetilsolfossido </td><td> Sigma </td><td> D 2650 </td></tr><tr><td> Siero fetale bovino, inattivato al calore </td><td> Sigma </td><td> F 4135 </td></tr><tr><td> Ficoll Hypaque linfociti separazione dei media </td><td> Mediatech </td><td> 25-072 </td></tr><tr><td> FK506 </td><td> AG scientifico </td><td> F 1030 </td></tr><tr><td> IgG dal siero di topo </td><td> Sigma </td><td> I 8765 </td></tr><tr><td> Topo anti-CD23 umano coniugato con PE </td><td> BD Pharmingen </td><td> 555711 </td></tr><tr><td> Topo coniugato con PE isotipo IgG1 </td><td> BD Pharmingen </td><td> 554680 </td></tr><tr><td> Topo anti-CD58 umano coniugato con FITC </td><td> Pierce Thermo Scientific </td><td> MA1-82159 </td></tr><tr><td> Topo isotipo coniugati con FITC IgG1 </td><td> BD Pharmingen </td><td> 550616 </td></tr><tr><td> Topo anti-CD19 umano coniugato con PE-Cy5 </td><td> BD Pharmingen </td><td> 555414 </td></tr><tr><td> Topo isotipo coniugato con PE-Cy5 IgG1 </td><td> Dako </td><td> X 0955 </td></tr><tr><td> Penicillina / streptomicina </td><td> Gibco </td><td> 15140-122 </td></tr><tr><td> RPMI 1640 i media </td><td> Sigma </td><td> R 8758 </td></tr><tr><td> Tetradecanoyl forbolo acetato (TPA) </td><td> Calbiochem </td><td> 407952 </td></tr><tr><td> FACS Buffer (1X Phosphate Buffered Saline + 5% siero fetale bovino) </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

istituzione di epstein-barr virus growth-trasformata linee linfoblastoidi

Establishment of Epstein-Barr Virus Growth-transformed Lymphoblastoid Cell Lines

L&#39;infezione delle cellule B con virus Epstein-Barr (EBV) porta alla proliferazione e immortalizzazione successive, con conseguente creazione di linee cellulari linfoblastoidi (LCL) in vitro. Dal LCL sono latentemente infettate con EBV, forniscono un sistema modello per studiare la latenza del virus EBV e-driven proliferazione delle cellule B e tumorigenesi 1. LCL sono stati utilizzati per presentare antigeni in una varietà di test immunologici 2, 3. Inoltre, LCL può essere utilizzato per generare anticorpi monoclonali umani 4, 5 e fornire una fonte potenzialmente illimitata quando l&#39;accesso al materiale biologico primario è limitata 6, 7. Una varietà di metodi sono stati descritti per generare LCL. Metodi precedenti hanno incluso l&#39;uso di mitogeni come fitoemoagglutinina, lipopolisaccaride 8 e 9 pokeweed mitogeno per aumentare l&#39;efficienza di EBV-mediata immortalizzazione. Più recentemente, altri ricercatori hanno utilizzato immunosuppragenti essive come la ciclosporina A per inibire T cellulo-mediata uccisione di cellule B infettate 7, 10-12. La considerevole periodo di tempo da infezione da EBV allo stabilimento di linee cellulari unità l&#39;esigenza di metodi più veloce ed affidabile per EBV-driven trasformazione crescita delle cellule B. Usando una combinazione di alto titolo EBV e un agente immunosoppressivo, siamo in grado di infettare in modo coerente, trasformare e generare LCL dalle cellule B nel sangue periferico. Questo metodo utilizza una piccola quantità di cellule mononucleari del sangue periferico che sono infettati in gruppi di cellule in vitro può essere dimostrata. La presenza di CD23 con EBV in presenza di FK506, una cellula T immunosoppressori. Tradizionalmente, conseguenza della proliferazione delle cellule B è controllato da gruppi di visualizzazione microscopica di cellule circa una settimana dopo l&#39;infezione da EBV. Ciuffi di LCL può essere visto ad occhio nudo dopo diverse settimane. Descriviamo un test per determinare in anticipo se EBV-mediata gtrasformazione rescita è successo anche prima di ammassi di cellule microscopiche può essere dimostrata. La presenza di cellule CD23 + CD58 hi osserva a partire da tre giorni post-infezione indica un esito positivo.

