Name: Derivazione di Arricchito Culture oligodendrociti e degli oligodendrociti / Neuron mielinizzanti co-culture di tessuti murini post-natale (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-21T12:00:00.000+00:00
Duration: 18 min 17 s
Description: Impara a derivare culture arricchite di oligodendrociti e co-culture mielinizzanti con neuroni DRG da tessuto murino post-natale. Questo metodo permette di studiare la biologia della mielinizzazione in vitro.

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Questo progetto è stato finanziato da una sovvenzione della Multiple Sclerosis Society of Canada a RKRWO è un destinatario di una borsa di studio dalla Multiple Sclerosis Society of Canada. SDR è un destinatario di Post-Doctoral Fellowships dalla Multiple Sclerosis Society of Canada e Canadian Institutes of Health Research.

<ol><li>Avellana-Adalid, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expansion+of+rat+oligodendrocyte+progenitors+into+proliferative+%22oligospheres%22+that+retain+differentiation+potential%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">Expansion of rat oligodendrocyte progenitors into proliferative "oligospheres" that retain differentiation potential.</a> J Neurosci Res. 45, 558-570 (1996).</li>
<li>McCarthy, K. D., de Vellis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+separate+astroglial+and+oligodendroglial+cell+cultures+from+rat+cerebral+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue.</a> J Cell Biol. 85, 890-902 (1980).</li>
<li>Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+death+and+control+of+cell+survival+in+the+oligodendrocyte+lineage%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cell death and control of cell survival in the oligodendrocyte lineage.</a> Cell. 70, 31-46 (1992).</li>
<li>Chan, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NGF+controls+axonal+receptivity+to+myelination+by+Schwann+cells+or+oligodendrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">NGF controls axonal receptivity to myelination by Schwann cells or oligodendrocytes.</a> Neuron. 43, 183-1891 (2004).</li>
<li>Camara, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrin-mediated+axoglial+interactions+initiate+myelination+in+the+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Integrin-mediated axoglial interactions initiate myelination in the central nervous system.</a> J Cell Biol. 185, 699-712 (2009).</li>
<li>Ishibashi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocytes+promote+myelination+in+response+to+electrical+impulses%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Astrocytes promote myelination in response to electrical impulses.</a> Neuron. 49, 823-832 (2006).</li>
<li>Chen, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+rat+and+mouse+oligodendrocyte+precursor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of rat and mouse oligodendrocyte precursor cells.</a> Nat Protoc. 2, 1044-1051 (2007).</li>
<li>Pedraza, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production%2C+characterization%2C+and+efficient+transfection+of+highly+pure+oligodendrocyte+precursor+cultures+from+mouse+embryonic+neural+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Production, characterization, and efficient transfection of highly pure oligodendrocyte precursor cultures from mouse embryonic neural progenitors.</a> Glia. 56, 1339-1352 (2008).</li>
<li>Lewin, G. R., Ritter, A. M., Mendell, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+role+of+nerve+growth+factor+in+the+development+of+myelinated+nociceptors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">On the role of nerve growth factor in the development of myelinated nociceptors.</a> J Neurosci. 12, 1896-1905 (1992).</li>
