Name: A seguito di Cell-destino E. coli Dopo linfezione da fago lambda (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-10-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 10 s
Description: Impara a osservare in tempo reale il destino cellulare di E. coli dopo l'infezione da fago lambda mediante microscopia a fluorescenza. Questo protocollo permette di distinguere le vie litiche e lisogeniche.

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Siamo grati a Michael Feiss e Jean Sippy per la guida sulla creazione di fago e purificazione. Ringraziamo Michael Elowitz per la fornitura del software di riconoscimento delle cellule, Schnitzcell. Il lavoro in laboratorio Golding è sostenuta da sovvenzioni dal National Institutes of Health (R01GM082837), la National Science Foundation (082.265, PFC: Centro per la Fisica delle cellule viventi), la Fondazione Welch (Grant Q-1759) e Human Frontier Science Programma (RGY 70/2008).

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</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

I ceppi batterici, fagi e plasmidi: Strain LE392 è supF. E &#39;stato scelto per sopprimere la SAM7 mutazione nel genoma del fago (vedi Tabella 1 per i dettagli). Così, alla fine lysogens indotte lisi e rilasciare particelle fagiche, le cellule infettate volontà che hanno scelto la via litico. Lisogeni cellule vengono coltivate a 30 ° C a causa della presenza del termosensibile cI 857 allele nel genoma fagico. Dopo l&#39;induzione di calore, GPD-EYFP e di tipo selvatico GPD sono co-espressi dal genoma di λ LZ1 e il plasmide pPlate * D rispettivamente. Come risultato, il capside del fago λ appena creato LZ2 contiene una miscela di GPD-EYFP e proteine ​​GPD. Questo fago mosaico è strutturalmente stabile e sufficientemente fluorescente per consentire l&#39;individuazione di fagi individuali 5. pP RE - mCherry è un plasmide reporter utilizzato per rilevare scelta del pathwa lisogenay. Il RE promotore P viene attivato dal CII durante la creazione di lisogenia 1,11. pP RE - mCherry 5 è stato derivato da pE-GFP 11 sostituendo GFP con mCherry 12. Per maggiori dettagli si veda il nostro precedente lavoro 5. Condizioni di crescita Parametri: Durante l&#39;induzione lysogen (sezione 1), lieve agitazione a 180 rpm dà una resa virus buono 13. Uso di glucosio nel mezzo di crescita deve essere evitato il metabolismo del glucosio genera acidi prodotti metabolici, e particelle lambda mature sono instabili a pH acido 13. L&#39;aggiunta di MgSO4 mira a stabilizzare il fago capside 3. Per i fagi che trasportano wild type CI (invece di CI 857), il lysogen può essere indotta con il DNA-danneggiamento agente Mitomicina C 3. Nella fase 1.3, l&#39;incubazione a 37 ° C non dovrebbe di norma superare i 90 minuti. È Usef<html> ul per verificare la densità cellulare da OD 600 ogni 30 min. Per un buon lisato, OD 600 scende a circa 0,2 o meno, e il restante OD 600 è un risultato di detriti cellulari. Incubazione troppo lungo può causare una resa inferiore, poiché il fago fago appena creato può iniziare a iniettare loro DNA in detriti cellulari. Per ottenere una banda visibile fago (almeno 1 x 10 11 particelle fagiche) nei passi 2,11 e 2,13, crescono almeno 500 ml cultura nel passaggio 1,2. L&#39;aggiunta di 0,2% maltosio nel mezzo di crescita nelle fasi 5.1 e 5.2 mira ad indurre l&#39;espressione di agnello, il recettore per il fago lambda adsorbimento 3,14. Il 1000 volte diluizione invece di 100 volte al punto 5.2 è volta a ridurre il livello di fondo mCherry dal RE plasmide giornalista pP - mCherry. Nel Passaggio 5,5 iniettabile DNA fagico triggering, 35 ° C viene scelta per evitare l&#39;induzione della temperatura sensibile allele cI857. Phage Purificazione: jove_content &quot;&gt; Le fasi di depurazione dei fagi (passaggi da 2.1 a 2.11) può essere sostituito con altri 5 protocolli di purificazione, ma il finale attraverso ultracentrifugazione gradiente di equilibrio CsCl (Piazza di 2.12 e 2.13), è inevitabile. Rotori oscillanti sono necessari passi 2,10 e 2.12 per garantire taglienti bande fagiche visibili. Ottenere un titolo puro fago può facilmente richiedere fino a una settimana, per cui è necessario controllare il titolo fago lungo la strada per assicurarsi che nulla vada storto durante le fasi intermedie. Phage Manipolazione: Durante tutte le procedure di purificazione di cui alla sezione 2, è fondamentale per gestire fago lisato con delicatezza per evitare di taglio code fago da teste fagiche. Durante l&#39;infezione delle cellule nella sezione 5 (ad esempio, attraverso i passaggi 5,5 5,7), è anche fondamentale per evitare il taglio di particelle fagiche dalla cellula infettata. Si noti che se il fago viene tagliato dalla cellula infetta dopo iniezione suo DNA, il risultato è una infezione &quot;scuro&quot;, cioè inrisultato perfezione sarà osservato nell&#39;esperimento, ma il fago infettante non lo farà. Per ridurre al minimo tali problemi, si usa una punta larga pipetta ogni volta che la gestione fagi o il fago / cella miscela. DAPI di prova: La colorazione dello stock del fago con DAPI (sezione 4) è un metodo rapido ed efficace per verificare la purezza dello stock fago. Può anche essere usato per testare possibile degradazione di un magazzino fago esistente nel tempo. Per un archivio pura, la co-localizzazione di segnali YFP e DAPI al microscopio a fluorescenza dovrebbe essere prossimo al 100%. Abbiamo tipicamente osservare che meno dell&#39;1% dei punti YFP non contengono DAPI (che rappresenta capsidi senza genoma virale), che indica che queste particelle non correttamente impacchettare il DNA virale o già iniettato loro DNA altrove. Meno dell&#39;1% dei punti DAPI non contengono YFP (corrispondente a non fluorescenti fagi). Se questo non è il caso, attraverso passaggi 2,12 2,14 necessità di essere ripetuto in order per purificare nuovamente. Per quanto riguarda i parametri di imaging, la configurazione microscopio al punto 4.3 non è così critica come al punto 5 perché non a lungo termine live-cell imaging è necessario qui. Tuttavia, mantenendo le stesse impostazioni microscopia in sezione 5 è utile se si vuole calibrare l&#39;intensità di fluorescenza di una singola particella fagica. Se il PBS-agarosio lastra non è molto pulito, o troppo colorante DAPI viene utilizzato, alcuni punti DAPI corrispondenti a DNA del fago può essere circondato da un &quot;alone&quot;. Se troppo poco colorante DAPI viene utilizzato, il segnale dal canale DAPI può essere molto debole. Microscopio di sistema: Per l&#39;imaging nella sezione 6, si usa un microscopio a epifluorescenza invertito commerciale (Eclipse TE2000-E, Nikon), con un obiettivo 100x (Piano di Fluo, apertura numerica 1,40, immersione in olio) e standard di set di filtri (Nikon). La sorgente di luce di fluorescenza è una lampada ad arco con controllo di intensità luminosa. Le seguenti caratteristiche sono controllati dal computer: x, y, z Pozione, campo chiaro e fluorescenza persiane, e la scelta del filtro di fluorescenza. Una funzione di messa a fuoco automatica è necessaria. In caso contrario, la messa a fuoco può facilmente allontanarsi durante il time-lapse film (normalmente 4 ore). La capacità di acquisire più posizioni (x, y) in ogni punto è utile, in quanto permette di seguire eventi di infezione multipli in parallelo. Noi di solito acquisire 8 posizioni stadio in ogni film, in seguito fino a 100 eventi di infezione. La fotocamera che usiamo è una soluzione raffreddata 512x512 