Descriviamo un metodo per generare linee cellulari B trasformate con virus di Epstein-Barr virus. Abbiamo anche illustrare un nuovo metodo di analisi in grado di identificare le cellule B destinato a subire trasformazioni già tre giorni dopo l&#39;infezione.

Istituzione di Epstein-Barr Virus Growth-trasformata linee linfoblastoidi

L'infezione dei linfociti B con il virus di Epstein-Barr (EBV) induce la proliferazione e la successiva immortalizzazione, determinando la stabilizzazione di linee linfoblastoidi...

L'obiettivo generale di questa procedura è generare linee cellulari di linfoblasti trasformati dal virus di Epstein-Barr, o LCL, a partire da linfociti B umani. Questo viene ottenuto isolando innanzitutto le cellule mononucleate del sangue periferico dal sangue umano.Successivamente, le cellule vengono infettate con il virus di Epstein-Barr eps in presenza di FK506 e agenti immunosoppressori; da tre a quattro giorni dopo l'infezione con il virus di Epstein-Barr EP, emerge una sottopopolazione di cellule caratterizzata da espressione elevata di CD23, positività per CD58 ed è previsto che subisca proliferazione (CD23 alta). Le cellule CD23 alta e CD58 positive possono essere quantificate mediante citometria a flusso come indicatore di esito positivo. Le cellule in proliferazione possono essere ulteriormente identificate, a livello microscopico e macroscopico, attraverso i cluster di linfoblasti che si formano nelle colture cellulari trasformate con successo.L'ultimo passaggio consiste nell'ampliare le linee cellulari di linfoblasti per la crioconservazione. Nel mio laboratorio, generiamo linee cellulari di linfoblasti, o LCL, per comprendere le interazioni tra l'ospite e il virus di Epstein-Barr. Le linee cellulari di linfoblasti sono inoltre di ampio interesse generale per la comunità scientifica, in particolare per virologi, immunologi e biologi del cancro.Come ricercatore postdottorato O in un laboratorio du Macintosh, illustrerò la procedura per generare linee cellulari di linfoblasti. Dopo aver prelevato 10 millilitri di sangue da un donatore, aggiungere il sangue eparinizzato in un tubo conico da 50 millilitri e quindi diluirlo uno a due. Aggiungendo 20 millilitri di PBS a temperatura ambiente al tubo, stratificare sotto il sangue diluito 15 millilitri di mezzo di separazione per linfociti FICO HIA, quindi centrifugare il sangue a 225 × g senza freno a temperatura ambiente per 30 minuti al fine di formare un gradiente.Successivamente, rimuovere il buffy coat e trasferirlo in un nuovo tubo conico da 50 millilitri. Portare il volume a 50 millilitri con PBS e quindi pellettare le cellule a 600 ×g per 10 minuti. Versare il sopranatante, risospendere il pellet in 50 millilitri di PBS e lavare le cellule altre due volte nelle stesse condizioni.Ora risospendere le cellule in un millilitro di RPM completo. Utilizzo cinque microlitri di cellule per preparare un diluizione da uno a 10 in triam blu e contare le cellule vitali mediante emocitometro, quindi uso RPMI completo per aggiustare il volume al fine di ottenere una concentrazione cellulare di due volte. Centrare le sei cellule per millilitro e trasferire le cellule in un fiasco per coltura tissutale da 25 centimetri quadrati.Per preparare le cellule all'infezione con il virus di Epstein-Barr, aggiungere FK 5 0 6 alla fiala di coltura cellulare fino a raggiungere una concentrazione finale di 20 M. Quindi collocare la fiala in un incubatore con anidride carbonica al 5% a 37 gradi Celsius per un'ora. Quando le cellule hanno quasi terminato l'incubazione, scongelare rapidamente un'aliquote di virus di Epstein-Barr, ottenuto da cellule B 95 8. Successivamente, rimuovere la fiala dall'incubatore e aggiungere il virus di Epstein-Barr alle cellule