Costruzione di un laser a basso costo del sistema assotomia per studiare la rigenerazione assonale nel C. elegans
15 novembre 2011
Laser assotomia seguito da time-lapse imaging è un modo sensibile al test gli effetti delle mutazioni in C. elegans Sulla rigenerazione degli assoni. Una qualità elevata, ma economico, sistema di ablazione laser possono essere facilmente aggiunti alla maggior parte dei microscopi. Passa il tempo di imaging più di 15 ore richiede un'attenta immobilizzazione del worm.
L'obiettivo generale di questa procedura è mostrare come assemblare e allineare un sistema di ablazione laser per studiare la rigenerazione degli assoni nei gan CL. Ciò si ottiene montando prima un pressacavo laser, un polarizzatore Thompson, una piastra a mezza onda, uno specchio girevole, una guida periscopica e uno specchio a binario su una breadboard. Il passo successivo della procedura consiste nell'allineare il raggio laser al raggio in uscita dalla lente del condensatore del microscopio.
Quindi la lente di espansione del raggio laser montata, allineata e posizionata per centrare il raggio laser e renderlo zero divergente. Il passaggio finale della procedura consiste nel rendere il punto di ablazione laser congruente con la messa a fuoco dell'immagine effettuando regolazioni fini. In definitiva, è possibile tagliare con precisione gli assoni di mezzo micron con un danno tissutale collaterale minimo utilizzando il raggio laser a diffrazione limitata quando l'allineamento XY NC è imperfetto.
Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come i laser a femto secondi, è che è relativamente economica a 15.000. È relativamente esente da manutenzione e fornisce un taglio degli assoni molto preciso. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulla rigenerazione degli assoni dell'elgano marino, può essere applicato anche ad altri sistemi come mosche, topi zebrafish, sistema nervoso periferico e cellule in vitro.
Fondamentalmente qualsiasi cella che si trovi entro 30-50 micrometri dalla superficie. Inizia con i componenti posizionati sulla breadboard e imbullona il perno del periscopio laser e i supporti del binario rialzati. Questo sistema utilizza un laser di classe tre B che può facilmente danneggiare gli occhi, quindi si prega di prendere sul serio la sicurezza laser.
Parla con qualcuno del tuo dipartimento di fisica locale su come lavorare con i laser a raggio libero in sicurezza. Sempre durante il processo di allineamento, impostare il laser alla potenza più bassa. Quando guardi attraverso gli oculari, assicurati che il laser sia chiuso meccanicamente e che il laser sia spento.
Ora, posiziona prima il microscopio, allinealo con l'asse del binario. In secondo luogo, allinearlo con il raggio di luce trasmesso dalla lente del condensatore del microscopio. In terzo luogo, allineare entrambe le estremità del binario al fascio del condensatore utilizzando un'apertura regolabile o una lente fissata al binario.
Utilizzare una livella e martinetti da laboratorio per regolare l'altezza del binario prima di procedere. Assicurarsi che entrambe le estremità del binario siano allineate. Ora, assicurati che il raggio laser passi attraverso il premistoppa, il polarizzatore Thompson e la piastra a metà strada e non colpisca i bordi ruotando.
La piastra intermedia regolerà la potenza del laser con tutti i componenti fissati alla breadboard. Accendere il laser, impostare la frequenza dell'impulso in modalità continua 100 e ridurre al minimo la potenza utilizzando la piastra a metà. Usa un post-it o un foglio di carta per lenti per visualizzare il raggio laser.
Ora per portare il raggio laser verso l'alto dalla breadboard. Regolare e fissare gli specchi montati cinematicamente in sequenza dal laser per portare il raggio fino allo specchio montato all'estremità del binario rialzato. Al termine, il raggio laser deve essere allineato approssimativamente al centro degli specchi e gli specchi devono essere orientati di circa 45 gradi rispetto all'asse del raggio laser prima di allineare il raggio laser con il raggio di luce trasmessa del microscopio.
Rimuovere o aprire eventuali filtri ND e aperture nel modulo intermedio. Iniziamo ora la fase più critica per fornire un taglio preciso degli assoni senza eccessivi danni collaterali. Allineeremo il laser con precisione sugli assi x, y e Z alla potenza laser più bassa per ottenere il punto di ablazione più piccolo.
Il laser e i raggi di luce trasmessi possono essere visti contemporaneamente contro la carta. Posizionare la carta vicino alla porta del microscopio per iniziare. Ora inizia ad allineare il laser utilizzando le regolazioni di rotta sullo specchio sulla parte superiore del periscopio e sullo specchio all'estremità del binario.
Posizionare un foglio di carta tra la lente del condensatore allineata e la torretta dell'obiettivo aperta. Continuare a utilizzare le regolazioni di precisione sullo specchio del binario per allineare il raggio laser al centro del raggio di luce trasmessa più grande. Ora, fissa il microscopio in posizione con i morsetti.