<li>Greene, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+in+vitro+studies+on+the+nerve+growth+factor+%28NGF%29+requirement+of+neurons.+II.+Sensory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Quantitative in vitro studies on the nerve growth factor (NGF) requirement of neurons. II. Sensory neurons.</a> Dev Biol. 58, 106-113 (1977).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Questo rapporto descrive un metodo per isolare OPC murini per la differenziazione nelle culture OL-arricchito o OL / DRGN co-culture. Quando colta da solo, il OPC differenziarsi in MBP + OL ve, la produzione di mielina come fogli membranosa. Quando aggiunto a DRGN letti neuriti, OL avvolgono i neuriti DRGN con MBP + membrana ve. Questo modello benefici l&#39;indagine dei fondamenti complessi che regolano OL-mediata ensheathment assonale. Anche se di grande valore, l&#39;istituzione di tali culture è tecnicamente impegnativo. In particolare, gli aspetti impegnativi includono la digestione efficiente dei tessuti / dissociazione, il mantenimento del pH equilibrato terreni di coltura, e DRGN cambiamenti dei media. E &#39;importante considerare che la lunghezza della digestione, la quantità di tessuto essere digerito e la quantità di triturazione influenza il risultato efficacia e la fine della dissociazione dei tessuti. Non è insolito per i ricercatori esperti di ottenere basse rese cellulari dissociato da tessuti del sistema nervoso. Inoltre, OPC murino tendono ad essere sensibili alle variazioni del pH dei terreni di coltura, in particolare in ambiente alcalino. Il mantenimento di culture a 8,5% CO 2 mira a prevenire questo, dal momento che OPC sembrano tollerare condizioni migliori sul leggermente acido base. Per quanto riguarda DRGNs alimentazione, i cambiamenti dei media deve essere eseguita velocemente per non essiccare i neuroni, tuttavia, deve essere gentile come non perturbare il letto neuriti via di sviluppo. Bruschi cambiamenti dei media può rimuovere il letto neuriti dal substrato, e il risultato probabilmente nella sua completa dissociazione dalla coprioggetto. Il merito potenzialità di questo sistema modello oscura notevolmente la sua natura tecnicamente impegnativo. Un vantaggio di questo sistema è l&#39;uso di post-natale topi per la derivazione di coltura cellulare di eludere la necessità di sacrificare femmine riproduttrici per la raccolta dei tessuti embrionali. Un altro vantaggio è la mancanza di requisiti per i fattori di crescita (GF) per l&#39;espansione della OPC. Misti culture gliali forniscono un ambiente che supporta la propagazione della OPC, presumibilmente a causa della presenza di astrociti derivati ​​da fattori trofici. Altri metodi, come la derivazione via neurosfere 7,8, si basano sulle proprietà di GF mitogenica come fattore di crescita dei fibroblasti (bFGF), fattore di crescita epidermico (EGF) e delle piastrine fattore di crescita derivato dalle piastrine (PDGF) per l&#39;espansione OPC. Allo stesso modo, usando postnatale (P5-10) per topi DRGNs evita la necessità di integrare i terreni di coltura con fattore di crescita nervosa (NGF), un fattore neurotrofico necessario per la sopravvivenza in vitro di embrioni DRGNs 9, 10. E &#39;di interesse per evitare l&#39;uso di NGF poichè influenza negativamente la capacità di mielinizzanti OL quando coltivate con DRGNs 4. Evitare l&#39;uso di GF-integrato dei media ha anche benefici economici, in quanto questi reagenti diventare costoso se utilizzato su larga scala. Forse il vantaggio più importante di questo modello la cultura è la sua derivazione da mouse solo tessuti, fornendo così l&#39;opportunità di derivare sia OPC e DRGNs dalla grande varietà di linee di topi transgenici. Questo permette per lo studio di entrambi e DRGN / o OPC proprietà specifiche che regolano la mielinizzazione. Questo sarà particolarmente importante per chiarire il recettore / ligando che regolano le interazioni OL-mediata mielinizzazione degli assoni. In tutto, questa tecnica è di grande valore per quanto riguarda la ricerca delle neuroscienze per le sue applicazioni verso la comprensione i segnali molecolari alla base della mielinizzazione.

