Culture Slice organotipica del mesencefalo ventrale embrionali: un sistema per studiare dopaminergici sviluppo neuronale In vitro

L'obiettivo generale di questa procedura è generare sezioni organotipiche dal mesencefalo embrionale di neuroni a 12,5 giorni di sviluppo (E 12.5) per l'analisi dei neuroni dopaminergici in via di sviluppo. Questo viene ottenuto prima dissezionando il cervello embrionale. Successivamente, il cervello viene incluso in agarosio a basso punto di fusione.

Il terzo passaggio consiste nel sezionare le fette cerebrali utilizzando un vibratomo. L'ultimo passaggio prevede la selezione della fetta cerebrale appropriata per la coltura e l'acquisizione di immagini in time-lapse. In definitiva, l'acquisizione di immagini in time-lapse e la microscopia a immunofluorescenza vengono utilizzate per mostrare le fasi iniziali dei neuroni dopaminergici, il comportamento migratorio e la differenziazione.

Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo dello sviluppo neurologico, come ad esempio seguire il comportamento neuronale e migratorio durante lo sviluppo della regione ventrale del cervello. Un giorno prima della dissezione, preparare un X soluzione tampone di Krebs e il mezzo di coltura secondo il manoscritto allegato, circa due ore prima della dissezione. Preparare 100 millilitri di agarosio a basso punto di fusione al 4% nel tampone di Krebs riscaldando la soluzione al microonde fino a quando l'agarosio si sarà completamente disciolto.

Quindi posizionare gli aros in un bagno d'acqua a 45 gradi Celsius. Successivamente, riempire il vassoio del tampone Vibram con tampone di Krebs ghiacciato. Accendere l'elemento di raffreddamento e mantenerlo a quattro gradi Celsius.

Successivamente, fissare una lama da rasoio nel portalametta. Preparare un bisturi, un pennello fine e un piccolo cucchiaio forato per raccogliere le sezioni nell'area del vibratomo per la successiva sezionatura. Quindi aggiungere il buffer di Krebs alle capsule di Petri sterili e mantenerle sul ghiaccio.

Nell'area di dissezione, preparare tre grandi piastre di Petri sterili per la dissezione e due piastre di Petri sterili più piccole per contenere una coppia di forbici, due paia di pinzette fini, un minipiatto forato, una pipetta di Pasteur in vetro con punta arrotondata e chiusa, ottenuta mediante flame polishing, e un litro di soluzione tampone di Krebs su ghiaccio. Pulire tutti gli strumenti di dissezione con etanolo al 70%. Successivamente, aggiungere il mezzo di coltura nei pozzetti di una piastra a sei pozzetti e incubare a 37 gradi Celsius per due ore.

Successivamente, aggiungere 1,5 millilitri di buffer di Krebs con penicillina-streptomicina in ciascun pozzetto di un’altra piastra a sei pozzetti in condizioni sterili. Posizionare gli inserti con membrana in milli-cellula nei pozzetti. Collocare la piastra a sei pozzetti accanto al vibratome in modo che le sezioni cerebrali possano essere trasferite sulle membrane filtranti.

Immediatamente dopo il sezionamento, sacrificare un topo femmina gravida con embrioni allo stadio E 12.5 e rimuovere l'utero sollevandolo con una pinzetta. Successivamente, utilizzare un'altra pinzetta per staccare il miometrio dall'utero. Dopodiché, posizionare l'utero in tampone di Krebs freddo sotto ghiaccio al microscopio.

Utilizzare una pinzetta fine per separare la parete muscolare dell'utero, la membrana di Riker e il sacco vitellino viscerale dall'embrione. Successivamente, rimuovere gli embrioni dall'utero e trasferire l'embrione in una piastra di Petri separata contenente soluzione tampone di Krebs sterile. Poi, tagliare la testa di ciascun embrione.

Fissare la testa perforandola a livello degli occhi con un paio di pinzette fini. Utilizzare un altro paio di pinzette per rimuovere con cura la pelle e il cranio. Quindi sollevare delicatamente il cervello e trasferirlo in una capsula di Petri contenente soluzione tampone di Krebs sterile.

Dopo di ciò, lavare i cervelli in agarosio a basso punto di fusione al 4%. Inserire due o tre cervelli alla volta in agarosio fresco a basso punto di fusione al 4%, utilizzando una pipetta di Pasteur con punta rotonda lucidata a fiamma.

Quindi posizionare le capsule per inclusione sul ghiaccio nel modo più orizzontale possibile. Successivamente, sollevare i cervelli fino a quando il fondo dell'aro è solidificato, in modo che i cervelli si assestino uniformemente e siano paralleli al fondo del blocco di aro. Quando l'aro si è completamente solidificato, tagliare l'aro circostante i cervelli.

Dopo aver incollato, fissare il blocco di agarosio sulla piattaforma del vibratomo. Durante l'incollaggio del blocco, assicurarsi che il lato ventrale del cervello sia parallelo alla piattaforma. Tagliare sezioni orizzontali spesse 300 micron con una frequenza di 50 hertz, un'ampiezza della lama di 1,1 millimetri e una velocità di 25 millimetri al secondo.

Raccogliere le sezioni cerebrali utilizzando un pennello fine per spingere la sezione verso un cucchiaio forato miniaturizzato. Successivamente, trasferirle in una capsula contenente soluzione di Krebs sterile e ghiacciata sotto il microscopio. Selezionare la sezione che contiene il tessuto del mesencefalo ventrale.

In questa fase, utilizzare un piccolo cucchiaio forato e un pennello fine per trasferire le sezioni cerebrali su inserti di membrana MilliCell posti in una piastra a sei pozzetti contenente tampone Krebs preparato in precedenza. Successivamente, trasferire le membrane con le sezioni in un'altra piastra a sei pozzetti contenente mezzo di coltura, mantenendo la superficie superiore delle membrane asciutta in modo che le sezioni cerebrali ricevano il mezzo dal basso e l'aria dall'alto.

Posizionare le sezioni in un incubatore con il 5% di anidride carbonica a 37 gradi Celsius. È molto importante che le sezioni vengano collocate nell'incubatore entro due ore dal primo passaggio della dissezione. Queste sezioni possono essere mantenute in vitro per tre o quattro giorni.

Dopo quattro o cinque ore di recupero, le sezioni possono essere utilizzate per l'acquisizione di immagini in time-lapse immediatamente prima dell'acquisizione. Aggiungere 1,5 microlitri di acido ascorbico 200 millimolari alla piastra per proteggere le sezioni dalla fototossicità.

Incubare le sezioni in una camera ambientale a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica durante l'acquisizione di immagini in time-lapse. Qui è mostrata una sezione acuta che evidenzia la posizione normale dei neuroni dopaminergici nel mesencefalo ventrale, in cui le proiezioni verso il proencefalo non si sono ancora sviluppate. Dopo un giorno in coltura, le proiezioni verso i proencefali iniziano a formarsi, come indicato dalla freccia gialla.

La freccia bianca indica la posizione dei corpi cellulari mostrati a maggiore ingrandimento negli insetti. Qui è visibile la radice migratoria dei neuroni marcati con YFP. In una sezione orizzontale acuta, la posizione iniziale delle cellule è indicata con una freccia rossa.

Dopo aver visionato questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come preparare sezioni genotipiche dal mesencefalo embrionale di topo a E 12,5 per ottenere sezioni vitali e integre. È fondamentale eseguire la dissezione del cervello embrionale con attenzione e, dopo la sezionatura al vibratomo, selezionare la sezione cerebrale corretta per la coltura e l'acquisizione di immagini in TimeLapse.