Name: Utilizzando conveniente array LED per la foto-stimolazione dei neuroni (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 40 s
Description: Impara a controllare l'attività neuronale con array LED convenienti per studiare l'integrazione dei neuroni neonati nell'adulto. Questo metodo ottogenetico offre controllo temporale preciso su popolazioni neuronali in preparazioni di fette cerebrali.

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Questo lavoro è stato sostenuto dalla compagnia di assicurazione sulla vita &quot;AG2R-La Mondiale&quot;, Ecole des Neurosciences de Paris (PEV), l&#39;Agence Nationale de la Recherche &quot;ANR-09-Neur-004&quot;, nella cornice di &quot;ERA-NET NEURON &quot;del 7 ° PQ dalla Commissione Europea e la Fondazione Pasteur. Sebastien Wagner è stato sostenuto dalla Fondazione Letten.

1. Ottiche di calibrazione: misura LED di alimentazione <ol><li> Allegare una serie di LED di un dissipatore attivo raffreddato da una ventola e di apporre questa macchinetta LED / dissipatore di calore per una lente di collimazione. </li><li> Sostituire la lampada utilizzata in campo chiaro con illuminazione a LED / dissipatore / ventola / la lente. Questo apparecchio deve essere accuratamente posizionato in modo che il fascio collimato viaggia lungo un percorso lineare ottico verso la lente condensatore. Assicurarsi che il dissipatore di calore / ventola messa a terra di un terreno comune del sistema. </li><li> Guidare l'array LED con un alimentatore in grado di dare impulsi ad alta risoluzione e la piazza di corrente. Questo alimentatore può essere controllato da un impulso TTL 5V proveniente da un generatore di impulsi. </li><li> Centrare il fascio collimato lungo il percorso della luce definita tra il diaframma di campo e la lente condensatore. Idealmente, il raggio LED leggermente riempire troppo il diaframma di campo completamente aperto. Di solito, un fascio collimato più strettamente LED riempire questa apertura di meno, e produrrà morpotenza e alle spese di uniformità. Nella nostra configurazione abbiamo aumentato l'uniformità della luce, scegliendo una lente di collimazione che ha proiettato un'immagine leggermente ampliato dell'array LED suo piano coniugato al diaframma consenser. </li><li> Ottenere illuminazione Kohler, concentrandosi il condensatore in modo che l'immagine del diaframma di campo (la membrana più vicino alla sorgente luminosa) è focalizzata sulla camera di slice (fig. 1). Un tessuto di carta sottile lente può fungere da schermo di proiezione per visualizzare l'immagine focalizzata del diaframma di campo a profondità di altri. </li><li> Praticare una serie di fori di diametro noto in un materiale opaco. Posto uno di questi piccoli fori sopra il sensore ottico di un power-metro. Posizionare il misuratore di potenza sul palcoscenico del campione e al centro il misuratore di potenza sopra l'immagine mirata del diaframma di campo semplicemente spostando il misuratore di potenza fino a quando non dà una lettura massima. Apporre il misuratore di potenza in questa posizione. </li><li> Aprire completamente tutte le aperture (diaframma e aperaturediaframma di campo). Sistematicamente spostare l'allegato fetta camera / misuratore di potenza rispetto al percorso della luce ottica e calcolare l'uniformità della potenza ottica all'interno dell'area illuminata. Costruire la trama uniformità per il sistema. Se il microscopio è correttamente configurato con illuminazione Kohler centrata a fuoco l'obiettivo, la potenza massima dovrebbe essere direttamente sotto l'obiettivo, e le regioni al di fuori di questo è opportuno concentrarsi ora ricevere una quantità nota di potenza secondo la trama uniformità. </li><li> Per ogni dimensione del foro stenopeico, costruire una curva standard di potenza ottica vs superficie foro stenopeico. Regolando la corrente di ingresso alla matrice di LED, producono questa curva a diversi livelli di potenza e di ogni curva di calcolare la potenza per mm2. Se l'array LED deve essere utilizzato per l'ottica patch, assicurarsi di introdurre elementi ottici necessari per l'applicazione di patch (condensatori, punte di spillo e filtri) per sapere quanta luce viene trasmessa sotto illuminazione patch. </li><li> Sfogliando il misuratore di potenzafaccia l'obiettivo, calcolare l'intensità di illuminazione a 470nm quando la lampada al mercurio