<html><table border="1"><tbody><tr><td> Nome prodotto </td><td> Azienda </td><td> Codice </td></tr><tr><td> Dulbecco modificato (DMEM) </td><td> Multicell </td><td> 319-005-CL </td></tr><tr><td> Sale di Hank soluzione equilibrata (HBSS) </td><td> Invitrogen </td><td> 14170-112 </td></tr><tr><td> Minimo Essential Media (MEM) </td><td> GIBCO </td><td> 12360-038 </td></tr><tr><td> Siero fetale bovino (FBS) </td><td> GIBCO </td><td> 10091-148 </td></tr><tr><td> Penicillina-streptomicina (Pen / Strep) </td><td> GIBCO </td><td> 15140-122 </td></tr><tr><td> GlutaMAX </td><td> Invitrogen </td><td> 35050-061 </td></tr><tr><td> Poli-L-lisina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P2636 </td></tr><tr><td> Sieroalbumina bovina (BSA) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A4503 </td></tr><tr><td> Umano merosina purificata proteine ​​(LN2) </td><td> Millipore </td><td> CC085 </td></tr><tr><td> Ricombinante di ratto fattore neurotrofico ciliare (CNTF) </td><td> Peprotech </td><td> 450-50 </td></tr><tr><td> L-tiroxina </td><td> Biochemika </td><td> 89430 </td></tr><tr><td> Holo-transferrina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T0665 </td></tr><tr><td> B27 supplemento </td><td> GIBCO </td><td> 0080085-SA </td></tr><tr><td> Insulina bovina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> I6634 </td></tr><tr><td> 3,3 &#39;,5-Triiodo-L-thyronine </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> I6634 </td></tr><tr><td> Progesterone </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P8783 </td></tr><tr><td> Putrescina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P7505 </td></tr><tr><td> Sodio Selenite </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S5261 </td></tr><tr><td> 5-Fluoro-2&#39;-deossiuridina (FuDR) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> F0503 </td></tr><tr><td> Papaina soluzione </td><td> Worthington </td><td> LS003126 </td></tr><tr><td> DNaseI </td><td> ROCHE </td><td> 1010159001 </td></tr><tr><td> L-cisteina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C7352 </td></tr><tr><td> 24-bene di coltura tissutale piatti </td><td> Cellstar </td><td> 662-160 </td></tr><tr><td> T25-tessuto cultura fiaschi con tappo di sfiato </td><td> Corning </td><td> 430639 </td></tr><tr><td> 10 centimetri di tessuto cultura piatti </td><td> Corning </td><td> 430167 </td></tr><tr><td> 10 centimetri scatola di Petri </td><td> Fisher Scientific </td><td> 0875713 </td></tr><tr><td> Collagenasi A </td><td> ROCHE </td><td> 103578 </td></tr><tr><td> CellTrics 50 micron filtro (opzionale) </td><td> PARTEC </td><td> 04-004-2327 </td></tr><tr><td> Proteina basica della mielina (MBP) Anticorpo </td><td> ABD Serotec </td><td> MCA409S </td></tr><tr><td> NG2 anticorpi </td><td> Millipore </td><td> AB5320 </td></tr><tr><td> Glicoproteina associata alla mielina (MAG) anticorpi </td><td> Millipore </td><td> MAB1567 </td></tr><tr><td> 2 &#39;, 3&#39;-ciclico-nucleotide 3&#39;-fosfodiesterasi (CNP) anticorpi </td><td> Covance </td><td> SMI-91R-100 </td></tr><tr><td> Actina pan Ab-5 anticorpi </td><td> Fitzgerald </td><td> 10R-A106AX </td></tr><tr><td> Neurofilamenti-200 (NF) anticorpi </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> N4142 </td></tr><tr><td> Tubulina beta-3 a catena (Tuj1) anticorpi </td><td> Millipore </td><td> MAB5544 </td></tr><tr><td> Alexa Fluor 488 di capra anti-IgG di coniglio (H + L) anticorpo secondario </td><td> Invitrogen </td><td> A11008 </td></tr><tr><td> Alexa Fluor 555 capra anti-topo IgG (H + L) anticorpo secondario </td><td> Invitrogen </td><td> A21422 </td></tr><tr><td> Alexa Fluor 647 di capra anti-topo (IgG) (H + L) anticorpo secondario </td><td> Invitrogen </td><td> A21247 </td></tr><tr><td> Capra anti-topo IgG (H + L)-HRP coniugato secondario </td><td> BioRad </td><td> 170-6516 </td></tr><tr><td> Capra anti-topo IgG (H + L)-HRP coniugato secondario </td><td> Santa Cruz Biotechnology </td><td> SC-2065 </td></tr><tr><td> 4 &#39;,6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D9542 </td></tr></tbody></table> Ricette dei media OL-100X Supplemento * <table border="1"><tbody><tr><td> Ingrediente </td><td> Importo da aggiungere </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> 100 ml </td></tr><tr><td> BSA </td><td> 1,02 g </td></tr><tr><td> Progesterone </td><td> 0,6 mg </td></tr><tr><td> Putrescina </td><td> 161 mg </td></tr><tr><td> Sodio Selenite </td><td> 0,05 mg </td></tr><tr><td> 3,3 &#39;,5-Triiodo-L-thyronine </td><td> 4 mg </td></tr></tbody></table> * Conservare a -80 ° C in aliquote da 250 microlitri t &quot;&gt; media OL <table border="1"><tbody><tr><td> Ingrediente </td><td> Importo da aggiungere </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> 23,75 mL </td></tr><tr><td> OL-100X Supplemento </td><td> 250 microlitri </td></tr><tr><td> Insulina bovina (da 1 mg / ml stock) </td><td> 125 microlitri </td></tr><tr><td> GlutaMAX </td><td> 250 microlitri </td></tr><tr><td> Holo-transferrina (da 33 mg / ml stock) </td><td> 37,5 microlitri </td></tr><tr><td> B27 Supplemento </td><td> 500 microlitri </td></tr><tr><td> FBS </td><td> 125 microlitri </td></tr><tr><td> CNTF (da 50 ng / mL stock) </td><td> 25 microlitri </td></tr></tbody></table> Tecnica mista cultura gliali (costituita in DMEM) <table border="1"><tbody><tr><td> Ingrediente </td><td> Concentrazione finale </td></tr><tr><td> FBS </td><td> 10% </td></tr><tr><td> Pen / strep (0,33% dal magazzino) </td><td> 33 unità / ml di penicillina e 33 mg / ml di streptomicina </td></tr><tr><td> GlutaMAX </td><td> 1% </td></tr></tbody></table> DRGN media (composta in DMEM) <table border="1"><tbody><tr><td> Ingrediente </td><td> Concentrazione finale </td></tr><tr><td> FBS </td><td> 10% </td></tr><tr><td> Pen / Strep (1% dal magazzino) </td><td> 100 unità / ml di penicillina e 100 mg / ml di streptomicina </td></tr></tbody></table> Digestione Soluzione Ricette: OPC papaina soluzione (costituita nel MEM) <table border="1"><tbody><tr><td> Ingrediente </td><td> Concentrazione finale </td></tr><tr><td> Papaina soluzione </td><td> 1,54 mg / mL </td></tr><tr><td> L-cisteina </td><td> 360 mg / ml </td></tr><tr><td> DNaseI </td><td> 60 mg / ml </td></tr></tbody></table> DRG papaina soluzione (costituita in HBSS) <table border="1"><tbody><tr><td> Ingrediente </td><td> Concentrazione finale </td></tr><tr><td> Papaina </td><td> 1,54 mg / mL </td></tr><tr><td> L-cisteina </td><td> 360 mg / ml </td></tr></tbody></table> DRG Collagenasi Una soluzione (costituita in HBSS) <table border="1"><tbody><tr><td> Ingrediente </td><td> Concentrazione finale </td></tr><tr><td> Collagenasi A </td><td> 4 mg / mL </td></tr></tbody></table>

derivazione di arricchito culture oligodendrociti e degli oligodendrociti / neuron mielinizzanti co-culture di tessuti murini post-natale

Derivation of Enriched Oligodendrocyte Cultures and Oligodendrocyte/Neuron Myelinating Co-cultures from Post-natal Murine Tissues

Identificare i meccanismi molecolari alla base dello sviluppo OL non solo è fondamentale per approfondire la nostra conoscenza della biologia OL, ma ha anche implicazioni per la comprensione della patogenesi delle malattie demielinizzanti come la sclerosi multipla (SM). Sviluppo cellulare è comunemente studiate con modelli di colture cellulari primarie. Colture cellulari primarie facilita la valutazione di un dato tipo di cellula, fornendo un ambiente controllato, privo di variabili estranee che sono presenti in vivo. Mentre le culture OL derivati ​​da ratti hanno fornito una grande quantità di conoscenza nella biologia OL, iniziative analoghe a stabilire culture OL dai topi è stata accolta con grandi ostacoli. Lo sviluppo di metodi di cultura OL murino primario è indispensabile al fine di sfruttare le linee disponibili nel topo transgenico. Diversi metodi per l&#39;estrazione di OPC da tessuto roditori sono state descritte, che vanno dalla derivazione neurosfere, adesione purificazione differenziale e immunopurification 1-3. Mentre molti metodi offrire il successo, la maggior parte richiedono tempi di cultura vasta e / o attrezzature costose / reagenti. Per aggirare questo, purificando OPC da tessuti murini con un adattamento del metodo originariamente descritto da McCarthy &amp; de Vellis 2 è preferito. Questo metodo