A seguito di Cell-destino E. coli Dopo l'infezione da fago lambda

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di utilizzare un microscopio a fluorescenza per seguire il solfato in e coli in tempo reale dopo l'infezione da fago lambda. Inizia creando un lisato grezzo di fago lambda. Quindi purificare il fago e infettare l'e coli con il fago lambda in una provetta.

Continuare a seguire il destino delle cellule batteriche al microscopio. In definitiva, i risultati possono mostrare in tempo reale diversi grassi cellulari in e coli attraverso l'espressione di diverse proteine fluorescenti associate alla crescita o alla morte cellulare. Generalmente, un controllo di questo metodo è nella creazione di un frontale purificato e di un calcio FI etichettato.

Per evitare la condivisione dei fichi durante la preparazione e la purificazione, ottimizzare anche i parametri di imaging al microscopio per consentire una crescita cellulare sana Inoculato. Una cultura notturna di E 3 92 Lambda LZ una stella PPL D in LBM. I terreni con densità cellulare di OD 600 intorno a 0,6 inducono il lygen in un agitatore a bagno d'acqua a 42 gradi Celsius.

Continuare a incubare a 37 gradi Celsius fino a quando la lisi è evidente. La cultura diventa chiara. Ora aggiungi il 2% di cloroformio, quindi incuba per 15 minuti a temperatura ambiente.

Quindi, trasferire il lisato di fagi in flaconi da 250 millilitri e centrifugare la coltura. Quindi recuperare il surnatante contenente le particelle di fago ed eseguire una seconda centrifugazione per rimuovere i detriti visibili con i protocolli standard di titolazione dei fagi. Misurare la concentrazione del fago, quindi purificare il fago attraverso un gradiente di cloruro di cesio e dosare l'attività con DPI per la preparazione di lastre aro.

Pulire sei vetrini da microscopio con etanolo al 70%. Disporre cinque vetrini come mostrato e fissarli con del nastro adesivo. Versare ora una soluzione di aros all'1,5% in fluido sui vetrini fissati.

Posizionare l'ultimo vetrino in alto, evitando accuratamente la formazione di bolle d'aria. Metti un peso sopra e lascia raffreddare AROS per circa 30 minuti. Rimuovere i quattro vetrini sul lato e imballare la lastra di vetrini con pellicola trasparente.

Utilizzando una coltura notturna di batteri trasformati come inoculo, coltivare una coltura in pellet LBMM di un millilitro di batteri e risus. Sospendere le cellule in 20 microlitri ghiacciati. LBMM con punta per pipetta larga.

Aggiungere 20 microlitri di fago purificato. Mescolare delicatamente e incubare prima su ghiaccio per 30 minuti per consentire l'assorbimento dei fagi. Quindi a bagnomaria a 35 gradi Celsius per cinque minuti.

Per innescare l'iniezione di DNA fagico, separare tutti gli aggregati cellulari mescolandoli. Diluire la miscela da uno a 10 in LBMM. Ora posiziona una lastra agricola LBM.

Su un vetrino coprioggetti, aggiungere un microlitro della miscela di cellule fagiche. Una volta assorbito, posizionare delicatamente un altro vetrino coprioggetti sulla parte superiore. Inizia acquisendo un'immagine impostata tramite il canale YFP per il periodo di tempo iniziale.

Scatta una serie di 15 immagini a intervalli dell'asse Z di 200 nanometri. Inoltre, è possibile acquisire una singola immagine a fuoco attraverso i canali di contrasto di fase e m cherry. Quindi acquisisci un filmato in time-lapse del destino delle cellule post-infezione.

Per ridurre al minimo lo sbiancamento e la fototossicità durante il filmato time lapse, utilizzare una singola immagine in posizione Z per canale per immagine di punto temporale, il campione in contrasto di fase YFP e M canali ciliegia alla volta, intervalli di 10 minuti per circa quattro ore. Inizia l'analisi delle immagini con un conteggio manuale dei fagi e registra anche la posizione dei fagi e la lunghezza delle cellule. Nel lasso di tempo iniziale, registrare i destini cellulari di litici, lisogeni o non infetti.

Documenta anche il tempo di lisi e qualsiasi altra informazione desiderata riproducendo il filmato time-lapse, estrai informazioni più quantitative come il livello di fluorescenza nel tempo nelle singole cellule utilizzando algoritmi automatizzati di riconoscimento cellulare e tracciamento del lignaggio. Tipicamente, le placche dei fagi marcati in fluorescenza sono significativamente più piccole di quelle di tipo selvatico e i segnali YFP e DAPI di un fago purificato con successo si colocalizzano. Questi dati combinano set di immagini dei canali di ciliegia YFP e M a contrasto di fase e le corrispondenti immagini sovrapposte di un filmato time-lapse.

I singoli fagi sono chiaramente visibili all'inizio del periodo di tempo. Qui si vedono due cellule, ciascuna infettata da un singolo fago, e una cellula è infettata da tre fagi. Tipicamente, un certo numero di fagi si vede sulla superficie cellulare mentre altri fagi non vengono assorbiti.

Nel corso del tempo, l'esito dell'infezione diventa distinguibile. 80 minuti dopo, le due cellule infettate da singoli fagi sono entrate ciascuna nella via litica. Con la produzione intracellulare di nuovi fagi, la cellula infettata da tre fagi è entrata nella via lisogenica contrassegnata dalla produzione di m Cherry dal pre-motore.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come creare uno stock di fagi purificato per infettare i batteri e co con il lambda dei fagi ed eseguire l'imaging dello stile di vita al microscopio in tempo reale.