Monitoraggio del sistema ubiquitina-proteasoma attività nelle cellule viventi Utilizzando una degron (dgn)-destabilizzato proteina verde fluorescente (GFP) a base di proteine ​​Reporter

L'obiettivo generale di questa procedura è misurare l'attività del proteasoma in cellule vive utilizzando una proteina di fusione GFP-Deron. Innanzitutto, clonare gli oligonucleotidi personalizzati per Deron e per la mutazione da slittamento della cornice di lettura di Deron. Inserire nel vettore P-E-G-F-P-C1 e proseguire con i protocolli per il sistema Gateway in Vitrogen, quindi produrre virus per ciascun costrutto utilizzando cellule HEK 293 FT. Dopo aver determinato il titolo, trasdurre le cellule con il virus ed applicare la selezione antibiotica, quindi espandere le cellule stabili risultanti che esprimono GFP-DRON o GFP-Dron con slittamento della cornice di lettura.

Questa tecnica facilita esperimenti che monitorano le risposte cellulari a trattamenti specifici mediante misurazioni del segnale di fluorescenza. Ad esempio, l'attività del proteasoma può essere facilmente valutata utilizzando la microscopia a fluorescenza in epifluorescenza o la citometria a flusso. Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come i saggi luminogenici o fluorogenici che utilizzano acidi interi di cellule, è che l'attività del proteasoma viene misurata in cellule vive. Per la trasfezione, diluire 36 microlitri del reagente lipo 2000 in 1,5 millilitri di DMEM; in un altro tubo falcon da 15 millilitri, diluire le costruzioni di DNA in 1,5 millilitri di DMEM.

Dopo cinque minuti, unire i due componenti e incubare per 20 minuti a temperatura ambiente. Sostituire ora il mezzo di una coltura confluenziale di cellule HEK 293 FT in un fiasco T75 con sette millilitri di DMEM. Quindi aggiungere la miscela DNA-lipo al fiasco e mescolare agitandolo avanti e indietro.

Incubare il matraccio durante la notte a 37 gradi Celsius in un incubatore con 5% di CO2 umidificato. Il giorno successivo sostituire il mezzo con 10 millilitri di DMEM. Dopo 48 ore, raccogliere il sopranatante. Filtrare il sopranatante contenente il virus attraverso un filtro in PVDF da 0,45 micrometri.

Per concentrare il virus, aggiungere un volume di soluzione PEG a quattro volumi di sopranatante e incubare per due ore a quattro gradi Celsius con mescolamento periodico mediante inversione. Raccogliere il virus mediante centrifugazione dopo aver aspirato l'SNA del pellet bianco; centrifugare nuovamente per rimuovere qualsiasi residua soluzione PEG. Risospendere il pellet finale in PBS mediante Peppe, quindi vortexare energicamente per 20-30 secondi.

Conservare aliquote di 100 microlitri di virus a meno 80 gradi centigradi. Seminare cellule U2 OS in piastre a sei pozzetti e incubare durante la notte. Per la trasfezione, sostituire il mezzo di coltura con un millilitro di DMEM contenente otto microgrammi per millilitro. Polibrene, mettere da parte un pozzetto come controllo positivo e testare una serie di concentrazioni virali nei pozzetti rimanenti.

Incubare per tutta la notte il giorno seguente. Sostituire il mezzo con due millilitri di DMEM e incubare per 24 ore. Iniziare la selezione con 10 microgrammi per millilitro di blasticina e continuare a sostituire il mezzo contenente l'antibiotico ogni secondo giorno.

Circa sei o sette giorni dopo, verificare la morte cellulare delle cellule non trasdotte. Quindi lavare le cellule tre volte con PBS per colorarle. Coprire con violetto cristallo e incubare per cinque-dieci minuti a temperatura ambiente, quindi aspirare il colorante, risciacquare la piastra due volte con acqua bidistillata e far asciugare la piastra all'aria.

Infine, contare le colonie per calcolare le unità di trasfezione del virus per millilitro. Seminare fibroblasti diploidi umani in piastre a sei pozzetti con otto microgrammi per millilitro di polibrene come potenziatore della trasduzione.

Utilizzare una molteplicità di infezione pari a due in un volume totale di un millilitro. Cambiare il mezzo. Il giorno successivo, quando la coltura è confluenza al 70-80%.

Iniziare la selezione cronica con 10 microgrammi per millilitro. Nel corso dei giorni, monitorare la morte cellulare completata, indicando che la selezione è terminata. Espandere le cellule transdotte in modo stabile per generare una linea cellulare stabile che esprima le proteine di fusione GFP DERON o GFP Deron Frameshift. Iniziare seminando le cellule che esprimono GFP DRON o GFP DRON frameshift il giorno successivo, tre ore prima dei fatti.

Trattare le cellule di controllo con un inibitore dei protosomi. Lavare due volte con PBS e raccogliere le cellule utilizzando 0,5 millilitri di tripsina. Per arrestare la tripsina.

Utilizzare 4,5 millilitri di mezzo di coltura e trasferire le cellule in un Falcon da 15 millilitri. Raccogliere le cellule mediante centrifugazione. Dopo un lavaggio con PBS, risospendere il pellet in 400 microlitri di buffer fax. Trasferire le cellule in provette fax e porre sul ghiaccio.

Ora misurare i campioni mediante citometria a flusso. La proteina fusione GFP Deron porta una sequenza che è indirizzata al proteasoma per una degradazione immediata. Al contrario, il mutante con slittamento della cornice di lettura GFP Deron FS non viene degradato dai proteasomi.

Pertanto, quando vengono trasdotti con GFP Deron, i fibroblasti umani giovani, che presentano un'attività proteasomica elevata, mostrano un segnale fluorescente basso in microscopia a fluorescenza episcopica. Le stesse cellule trasdotte con GFP Deron Frameshift mostrano il 39,7% di cellule positive. Il trattamento delle cellule con l'inibitore del proteasoma ll e L determina un aumento del segnale fino a un massimo di circa il 63% sia nelle cellule GFP dron che in quelle GFP Dron frameshift.

Misure simili effettuate su fibroblasti dermici, isolati da donatori giovani, di mezza età e anziani, rivelano un aumento netto del segnale GFP tra individui giovani e donatori di mezza età, indicando una diminuzione dell'attività del proteasoma nei campioni ottenuti da donatori anziani. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come produrre particelle lentivirali, trasfettare le cellule e determinare l'attività del proteasoma in cellule vive.