comporta fisicamente OPC separazione da una coltura mista gliali derivati ​​da cortecce roditori neonatale. Il risultato è una popolazione purificata OPC che possono essere differenziati in un OL-arricchito la cultura. Questo approccio è attraente per la sua cultura tempo relativamente breve e il requisito necessario per fattori di crescita o anticorpi immunopanning. Durante l&#39;esplorazione dei meccanismi di sviluppo OL in una cultura purificato è informativa, non fornisce l&#39;ambiente più fisiologicamente rilevanti per valutare la formazione di guaina mielinica. Co-coltura OLS con i neuroni darebbe comprensione delle basi molecolari che regolano OL-mediata mielinizzazione degli assoni. Per molti OL / neuroni co-coltura studi, i neuroni dei gangli della radice dorsale (DRGNs) hanno dimostrato di essere il tipo neurone di scelta. Sono ideali per co-coltura con OLS per la loro facilità di estrazione, quantità minima di cellule contaminanti, e la formazione di posti letto dei neuriti denso. Mentre gli studi utilizzando ratto / topo mielinizzanti xenocultures sono stati pubblicati 4-6, un metodo per la derivazione di tale OL / DRGN mielinizzanti co-culture post-natale dei tessuti murino non è stata descritta. Qui vi presentiamo metodi dettagliate su come produrre in modo efficace tali colture, insieme a esempi di risultati attesi. Questi metodi sono utili per affrontare questioni rilevanti per lo sviluppo OL / funzione mielinizzanti, e sono strumenti utili nel campo delle neuroscienze.

Questo articolo descrive i metodi per ricavare le popolazioni murine arricchito di cellule precursori degli oligodendrociti (OPC) in colture primarie, che differenziano per produrre oligodendrociti maturi (OLS). Inoltre, questo rapporto descrive le tecniche per produrre murino mielinizzanti co-colture da semina OPC del mouse su un letto neurite dei neuroni dei gangli spinali del mouse (DRGNs).

Derivazione di Arricchito Culture oligodendrociti e degli oligodendrociti / Neuron mielinizzanti co-culture di tessuti murini post-natale

Identifying the molecular mechanisms underlying OL development is not only critical to furthering our knowledge of OL biology, but also has implications ...

Ciao, sono Ryan O'Mara, studente di dottorato presso l'Università di Ottawa e l'Ottawa Hospital Research Institute. Questo protocollo descriverà i metodi per ottenere popolazioni arricchite di cellule precursori oligodendrocitiche da topi, che possono essere differenziate singolarmente o in combinazione con neuroni del ganglio della radice dorsale di topo per produrre colture mielinizzanti. Iniziamo con una breve panoramica della procedura.I tessuti di topo neonato vengono dissociati e seminati in fiaschi T25. Dopo un periodo di coltura di nove giorni, si forma un monostrato di astrociti sulla base del fiasco, all'interno del quale proliferano le cellule precursori degli oligodendrociti. Le cellule precursori degli oligodendrociti vengono quindi ottenute, purificate e successivamente differenziate in oligodendrociti maturi mediante una coltura arricchita.Se si desiderano colture co-mielinizzanti, i neuroni dei gangli delle radici dorsali di topi da P5 a P10 vengono coltivati insieme alle colture gliali miste. Nel corso di nove giorni, questi neuroni formano un denso letto di neuriti sul quale possono essere seminate le cellule precursori degli oligodendrociti.Questo permette l'avvolgimento dei neuriti mediato dagli oligodendrociti, risultando così in una coltura mielinizzante a freddo. Innanzitutto, interi cervelli di topi da P zero a P due vengono posti in MEM ghiacciato e trasferiti al microscopio per dissezione; utilizzando un bisturi, effettuare un taglio longitudinale attraverso lo strato meningeo di ciascuna corteccia, quindi staccare delicatamente le meningi dalla corteccia sottostante. Successivamente, rimuovere i bulbi olfattivi con il cervello posizionato con la faccia ventrale verso l'alto.Eseguire incisioni longitudinali profonde nei punti in cui le cortecce si incontrano con il cefalo ventrale. Con il cervello posizionato con il lato dorsale rivolto verso l'alto, staccare le cortecce, quindi tagliare