CCD da 16x16 pixel fotocamera micron con una gamma dinamica di 16 bit (Cascade512, fotometrici). Acquisizione viene eseguita utilizzando MetaMorph software (Molecular Devices). Il microscopio deve essere posto in un ambiente a temperatura controllata, in alternativa, la fase microscopio dovrebbe essere circondato da una camera a temperatura controllata. Acquisizione di immagini: Per live-cell imaging, è fondamentale per evitare inutile esposizione del campione, che potrebbe portare a candeggio e phototoxicity. Pertanto, è meglio caratterizzare il vostro primo sistema per trovare una esposizione ottimale la luce che consenta di rilevare la fluorescenza pur non portando ad una crescita cellulare eccessiva sbiancamento o inibizione. Per ottenere una buona immagine di fluorescenza, giocare con l&#39;intensità della luce eccitante, tempo di esposizione e guadagno della telecamera. Nei passaggi 6,2-6,3, l&#39;intervallo di 10 min cornice è scelta allo scopo di minimizzare l&#39;esposizione della luce. In ogni frame, un solo in-fuoco dell&#39;immagine è necessaria in contrasto di fase (per riconoscimento cellulare) e canali fluorescenti (per determinare il destino della cellula). Nel primo punto temporale, tuttavia, più z-posizione immagini attraverso il canale YFP devono catturare tutti fagi infettano sulla superficie cellulare. Il tempo di esposizione YFP nel frame iniziale può anche essere superiore a quella utilizzata per il film accelerato nei tempi successivi. Image Analysis: Attentamente contare le particelle fagiche intorno alla superficie delle cellule nella fase 7.1. Comeosservato in precedenza, si prende una serie di z-stack attraverso il canale YFP al punto 6.2. Tuttavia, questo può ancora lasciare alcune particelle fagiche fluorescenti out-of-focus, che sfida il conteggio. La lunghezza della cella nel lasso di tempo iniziale è misurata utilizzando il software Metamorph. La lunghezza della cella può essere misurata ImageJ o altri strumenti software. Inoltre, un programma automatizzato casa costruita Matlab può essere molto utile per ottenere informazioni quali il cambiamento di fluorescenza nel tempo lungo linee cellulari.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td></tr><tr><td> Cloroformio </td><td> Fisher Scientific </td><td> C298-500 </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> Fisher Scientific </td><td> S271-3 </td></tr><tr><td> DNasi I </td><td> Sigma </td><td> D4527-10KU </td></tr><tr><td> RNasi </td><td> Sigma </td><td> R4642-10MG </td></tr><tr><td> PEG8000 </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP233-1 </td></tr><tr><td> SM tampone </td><td> Teknova </td><td> S0249 </td></tr><tr><td> NZYM </td><td> Teknova </td><td> N2062 </td></tr><tr><td> CsCl </td><td> Sigma </td><td> C3011-250G </td></tr><tr><td> Siringa </td><td> Becton Dickinson </td><td> 309585 </td></tr><tr><td> Ago </td><td> Becton Dickinson </td><td> 305176 </td></tr><tr><td> Dialisi cassetta </td><td> Thermo Scientific </td><td> 66333 </td></tr><tr><td> Vetrino da microscopio </td><td> Corning </td><td> 2947-75x50 </td></tr><tr><td> Agarosio </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP160-100 </td></tr><tr><td> SW40Ti ultra-trasparente tubo </td><td> Beckman Coulter </td><td> 344060 </td></tr><tr><td> SW60Ti ultra-trasparente tubo </td><td> Beckman Coulter </td><td> 344062 </td></tr><tr><td> SW40Ti rotore </td><td> Beckman Coulter </td><td> 331302 </td></tr><tr><td> SW60Ti rotore </td><td> Beckman Coulter </td><td> 335649 </td></tr><tr><td> Rifrattometro </td><td> Fisher Scientific </td><td> 13-947 </td></tr><tr><td> Microscopio a epifluorescenza </td><td> Nikon </td><td> Eclipse TE2000-E </td></tr></tbody></table> Tabella 2. Reagenti e apparecchiature.