Ulteriori passaggi per valutare l'allineamento del laser si trovano nel manoscritto scritto. È necessario installare doppi espansori di fascio galileiano per espandere il raggio laser da 300 micron di 33 volte per riempire l'apertura posteriore dell'obiettivo da 10 millimetri. Inizia montando le quattro lenti sui supporti.
Quindi attacca le lenti al binario in modo che siano tutte sullo stesso asse ottico ed esattamente ortogonali al raggio laser. Accendere il laser e regolarlo alla potenza minima e alla modalità continua. Regolare approssimativamente l'allineamento del raggio attraverso ciascuna lente.
Usa la carta per vedere il raggio. Ora spegni il laser. Applicare un otturatore di sicurezza al laser e rimuovere il microscopio dal percorso del raggio laser.
Riaccendi il laser e visualizzalo contro un muro vicino. Utilizzare la regolazione fine delle lenti per espandere il fascio. Quindi regolare gli ultimi due specchi montati cinematicamente per allineare il raggio in un cerchio di luminosità uniforme nella posizione stimata dell'apertura posteriore dell'obiettivo.
Visualizza le dimensioni e l'uniformità del raggio rispetto alla carta. Quindi regolare il raggio a convergenza zero notando come cambia la dimensione del raggio man mano che la carta si allontana dall'obiettivo. Spegnere il laser e innestare l'otturatore meccanico.
Far scorrere nuovamente il microscopio nel percorso del raggio laser utilizzando i morsetti fissi per definire il corretto allineamento. Riposizionare i morsetti sul lato libero del microscopio, ma non serrarli. Ora accendi il laser.
Rimuovere l'otturatore di sicurezza e ruotare la torretta dell'obiettivo in posizione aperta utilizzando della carta sul tavolino e dovrebbe essere visibile un raggio laser espanso e uniforme centrato sul raggio di luce trasmesso dal condensatore. Se non centrati, centrare i raggi allentando i morsetti del microscopio e spingendo con cautela il microscopio. Ora attiva l'otturatore di sicurezza e imposta il laser in modalità di attivazione.
Ruota l'obiettivo di 60 volte in posizione. Ora l'immagine dei graffi superficiali su una diapositiva di destinazione. Rimuovere l'otturatore di sicurezza, attivare il laser di ablazione e regolare la potenza del laser per il punto di ablazione minimo.
Il punto dovrebbe essere circolare e compreso tra cinque e 10 micron dal centro dell'immagine, dal centro, dal punto di ablazione. Utilizzando le regolazioni di precisione dello specchio a binario montato cinematicamente per mantenere il punto centrato e il profilo del raggio uniforme, sarà necessario regolare iterativamente lo specchio montato su guida e lo specchio periscopico superiore. Valuta la messa a fuoco Z del laser spostando la messa a fuoco su e giù sistematicamente in incrementi di un micron attivando il laser di ablazione ad ogni passo.
Se il raggio è correttamente espanso e allineato e con una convergenza regolata correttamente, dovrebbe ablare al massimo al fuoco dell'immagine e debole o per niente, un micron sopra o sotto la messa a fuoco. Se il punto di ablazione massimo è al di sopra o al di sotto del fuoco dell'immagine, effettuare le regolazioni finali al fuoco Z del raggio espanso spostando la lente L tre del telescopio galileiano fino a quando l'ablazione laser non è congruente con il fuoco dell'immagine. I nematodi sono stati montati su un vetrino personalizzato e gli assoni sono stati ablati utilizzando il sistema costruito. L'esosomia laser e l'imaging time-lapse della rigenerazione degli assoni sono risultati molto robusti.
Utilizzando un tavolino motorizzato, è stato possibile tagliare e visualizzare in modo sistematico e preciso cinque assoni in cinque animali diversi. Su una singola diapositiva. Il tempo di imaging per gli assoni è stato il fattore limitante.
Circa il 10% degli esperimenti ha prodotto filmati time-lapse di alta qualità. Gli esperimenti rimanenti hanno tutti fornito buoni dati, ma erano esteticamente meno attraenti a causa dei piccoli movimenti di jittering del verme che generalmente iniziavano dopo cinque-otto ore di immobilizzazione. Durante il tentativo di questa procedura, è sempre importante valutare con precisione l'allineamento del laser sugli assi x, y e z.
Il problema più comune che le persone hanno cercando di tagliare gli assoni è il danno collaterale o la completa incapacità di tagliare gli assoni, e questo è quasi sempre dovuto a un laser disallineato. Questo sistema di ablazione laser e la tecnica per visualizzare la rigenerazione degli assoni in c Agains ti permetteranno di valutare regolarmente l'effetto di qualsiasi mutazione genetica sulla rigenerazione degli assoni. NCL Contro.
Panoramica
Questo articolo descrive un metodo per assemblare e allineare un sistema di ablazione laser per lo studio della rigenerazione degli assoni in C. elegans. La tecnica permette di tagliare con precisione gli assoni con danni collaterali minimi, rendendola uno strumento prezioso per i ricercatori nel campo delle neuroscienze.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Biophysica
- Biologia cellulare
Sfondo
- La rigenerazione degli assoni è fondamentale per comprendere i meccanismi di riparazione neuronale.