in un rapporto di diluizione di 1 a 10; agitare delicatamente la fiala per mescolare il virus di Epstein-Barr nella soluzione, quindi posizionare la fiala in posizione verticale nell'incubatore con il tappo chiuso, ma leggermente allentato, se si utilizza una fiala non ventilata, per due o tre settimane prima dell'espansione della coltura per la crioconservazione.Una settimana dopo l'infezione da virus di Epstein-Barr (eps), gruppi di cellule sono visibili mediante microscopia ottica, come mostrato in questa figura rappresentativa di aggregati microscopici precoci. Procedendo nel tempo, gli aggregati microscopici aumentano di dimensioni, tanto da diventare visibili macroscopicamente come grumi nel flacone, come osservabile in questa figura in cui si possono notare aggregati più grandi di LCL. Per nutrire le cellule, raddoppiare il volume del mezzo di supporto nel flacone di coltura al giorno 12. Quando il mezzo di coltura diventa giallo, generalmente una volta alla settimana, è il momento di nutrire le cellule; per espandere le cellule, aumentare il volume della coltura da due a tre volte.Utilizzando RPMI completo, espandere la coltura fino a 70-100 millilitri in un’area di 75 centimetri quadrati nel corso delle prossime settimane per generare cellule da criopreservare. Un esito positivo è predetto dalla presenza di CD23 e di un’elevata percentuale di cellule CD58 positive, come mostrato in questo grafico a dispersione. Circa dal 2 al 3% delle cellule vitali al terzo-quarto giorno dopo l’esposizione all’episoma del virus di Epstein-Barr presenta questo profilo. Altre sottopopolazioni di cellule CD23 positive, CD23 negative, CD58 positive e CD58 negative osservate dopo l’esposizione all’episoma del virus di Epstein-Barr mostrano una proliferazione minima. Le cellule non infette o infettate con un ceppo non immortalizzante del virus di Epstein-Barr non mostrano espressione elevata di CD23.Cellule positive per CD58. Le cellule possono anche essere visualizzate mediante microscopia ottica. Come menzionato, entro una settimana dall'infezione da virus di Epstein-Barr, piccole aggregazioni di cellule sono visibili nel flacone mediante microscopia ottica.Con il passare del tempo e lo sviluppo delle cellule in LCL, gli aggregati microscopici diventano più grandi, fino a rendersi visibili macroscopicamente nella provetta. Bene. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come isolare cellule mononucleate del sangue periferico dal sangue umano e generare linee cellulari di linfoblasti trasformate dal virus di Epstein-Barr a partire da linfociti B umani, anche se la generazione di linee cellulari di linfoblasti è stata descritta da altri laboratori.Il vantaggio del nostro protocollo è che fornisce ai ricercatori un metodo per prevedere un esito positivo già tre o quattro giorni dopo l'infezione delle cellule B con il virus di Epstein-Barr.

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JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia e Infezioni

Un rapido, protocollo semplice e conveniente per la generazione di donatore-derivati ​​multivirus specifici CTL (RCtl) per infusione a trapianto allogenico di cellule staminali emopoietiche (HSCT) a rischio di sviluppare infezioni da CMV, EBV o Adv. Questo processo di fabbricazione è GMP e deve assicurare l'applicazione più ampia di cellule T immunoterapia al di là di centri specializzati.

Generazione di Multivirus-cellule T specifiche per prevenire / curare infezioni virali dopo trapianto allogenico di cellule staminali ematopoietiche

Qui si descrive la prima pratica di fabbricazione (GMP) conforme metodo per produrre virus-specifici linfociti T citotossici (CTL) da sangue del cordone ombelicale, fonte di cellule T prevalentemente ingenuo.