il cordis in circa quattro pezzi ciascuno. Trasferire le cortecce in un tubo conico da 15 millilitri contenente 350 microlitri di MEM freddo su ghiaccio per ogni cervello.I cervelli dello stesso genotipo vengono raggruppati nello stesso tubo, in modo che quattro cervelli richiedano 1400 microlitri di MEM. Al termine della dissezione, trasferire i cervelli raggruppati in un bagno termico a 37 gradi per tre minuti. Successivamente, in una cappa sterile per colture cellulari, far passare i pezzi di cervello attraverso una punta per pipetta P1000 per frammentarli in pezzi più piccoli.Aggiungere 75 microlitri di OPC Pap pain preriscaldato per cervello al tubo conico. Quindi incubare in un bagno d'acqua a 37 gradi per 20 minuti, capovolgendo il tubo ogni due minuti per prevenire l'aggregazione del tessuto.Al termine dell'incubazione, aggiungere due millilitri di coltura mista di cellule gliali per cervello al digestato e lasciare in riposo per 10 minuti. Dopo 10 minuti, aliquotare la sospensione tissutale in provette di plastica da cinque millilitri.Il numero di provette deve corrispondere al numero di cervelli nella preparazione. Utilizzando una pipetta di vetro Pasteur lucidata a fiamma, agitare delicatamente il contenuto di ciascuna provetta all'inizio, quindi con intensità crescente man mano che i pezzi iniziano a dissociarsi. Interrompere l'agitazione quando non rimangono più frammenti visibili di tessuto nella sospensione. Riunire il contenuto di ogni provetta in una provetta conica da 50 millilitri contenente quattro millilitri di coltura mista di cellule gliali.Agitare delicatamente il tubo capovolgendolo più volte, quindi trasferire l’aliquota della sospensione cellulare in tubi conici da 15 millilitri. Il numero di tubi deve corrispondere al numero di cervelli nella preparazione. Centrifugare i tubi a 300 ×g per cinque minuti e risospendere i pellet in un millilitro di mezzo di coltura per glia mista. Aggiungere le cellule risospese da ciascun tubo conico in flaconi T25 rivestiti con poli-L-lisina, che sono stati precedentemente equilibrati con cinque millilitri di mezzo di coltura per glia mista.Il numero di fiasche deve corrispondere al numero di cervelli dissezionati. Incubare le fiasche in un incubatore a 37 gradi con 8,5% di CO2. Dopo tre o quattro ore, le cellule dovrebbero essersi attaccate al substrato. Tuttavia, sarà ancora presente molto detrito nel mezzo, che potrebbe compromettere negativamente la vitalità cellulare.Per evitare ciò, sostituisci il mezzo dopo tre o quattro ore con del mezzo fresco per colture gliali miste, se possibile. Questo cambio di mezzo rimuove gran parte dei detriti cellulari. Il giorno successivo.Dovrebbero essere evidenti molte cellule alla base della fiasca. Al terzo giorno, dovrebbe formarsi un monostrato di astrociti alla base della fiasca. A questo punto, effettuare un cambio dei mezzi pari ai due terzi rimuovendo quattro millilitri di mezzo e aggiungendo nuovamente quattro millilitri di mezzo fresco.Questo passaggio deve essere ripetuto ogni tre giorni. Al sesto giorno, un monostrato di astrociti dovrebbe essere chiaramente visibile, al di sopra del quale le cellule precursori degli oligodendrociti stanno proliferando. A questo punto, integrare il mezzo di coltura con l'insulina a una concentrazione finale di cinque microgrammi per millilitro; al nono giorno, le cellule precursori degli oligodendrociti sono pronte per essere separate dal monostrato di astrociti.Per fare ciò, posizionare i flaconi su un agitatore orbitale e all'interno di un incubatore con 5%CO2. Lasciare che il flacone raggiunga l'equilibrio con l'incubatore per un'ora. Successivamente, agitare le cellule a 50 giri al minuto per 45 minuti.Questo passaggio elimina molte cellule contaminanti debolmente aderenti. Eseguire un completo cambio di mezzo rimosso tutto il mezzo e aggiungendo nuovamente quattro millilitri di mezzo di coltura fresco. Riposizionare il matraccio in un incubatore con 5%CO2 e lasciare equilibrare per tre ore.Al termine delle tre ore, verificare il colore del mezzo di coltura. Il mezzo di coltura deve essere rosso, indicando un pH equilibrato. Se