a seguito di cell-destino<em&gt; e. coli</em&gt; dopo l&#39;infezione da fago lambda

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

Il sistema comprendendo batteriofago (fago) lambda e del batterio E. coli si è servito a lungo come paradigma per la cella-destino 1,2 determinazione. Seguendo l&#39;infezione simultanea della cella da un numero di fagi, uno dei due percorsi è scelto: litico (virulenta) o lisogena (dormiente) 3,4. Abbiamo recentemente sviluppato un metodo per l&#39;etichettatura fluorescente fagi singoli, e sono stati in grado di esaminare la post-infezione decisionale in tempo reale al microscopio, a livello di fagi singoli e cellule 5. Qui, descriviamo la procedura completa per eseguire gli esperimenti di infezione descritti nel nostro precedente lavoro 5. Questo include la creazione di fagi fluorescenti, infezione delle cellule, l&#39;imaging al microscopio e l&#39;analisi dei dati. Il fago fluorescente è un &quot;ibrido&quot;, co-esprimono versioni wild-type e YFP-fusione della proteina del capside GPD. Un lisato fago grezzo viene prima ottenuto inducendo una lysogen del GPD-EYFP (Enhbilanciato giallo fluorescente delle proteine) fago, ospitare un plasmide che esprime di tipo selvatico GPD. Una serie di fasi di purificazione vengono poi effettuate, seguito da DAPI-etichettatura e immagini al microscopio. Questo viene fatto al fine di verificare l&#39;uniformità, confezionamento efficienza DNA, segnale di fluorescenza e la stabilità strutturale del magazzino fago. L&#39;adsorbimento iniziale di fagi a batteri viene eseguita su ghiaccio, seguito da una breve incubazione a 35 ° C per attivare l&#39;iniezione del DNA virale 6. Il fago / miscela di batteri viene poi spostato alla superficie di una lastra sottile agar nutriente, coperto con un vetrino coprioggetto e ripreso sotto un microscopio a epifluorescenza. Il post-infezione processo è seguito per 4 ore, a intervallo di 10 min. Posizioni a più stadi sono tracciati in modo tale che ~ 100 infezioni delle cellule può essere rintracciata in un singolo esperimento. Ad ogni punto di posizione e tempo, le immagini vengono acquisite in contrasto di fase e fluorescenti canali rosso e verde. Il contrasto di fase immagine è utilizzato in seguito per l&#39;assemblaggio cell riconoscimento mentre i canali fluorescenti sono usate per caratterizzare il risultato dell&#39;infezione: produzione di nuovi fagi fluorescenti (verde) seguita da lisi cellulare, o l&#39;espressione di fattori lisogenia (rosso), seguito da crescita cellulare ripresa e divisione. Gli acquisiti filmati time-lapse sono trattati con una combinazione di metodi manuali e automatizzati. I risultati delle analisi dei dati di identificazione dei parametri di infezione per ogni evento infezione (ad esempio il numero e le posizioni di infettare fagi), così come risultato l&#39;infezione (lisi / lisogenia). Ulteriori parametri possono essere estratti se desiderato.

In questo articolo viene descritta la procedura per la preparazione di una versione fluorescente marcato del batteriofago lambda, infezione di<em&gt; E. coli</em&gt; Batteri, dopo l&#39;esito dell&#39;infezione sotto il microscopio, e l&#39;analisi dei risultati di infezione.

A seguito di Cell-destino<em&gt; E. coli</em&gt; Dopo l&#39;infezione da fago lambda

Il sistema composto dal batteriofago (fago) lambda e dal batterio E. coli ha servito a lungo come paradigma per la determinazione del destino cellulare1,2. In seguito alla ...