Espansione linfociti T citotossici da sangue del cordone ombelicale che Target Citomegalovirus, virus di Epstein-Barr virus, e Adenovirus

Source: Xu, C., et al. An Efficient and Simple Method to Establish NK and T Cell Lines from Patients with Chronic Active Epstein-Barr Virus Infection. J. Vis. Exp. (2018).This video demonstrates the phenotyping of EBV-infected T and NK cell lines using flow cytometry, highlighting the preparation, antibody staining, and analysis steps to identify lineage-specific surface markers. It shows how marker profiles confirm distinct T-cell and NK-cell populations.

Phenotyping EBV-Infected Cell Lines Using Flow Cytometry

Sarcoma di Kaposi (KS) è un tumore indotto tramite l'infezione con il virus oncogeno herpesvirus-8/KS il herpesvirus umano (HHV-8/KSHV). Il modello di coltura delle cellule endoteliali descritto qui è specificatamente concepito per studiare i meccanismi da cui KSHV trasforma le cellule ospite.

Un modello In Vitro per lo studio della trasformazione cellulare da Herpesvirus Sarcoma di Kaposi

Un semplice metodo di lisi dei globuli rossi per stabilire B-LCL stato sviluppato con alta efficienza di immortalizzazione, richiede una piccola quantità di sangue e risparmio di tempo tra l'inizio di crioconservazione.

Un cellulare semplice Red Blood Metodo Lysis per l&#39;istituzione di B linfoblastoidi linee cellulari

Un metodo semplice per ottenere cloni delle cellule T e NK dai pazienti CAEBV è stato sviluppato con alta efficienza, una piccola quantità di sangue periferico e una basso-dose del-2.

Un metodo semplice ed efficace per stabilire NK e linee a cellula T da pazienti con infezione attiva cronica del Virus di Epstein - Barr

Qui vengono descritti i metodi utilizzati per studiare l'effetto funzionale delle mutazioni RYR1 endogenamente espresse nel virus di Epstein Barr immortalato nei linfociti B umani e nelle cellule satelliti derivate dalla biopsia muscolare differenziate in miotubi.

Caratterizzazione funzionale di varianti RYR1 umane espresse endogenamente

Descriviamo un metodo che combina sfere immunomagnetiche e selezione cellulare attivata dalla fluorescenza per isolare e analizzare sottopopolazioni definite di cellule mononucleate del sangue periferico (monociti, cellule T CD4 +, cellule T CD8 +, cellule B e cellule natural killer). Utilizzando questo metodo, le cellule magnetiche e fluorescenti possono essere purificate e analizzate.

Separazione delle sottopopolazioni di cellule immunitarie nei campioni di sangue periferico da bambini con mononucleosi infettiva

Questo protocollo consente l'isolamento delle particelle virali di Epstein-Barr dalla linea cellulare umana P3HR1 inducendo il ciclo litico virale con forbolo 12-miristato 13-acetato. Il DNA viene successivamente estratto dalla preparazione virale e sottoposto a PCR in tempo reale per quantificare la concentrazione di particelle virali.

Isolamento e quantificazione del virus Epstein-Barr dalla linea cellulare P3HR1

In questo video si dimostra un protocollo per stabilire le linee del mouse linfoma delle cellule del timo. Seguendo questo protocollo, abbiamo stabilito con successo diverse linee di cellule T da Atm-/ - e p53-/ - i topi con linfoma del timo.

Derivazione di timica linfoma a cellule T Linee da Atm - / -</sup E P53 - / -</sup Mouse

Impara a generare linee linfoblastoidi trasformate dal virus Epstein-Barr da cellule B umane. Questo metodo consente di predire il successo della trasformazione entro tre-quattro giorni dall'infezione mediante citometria a flusso.

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