il colore tende all'arancione o al viola, regolare in modo appropriato il livello di CO2 nell'incubatrice.Il mantenimento di un pH equilibrato è importante per la sopravvivenza delle cellule precursori oligodendrocitiche durante l'agitazione notturna. Una volta raggiunto un pH equilibrato, agitare il matraccio a 220 giri al minuto per circa 16 ore. La mattina seguente, rimuovere il matraccio dall'agitatore e trasferire il mezzo dai matracci a piastre per colture cellulari da 10 centimetri.Queste piastre serviranno per ulteriori purificazioni delle cellule precursori degli oligodendrociti mediante adesione differenziale. Ogni piastra deve ricevere il mezzo da due fiasche; incubare le piastre a 5% di CO2 per 30 minuti. Al minuto 15, agitare delicatamente ciascuna piastra per impedire alle cellule precursori degli oligodendrociti di aderire alla plastica.Dopo l'incubazione di 30 minuti, esaminare le piastre in contrasto di fase. I precursori degli oligodendrociti sono evidenti come piccoli ammassi cellulari. Alcune di queste cellule potrebbero essersi attaccate alla piastra.Allentare delicatamente le cellule precursori degli oligodendrociti aderenti alla piastra mediante agitazione leggera. Fare attenzione: un'agitazione eccessiva potrebbe causare l'allentamento dei tipi cellulari contaminanti.Trasferire la sospensione cellulare in una provetta conica da 15 millilitri e centrifugare a 300 ×g per cinque minuti. Risospendere delicatamente il pellet utilizzando una punta per pipetta P1000. Successivamente, contare le cellule con un emocitometro utilizzando una punta per pipetta P200; gli oligodendrociti purificati possono quindi essere seminati su coprivetri rivestiti con laminina per differenziarli in colture arricchite di oligodendrociti al giorno uno.Dopo la semina, le cellule precursori degli oligodendrociti arricchite presentano una morfologia relativamente semplice, con l'estensione di pochi prolungamenti. Al terzo giorno, gli oligodendrociti in differenziamento hanno sviluppato numerosi prolungamenti, simili a quelli degli oligodendrociti immaturi. Al sesto giorno, gli oligodendrociti hanno esteso lamine membranose simili alla mielina in qualsiasi momento durante questo periodo.Le lamelle di copertura del coltura possono essere fissate ed elaborate per l'immunocitochimica. Invece di seminare le cellule precursori di oligodendrociti purificate su lamelle rivestite con laminina, queste possono essere seminate su letti di neuriti di gangli della radice dorsale per produrre colture co-mielinizzanti. La prossima sezione descriverà i metodi per produrre queste colture.Per iniziare, isolare le intere spine dorsali da topi P5-P10 e trasferirle su un microscopio stereoscopico con forbici da dissezione. Tagliare longitudinalmente la regione mediale ventrale della spina dorsale. Rimuovere con cura i gangli delle radici dorsali, o DRG, utilizzando pinzette a punta fine in quattro passaggi.Trasferire i gangli in una soluzione salina tamponata di Hank in una piastra di Petri. Tagliare le radici eccessivamente lunghe di qualsiasi DRG. Utilizzando una punta per pipetta P 1000 con becco largo.Trasferire i gangli in una provetta centrifuga da 1,5 millilitri. Mantenere la provetta sul ghiaccio fino al termine dell'elaborazione di tutti i topi. Al termine dell'isolamento dei gangli della radice dorsale, centrifugare la provetta a circa 300 ×g.Trasferire il tubo in una cappa sterile per colture cellulari e rimuovere il soprannatante. Aggiungere 500 microlitri di papaina DRG preriscaldata al tubo e incubare in un bagno d'acqua a 37 gradi per 10 minuti. Al termine della digestione con pepina, centrifugare, quindi sostituire la soluzione di papaina.Con 500 microlitri di soluzione di collagenasi A, incubare a 37 gradi per 10 minuti. Ripetere il passaggio di centrifugazione e sostituire la soluzione di collagenasi A con un millilitro di mezzo di coltura DRGN. Dopo l'ultimo passaggio di centrifugazione, aggiungere un millilitro di mezzo DRGN e, utilizzando una pipetta di vetro pastorizzata alla fiamma, tri.Valutare i gangli lentamente all'inizio, quindi con intensità crescente man mano che il tessuto