L'obiettivo generale di questa procedura è utilizzare un microscopio a fluorescenza per seguire il solfato in e coli in tempo reale dopo l'infezione da parte del fago lambda. Iniziare creando un lisato grezzo di fago lambda. Successivamente, purificare il fago ed infettare e coli con il fago lambda in un tubo.Continuare a seguire il destino delle cellule batteriche al microscopio. In definitiva, i risultati possono mostrare in tempo reale diversi destini cellulari in *E. coli* attraverso l'espressione di diverse proteine fluorescenti associate alla crescita o alla morte cellulare. Generalmente, un controllo per questo metodo consiste nella creazione di una scorta purificata di fronte etichettata FI.Per evitare la condivisione di fige durante la preparazione e la purificazione, ottimizzare anche i parametri di imaging al microscopio per consentire una crescita cellulare sana. Inoculare una coltura notturna di E 3 92 Lambda LZ one PPL star D in mezzo LBM con una densità cellulare di OD 600 pari a circa 0,6 e indurre la lisi in un bagno a 42 gradi Celsius con agitazione.Continuare l'incubazione a 37 gradi Celsius fino a quando la lisi è evidente. La coltura diventa limpida. Aggiungere ora cloroformio al 2% e quindi incubare per 15 minuti a temperatura ambiente.Successivamente, trasferire il lisato fagico in bottiglie da 250 millilitri e centrifugare la coltura. Quindi recuperare il soprannatante contenente le particelle fagiche ed eseguire una seconda centrifugazione per rimuovere i detriti visibili, seguendo protocolli standard di titolazione dei fagi. Misurare la concentrazione dei fagi, quindi purificarli mediante un gradiente al cloruro di cesio e saggia l'attività con DPI per la preparazione delle lastre aro.Pulire sei vetrini con etanolo al 70%. Disporre cinque vetrini come mostrato e fissarli con del nastro adesivo. Versare quindi una soluzione di aros all'1,5% nel mezzo sui vetrini fissati.Posizionare il vetrino finale in alto, facendo attenzione a evitare bolle d'aria. Apporre un peso sulla parte superiore e lasciare raffreddare l'AROS per circa 30 minuti. Rimuovere i quattro vetrini laterali e imballare il blocco di vetrini con pellicola trasparente.Utilizzando una coltura notturna di batteri trasformati come inocolo, coltivare una coltura in LBMM, centrifugare un millilitro di batteri e risospendere. Sospendere le cellule in 20 microlitri di LBMM freddo su ghiaccio utilizzando una punta pipetta larga.Aggiungere 20 microlitri di fago purificato. Mescolare delicatamente e incubare prima sul ghiaccio per 30 minuti per consentire l'assorbimento del fago. Successivamente, in un bagno termico a 35 gradi Celsius per cinque minuti.Per indurre l'iniezione del DNA del fago, separare eventuali aggregati cellulari mescolando. Diluire il campione da uno a dieci in LBMM. Posizionare ora una piastra di agar LBM.Su un'immersione, aggiungere un microlitro della miscela di fagi e cellule. Una volta assorbito, posizionare delicatamente un'altra immersione sopra. Iniziare acquisendo un insieme di immagini attraverso il canale YFP per l'intervallo temporale iniziale.Acquisire una serie di 15 immagini a intervalli di 200 nanometri lungo l'asse Z. Inoltre, acquisire una singola immagine a fuoco attraverso i canali contrasto di fase e m cherry. Quindi, registrare un filmato in time-lapse del destino cellulare post-infezione.Per ridurre al minimo lo sbiancamento e la fototossicità durante il filmato a intervalli, utilizzare una singola immagine in posizione Z per ogni canale per ogni punto temporale, acquisendo il campione nei canali contrasto di fase, YFP e mCherry a intervalli di 10 minuti per circa quattro ore. Iniziare l'analisi delle immagini con un conteggio manuale dei fagi, registrando anche la posizione dei fagi e la lunghezza delle cellule. Nel periodo iniziale, registrare i destini cellulari come lirici, lisogenici o non infetti.Documentare anche il tempo di lisi e qualsiasi altra informazione desiderata riproducendo il filmato in time-lapse ed estrarre ulteriori informazioni quantitative, come il livello di fluorescenza nel tempo in singole cellule, utilizzando algoritmi automatizzati di riconoscimento cellulare e tracciamento della linea cellulare. Tipicamente, le placche dei fagi marcati con fluorescenza sono significativamente più piccole rispetto a quelle del tipo selvatico e i segnali di YFP e DAPI di un fago purificato con successo risultano co-localizzati. Questi dati combinano serie di immagini dei canali in contrasto di fase, YFP e mCherry, e le corrispondenti immagini sovrapposte provenienti da un filmato in time-lapse.I singoli fagi sono chiaramente visibili nel periodo iniziale. Qui si osservano due cellule, ciascuna infettata da un singolo fago, e una cellula infettata da tre fagi. Tipicamente, si osserva un certo numero di fagi sulla superficie cellulare, mentre altri fagi non sono stati assorbiti.Nel tempo, l'esito dell'infezione diventa distinguibile. Ottanta minuti più tardi, le due cellule infettate da un singolo fago hanno ciascuna intrapreso la via litica. Con la produzione intracellulare di nuovi fagi, la cellula infettata da tre fagi è entrata nella via lisogena, caratterizzata dalla produzione di mCherry dal pre-motore.Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come creare una soluzione purificata di fagi per infettare batteri e co mediante il fago lambda ed eseguire l'acquisizione di immagini del ciclo vitale al microscopio in tempo reale.

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