A seguito di Cell-destino E. coli Dopo l'infezione da fago lambda

L'obiettivo generale di questa procedura è utilizzare un microscopio a fluorescenza per seguire il solfato in e coli in tempo reale dopo l'infezione da parte del fago lambda. Iniziare creando un lisato grezzo del fago lambda. Successivamente, purificare il fago e infettare e coli con il fago lambda in un tubo.

Continuare a seguire il destino delle cellule batteriche al microscopio. In definitiva, i risultati possono mostrare in tempo reale diversi destini cellulari in e coli attraverso l'espressione di diverse proteine fluorescenti associate alla crescita o alla morte cellulare. In generale, un controllo di questo metodo consiste nella creazione di un ceppo puro e marcato di FI.

Per evitare la condivisione di plasmidi durante la preparazione e la purificazione, ottimizzare anche i parametri di imaging al microscopio per consentire una crescita cellulare sana. Inoculare una coltura notturna di E 3 92 Lambda LZ one PPL star D in mezzo LBM a una densità cellulare di OD 600 pari a circa 0,6 e indurre la lisi in un bagno a 42 gradi Celsius con agitazione.

Continuare l'incubazione a 37 gradi Celsius fino a quando la lisi è evidente. La coltura diventa limpida. Aggiungere ora cloroformio al 2% e quindi incubare per 15 minuti a temperatura ambiente.

Successivamente, trasferire il lisato fagico in bottiglie da 250 millilitri e centrifugare la coltura. Quindi recuperare il sopranatante contenente le particelle fagiche ed eseguire una seconda centrifugazione per rimuovere i detriti visibili seguendo protocolli standard di titolazione dei fagi. Misurare la concentrazione del fago, quindi purificare il fago mediante un gradiente di cloruro di cesio e saggia l'attività con DPI per la preparazione di lastre aro.

Pulire sei vetrini con etanolo al 70%. Disporre cinque vetrini come mostrato e fissarli con del nastro adesivo. Versare quindi una soluzione di aros al 1,5% nel mezzo sui vetrini fissati.

Posizionare l'ultimo vetrino in alto, avendo cura di evitare bolle d'aria. Apporre un peso sulla parte superiore e lasciare raffreddare l'AROS per circa 30 minuti. Rimuovere i quattro vetrini laterali e confezionare il blocco di vetrini con pellicola trasparente.

Utilizzando una coltura notturna di batteri trasformati come inocolo, coltivare una coltura in LBMM, centrifugare un millilitro di batteri e risospendere. Sospendere le cellule in 20 microlitri di LBMM freddo su ghiaccio utilizzando una punta larga per pipetta.

Aggiungere 20 microlitri di fago purificato. Mescolare delicatamente e incubare prima sul ghiaccio per 30 minuti per consentire l'assorbimento del fago. Successivamente, in un bagno termico a 35 gradi Celsius per cinque minuti.

Per indurre l'iniezione del DNA del fago, separare eventuali aggregati cellulari mescolando. Diluire il campione da uno a dieci in LBMM. Posizionare ora una piastra di agaro LBM.

Su un'immersione, aggiungere un microlitro della miscela di cellule fagica. Una volta assorbito, posizionare delicatamente un'altra immersione sopra. Iniziare acquisendo un insieme di immagini attraverso il canale YFP per l'intervallo temporale iniziale.

Acquisire una serie di 15 immagini a intervalli di 200 nanometri lungo l'asse Z. Inoltre, acquisire una singola immagine a fuoco attraverso i canali in contrasto di fase e m cherry. Quindi, registrare un filmato in time-lapse del destino cellulare post-infezione.

Per ridurre al minimo lo sbiancamento e la fototossicità durante il filmato in lapse temporale, utilizzare un'unica posizione Z per canale in ogni punto temporale, acquisendo il campione nei canali contrasto di fase, YFP e mCherry a intervalli di 10 minuti per circa quattro ore. Iniziare l'analisi delle immagini con un conteggio manuale dei fagi, registrando anche la posizione dei fagi e la lunghezza delle cellule. Nel periodo iniziale, annotare il destino delle cellule come lisi, lisogenia o non infette.

Documentare anche il tempo di lisi e qualsiasi altra informazione desiderata riproducendo il filmato in time-lapse ed estrarre ulteriori informazioni quantitative, come il livello di fluorescenza nel tempo in singole cellule, utilizzando algoritmi automatizzati di riconoscimento cellulare e tracciamento della linea cellulare. Tipicamente, le placche dei fagi marcati con fluorescenza sono significativamente più piccole rispetto a quelle del tipo selvatico e i segnali di YFP e DAPI di un fago purificato con successo risultano co-localizzati. Questi dati combinano set di immagini dei canali in contrasto di fase, YFP e mCherry, e le corrispondenti immagini sovrapposte provenienti da un filmato in time-lapse.

I singoli fagi sono chiaramente visibili nel periodo iniziale. Qui si osservano due cellule, ciascuna infettata da un singolo fago, e una cellula infettata da tre fagi. Tipicamente, si osserva un certo numero di fagi sulla superficie cellulare, mentre altri fagi non sono stati assorbiti.

Nel tempo, l'esito dell'infezione diventa distinguibile. Ottanta minuti più tardi, le due cellule infettate da un singolo fago hanno ciascuna intrapreso la via litica. Con la produzione intracellulare di nuovi fagi, la cellula infettata da tre fagi è entrata nella via lisogena, contrassegnata dalla produzione di mCherry dal pre-motore.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come creare una soluzione purificata di fagi per infettare batteri e co mediante il fago lambda ed eseguire l'acquisizione di immagini del ciclo vitale al microscopio in tempo reale.