inizia a dissociarsi. Una volta che non sono più visibili frammenti di tessuto, trasferire la sospensione cellulare in una piastra di Petri contenente sette millilitri di mezzo DRGN. Incubare la piastra in un incubatore a 37 gradi e 8,5% di CO2 per un'ora e un quarto.Dopo questo periodo di incubazione, osservare la piastra di Petri. In contrasto di fase, i neuroni dei gangli della radice dorsale si evidenziano come cellule con corpo cellulare di grandi dimensioni. Molte cellule contaminanti dovrebbero essere saldamente aderenti alla piastra di Petri.Trasferire il mezzo in una provetta conica da 15 millilitri e risciacquare la piastra con quattro millilitri di mezzo DRGN per raccogliere eventuali neuroni rimanenti. Centrifugare la provetta conica a 300 ×g per cinque minuti. Ri-sospendere il pellet risultante in 500 microlitri di mezzo DRGN.Contare le cellule utilizzando un citometro HEO. Assicurarsi di contare solo i neuroni del ganglio della radice dorsale, seminando da 30 a 50.000 neuroni per ogni coprivetrino da 12 millimetri rivestito con laminina in un millilitro di mezzo di coltura DRGN. Incubare le cellule in un incubatore per colture cellulari con 8,5% di CO2.Il mattino successivo effettuare un completo cambio di mezzo sostituendo il mezzo DRGN con mezzo OL integrato con 10 micromolari di FUD R ogni due giorni. Successivamente, effettuare un cambio di tre quarti del mezzo con mezzo OL supplementato con FUD r. Quando esaminati al microscopio a contrasto di fase al primo giorno, i neuroni hanno iniziato a estendere alcuni prolungamenti. Al terzo giorno, i prolungamenti neuronali si sono allungati.Al sesto giorno, si è sviluppato un letto di neuriti composto da numerosi processi intrecciati. Al nono giorno, questo letto di neuriti è aumentato in densità ed è pronto per ricevere oligodendrociti dalle colture cerebrali miste in crescita. Parallelamente alle colture di neuroni, le cellule precursori di oligodendrociti possono essere purificate al nono giorno delle colture neuronali.Possono quindi essere seminati sui letti di neuriti, aggiungendo 50.000 cellule a ciascun pozzetto di una piastra a 24 pozzetti. Al sesto giorno di coltura cellulare in co-coltura, si possono osservare cellule simili ad oligodendrociti che interagiscono con i neuroni del ganglio della radice dorsale.Queste colture possono ora essere fissate e processate per immunoistochimica. Quando colture arricchite di oligodendrociti vengono marcate con anticorpi diretti contro i marcatori degli oligodendrociti, NG due mag e MVP, si evidenziano cellule immunologicamente positive che mostrano morfologie specifiche per stadio. Queste colture originano come una popolazione di precursori oligodendrocitari NG due positivi e, nel corso dei sei giorni di differenziazione, producono oligodendrociti maturi mag positivi.Quando si esegue una SDS-PAGE su lisati ottenuti da colture arricchite in oligodendrociti, si osserva che gli oligodendrociti esprimono CNPP e MVP durante il corso di sei giorni. Osservando i neuroni del ganglio radicolare dorsale prima dell'aggiunta di oligodendrociti, si evidenziano a giorno nove letti di neuriti densi per Taj1 e positivi per neurofilamenti. A giorno sei della co-coltura di oligodendrociti e neuroni del ganglio radicolare dorsale, molti oligodendrociti positivi per MBP possono essere osservati in interazione con le neuriti neuronali a ingrandimento maggiore.Si osserva che gli oligodendrociti avvolgono questi neuriti con una membrana positiva per MBP, simile alla mielinizzazione; una vista ingrandita digitalmente mostra il grado di sovrapposizione della membrana positiva per MVP sul prolungamento positivo per neurofilamenti. Ciao, sono Scott Ryan, ricercatore postdottorato presso l'Istituto di Ricerca dell'Ottawa Hospital. Queste tecniche forniscono un metodo per generare sistemi di co-coltura di legamento, endociti e neuroni del ganglio dorsale da topi.Questa tecnica è utile per lo studio di modelli sperimentali indotti e modelli transgenici di malattie mielinizzanti. È inoltre efficace per lo screening di nuovi composti terapeutici.

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