Utilizzando conveniente array LED per la foto-stimolazione dei neuroni

L'obiettivo di questa procedura è preparare e gestire in remoto array di LED per controllare l'attività neurale nelle fette di cervello. Ciò si ottiene utilizzando fette in vitro di animali con neuroni che esprimono il canale REDSIN due e utilizzando un array di LED in combinazione con un microscopio per attivare tali neuroni. Questo video spiega come calibrare un LED e un microscopio per fornire intensità di luce note alla camera a fette.

Con questa configurazione, le soglie di attivazione dei neuroni che esprimono il canale due possono essere misurate con precisione in risposta alla stimolazione della luce attraverso la stimolazione a campo largo dei neuroni che esprimono l'opsina del canale due. Questa tecnica consente un controllo ottico temporaneamente preciso di un'ampia popolazione neuronale. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi optogenetici esistenti, compresi quelli che utilizzano laser o metodi basati su otturatore, è che è molto economica e può essere facilmente adattata a un cannocchiale patch clamp esistente.

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della neurogenesi adulta, incluso il modo in cui l'attività modella l'integrazione di nuovi neuroni nel cervello adulto. Le implicazioni di questa tecnica si estendono alle terapie o alle diagnosi basate su cellule staminali neurali adulte, in quanto offre un controllo temporale preciso sull'attività dei neuroni nati adulti che si integrano nei circuiti neurali esistenti. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulle conseguenze funzionali della neurogenesi adulta, può anche essere eseguito su qualsiasi preparazione in vitro.

Contenere l'adozione del canale che esprime i neuroni Iniziare selezionando un array di LED che produce la sua potenza di picco alla lunghezza d'onda desiderata. Inoltre, scegliere l'array con una corrente nominale massima. Integrare l'array di LED nel microscopio.

Inizia collegando l'array di LED a una ventola chiamata dissipatore di calore utilizzando la pasta termica per aumentare l'efficacia del dissipatore di calore. Quindi rimuovere il LED di serie a bassa potenza dal gruppo dell'obiettivo e fissare il LED di potenza più alta all'obiettivo. Ora sostituisci la lampada Brightfield con l'apparecchio LED assemblato e assicurati che la ventola sia saldamente collegata a terra alla messa a terra comune del sistema.

È necessario un posizionamento accurato degli array di LED per garantire che la luce effettuata dalla chiamata sia in linea con l'obiettivo. Obiettivo. Ottenere l'illuminazione di Kohler focalizzando il condensatore in modo che l'immagine del diaframma di campo sia focalizzata sulla camera a fette e sia centrata sotto il percorso ottico degli obiettivi. Un sottile fazzoletto di carta per lenti può aiutare a mettere a fuoco l'immagine dell'apertura posteriore ad altre profondità.

Ora, praticare fori di spillo di diametro noto in un materiale opaco che può fungere da apertura per il misuratore di potenza. Posizionare uno di questi piccoli fori di spillo sul sensore del misuratore di potenza ottica. Quindi fissare il misuratore di potenza al microscopio per mettere a fuoco il condensatore sul foro stenopeico.

Posizionare manualmente il misuratore di potenza fino a quando non fornisce una lettura massima. Fissare il misuratore di potenza in questa posizione. Se il valore massimo del misuratore di potenza è superiore al piano della fetta, ristabilire l'illuminazione di Kohler su quel piano.

Quindi, apri completamente tutte le aperture. Spostare sistematicamente il misuratore di potenza rispetto al percorso ottico della luce utilizzando i manipolatori del tavolino. Una volta terminato, misurare l'uniformità della potenza ottica all'interno dell'area illuminata effettuando sistematicamente le letture della potenza in una griglia intorno alla potenza massima, che dovrebbe trovarsi sotto il fuoco dell'obiettivo, il microscopio è correttamente impostato con un'illuminazione più fredda centrata sul fuoco dell'obiettivo, la potenza massima dell'array dovrebbe essere a questo fuoco le regioni al di fuori del fuoco dovrebbero ora ricevere una quantità nota di potenza in base all'uniformità trama.

Ora, misura la potenza massima per ogni foro stenopeico di dimensioni con la conoscenza del diametro della punta del trapano utilizzato per fare in modo che ogni foro stenopeico tracci tracci la potenza ottica in funzione dell'area del foro stenopeico. Poiché i fori stenopeici praticati non sono perfetti, la media di questi valori produrrà una buona stima della densità di potenza ottica. L'array di LED verrà utilizzato per il patching delle ottiche.

Assicurati di prendere in considerazione tutti gli elementi ottici necessari per il patching quando costruisci il grafico di potenza e il grafico di uniformità. Ad esempio, molti microscopi sono dotati di uno schermo diffusore ribaltabile che può essere utilizzato per sacrificare l'energia per motivi di uniformità. Prepara le fette di tessuto cerebrale utilizzando i metodi standard e, lasciando che le fette si riprendano per 30-45 minuti in un liquido cerebrospinale riscaldato, vai a preparare le pipette per cerotti.

Una volta che i tessuti si sono ripresi, posizionare delicatamente una fetta nella camera di registrazione del microscopio sotto costante perfusione di A CSF ossigenato. Confermare la presenza del canale EYFP rosso in due canali mediante epifluorescenza sotto illuminazione fluorescente. Localizzare nella fetta un neurone EYFP del canale due sano con morfologia matura.

Quindi localizzare questo soma neuronale sotto l'ottica di patching e produrre un sigillo giga ohm tra la membrana plasmatica e le pareti dell'elettrodo patch. Se l'elettrodo è sufficientemente vicino a un neurone di spiking, l'attività spontanea dovrebbe produrre un potenziale di campo locale misurabile anche senza un sigillo di giga ohm. Ora attiva il canale ne adotta due in questo neurone facendo lampeggiare diverse dosi di luce perché la luce dosa una funzione sia della potenza del LED che della durata, calcola quanta luce è necessaria per evocare un potenziale d'azione a più potenze e durate.

Un microscopio Olympus BX 51 con è stato configurato con un LED in linea con due aperture e una lente a condensatore. Un contrasto di campo chiaro sufficiente per la registrazione con patch clamp è stato ottenuto chiudendo sia il diaframma di campo che il diaframma di apertura. Un grafico di uniformità dell'intensità della luce LED è stato costruito in una regione attorno al campo visivo oggettivo indicato dal cerchio tratteggiato.

Con tutti i diaframmi completamente aperti, le affettatrici sono state esposte alla massima potenza luminosa per l'attivazione dell'adozione del canale. Questa configurazione produce una luce di tre ordini di grandezza più potente rispetto alla configurazione utilizzata per la visualizzazione del patch clamp. La marcatura diffusa dei granuli del bulbo olfattivo nato adulto e dei neuroni per glomerulari è stata osservata quattro settimane dopo l'infezione lentivirale del neuroblasto migrante nel flusso migratorio rostrale.

Le registrazioni di patch libere da una singola cellula granulare che esprime EYFP a canale nato hanno indicato che per questo neurone, una stimolazione di cinque millisecondi alla massima potenza era sufficiente per evocare lo spiking. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in un pomeriggio. È importante ricordare dopo questa procedura di monitorare sempre l'attrezzatura e le impostazioni per la deriva nel tempo Dal loro sviluppo, tali tecniche optogenetiche hanno aperto la strada ai ricercatori nel campo delle neuroscienze per esplorare la trasmissione sinaptica e l'integrazione in una serie di organismi modello come vermi, topi mosca e persino primati.