- I metodi tradizionali di sezione degli assoni possono causare danni collaterali significativi.
- L'ablazione laser offre un'alternativa precisa per lo studio della rigenerazione.
- C. elegans funge da organismo modello per l'indagine di questi processi.
Scopo dello studio
- Dimostrare il montaggio e l'allineamento di un sistema di ablazione laser.
- Fornire un protocollo per lo studio della rigenerazione degli assoni in C. elegans.
- Evidenziare i vantaggi di questo metodo rispetto alle tecniche esistenti.
Metodi Utilizzati
- Assemblaggio dei componenti del laser su un basamento ottico.
- Allineamento del fascio laser con il percorso ottico del microscopio.
- Utilizzo di un laser di classe 3B per il taglio preciso dell'assone.
- Acquisizione di immagini in time-lapse per monitorare la rigenerazione dell'assone nell'arco di 15 ore.
Risultati principali
- Il sistema di ablazione laser permette di tagliare gli assoni con danni minimi.
- L'allineamento preciso è fondamentale per ottenere risultati ottimali.
- Il metodo può essere adattato per l'uso in diversi organismi modello.
- L'immagine a intervalli di tempo cattura efficacemente il processo di rigenerazione.
Conclusioni
- Questa tecnica di ablazione laser è uno strumento economico per la ricerca in neuroscienze.
- Fornisce informazioni sui meccanismi di rigenerazione degli assoni.
- L'adattabilità del metodo lo rende adatto a una vasta gamma di sistemi biologici.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
I sistemi economici di assezione laser permettono un'analisi quantitativa e scalabile dei meccanismi di rigenerazione degli assoni in organismi modello trasparenti. Questo approccio supporta la validazione precoce delle target e la riduzione del rischio meccanicistico nei portafogli di neuro-rigenerazione, fornendo modelli di lesione precisi e riproducibili. L'economicità e l'adattabilità del sistema facilitano un'adozione più ampia tra i gruppi di ricerca, accelerando studi basati su ipotesi nel campo della riparazione neurale.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Bersaglio
- Permette una lesione controllata dell'assone per la validazione funzionale delle vie di rigenerazione.
- Consente una riduzione meccanicistica dei rischi minimizzando gli effetti collaterali sui tessuti durante l'assotomia.
- Facilita un rapido test delle ipotesi su interventi genetici o farmacologici nella riparazione neurale.
Sviluppo di screening e saggi
- Fornisce un saggio standardizzato e riproducibile per la quantificazione dei fenotipi di rigenerazione assonale.
- Consente un'ablazione ad alta precisione con variabilità minima, supportando flussi di lavoro robusti per lo screening.
- Permette l'integrazione con l'acquisizione temporale di immagini, consentendo una valutazione dinamica delle risposte rigenerative.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Offre una piattaforma adattabile a diversi sistemi modello, sostenendo la continuità traslazionale.
- Permette studi comparativi tra specie per la validazione preclinica di bersagli neuro- rigenerativi.
- Facilita l'allineamento degli esiti fenotipici con modelli di lesione neuronale rilevanti per la malattia.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questo sistema di assezione laser si inserisce nel percorso dalla scoperta precoce alla fase preclinica, consentendo studi iterativi di validazione del bersaglio e indagini meccanicistiche prima dell'identificazione del composto leader.
- Biologia della scoperta Supporta il test dell'ipotesi nulla e l'analisi dei percorsi molecolari nella rigenerazione neurale.
- Screening: Fornisce letture quantitative e riproducibili della rigenerazione assonale in diverse condizioni sperimentali.
- Analitica: Consente una misurazione precisa degli esiti rigenerativi e il confronto statistico tra interventi.
- Ricerca traslazionale Facilita l'adattamento a diversi organismi modello per la validazione interspecie.
- Riutilizzo aziendale: Fornisce una piattaforma modulare ed economica per un uso ripetuto in neurobiologia&D programmi.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva nei bersagli di riparazione neurale consentendo modelli di lesione precisi e quantitativi.
- Valore operativo: Riduce gli ostacoli tecnici ed economici agli studi ad alto rendimento sulla rigenerazione degli assoni.
- Valore strategico: Migliora le decisioni di avanzamento o interruzione del progetto standardizzando la valutazione del fenotipo rigenerativo.
- Impatto sul portafoglio: Supporta la priorizzazione degli asset di neuro-rigenerazione in base al rischio attraverso una validazione precoce robusta.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nell'allineamento ottico e nelle procedure di sicurezza per l'uso del laser.
- Necessita dell'accesso a infrastrutture di base per la microscopia e il montaggio su basetta sperimentale.
- Esige una rigorosa standardizzazione tra i diversi gruppi di lavoro per ottenere condizioni di lesione e di imaging riproducibili.
- Adattabile a vari sistemi modello trasparenti entro 30–50 micron dalla superficie del tessuto.
- La precisione dipende da un accurato allineamento e da una regolare calibrazione per evitare danni collaterali.