è accesa. </li><li> Aggiungere una fetta vivere alla camera, e ricostruire le curve standard per determinare la potenza della luce trasmessa attraverso il tessuto cerebrale di scattering. </li></ol> 2. Procedura di affettare e Elettrofisiologia Parte A: Preparazione Slice <ol><li> Anestetizzare (60 mg / kg di ketamina e 2mg/kg xilazina) e decapitare il mouse. Sezionare il cervello artificiale liquido cerebro-spinale (ACSF, in mm: 124 NaCl, 3 KCl, 1,3 MgSO 4, 26 NaHCO 3, 1,25 NaHPO 4, 20 di glucosio, 2 CaCl 2; ~ 310mOsm, pH 7,4, quando bolle con un misto di 95% O2 e 5% di CO2 5,1), facendo attenzione a non danneggiare i bulbi olfattivi. Separare i due emisferi e il luogo su agar con la superficie ventrale anche con un bordo (per le sezioni orizzontali). </li><li> Agar e la colla superficie dorsale di ogni emisfero corticale alla vibrAtome mandrino, e lentamente riempire la vasca con ghiaccio freddo ACSF. Fetta dalla superficie ventrale in 300 sezioni micron, il trasferimento di ogni sezione per riscaldato (34-36 ° C) e ossigenato ACSF, permettendo loro di recuperare per 30-45 minuti. </li></ol> Parte B: Misura Patch sciolti della soglia di Spike <ol start="3"><li> Dopo aver portato le fette a temperatura ambiente per 30 minuti, delicatamente una fetta nella camera di registrazione della Camera microscopio sotto perfusione costante di ACSF ossigenato. A rischio di stimolare eccessivamente ChR2 neuroni infetti, la presenza di EYFP-ChR2 può essere confermata in epifluorescenza (fig. 2a) </li><li> Tirare elettrodi di vetro su un estrattore pipetta (Sutter P-97). Riempi questo elettrodo con ACSF. Quando nel bagno ACSF la resistenza punta dovrebbe essere tra 7-10 MOhm. </li><li> Sotto illuminazione fluorescente, individuare nella fetta un sano ChR2-EYFP con morfologia dei neuroni maturi. Anche individuare soma questo neurone in ottica di patch. </li><li> Con la luce a pressione positiva passa attraverso l'elettrodo, abbassare l'elettrodo di patch verso il neurone identificato fluorescente. Quando il contatto membrana è realizzata, in modo rapido rilascio pressione positiva e applicare una piccola quantità e breve di aspirazione attraverso la punta. Un giga ohm sigillo dovrebbe essere fatta tra la membrana plasmatica e le pareti dell'elettrodo patch. </li><li> Anche se un giga-sigillo non si forma, se l'elettrodo è sufficientemente vicino ad una attività neuronale fluorescente spiking dovrebbe produrre un potenziale misurabile campo locale. Attivare ChR2 in questo neurone facendo lampeggiare diverse dosi di luce. Perché la luce-dose è una funzione sia di LED di potenza e durata, calcolare quanta luce è necessaria per evocare un potenziale d'azione a poteri diversi e durate (Fig. 2b). Anche osservare quanto si verifica in spiking illuminazione lampada al mercurio. </li></ol> 3. Rappresentante dei risultati: Sul nostro microscopio (Olympus BX51WI), i nostri LED èn linea con 2 aperture e una lente condensatore, mantenendo così il percorso della luce originale del preinstallato lampada ad arco. Con la chiusura sia il diaframma di campo e il diaframma aperature, possiamo ottenere contrasto brightfield sufficiente per la registrazione patch clamp (fig. 1b). Con tutti i diaframmi completamente aperti esponiamo la fetta di potenza luminosa massima per channelrhodopsin attivazione (fig. 1a). Sul nostro microscopio, questa configurazione patch produce luce densità che è circa tre ordini di grandezza inferiore alla densità massima a pieno campo (4,1 μW / mm 2 rispetto a 6,88 mW / mm 2). Vediamo etichettatura robusto di adulti nati granuli bulbo olfattivo e neuroni periglomerular settimane dopo l'infezione lentivirali di migrazione neuroblasti nel flusso migratorio rostrale (fig. 2a) A-patch allentato la registrazione da un unico adulto-nato ChR2-EYFP esprimere cellule dei granuli indica che a 5 ms stimolazione massimaum di potenza (6,88 mW / mm 2) è sufficiente a evocare spiking (Fig. 2b). Dal livello di espressione varia tra le cellule, la quantità di luce che passa la soglia di picco potrà variare e dovrebbe essere descritti statisticamente per ciascun tipo di cellula di interesse. <img src="/files/ftp_upload/3379/3379fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. LED di configurazione degli array di pieno campo fotostimolazione e patch-clamp elettrofisiologia fetta. Per attivare channelrhodopsin (ChR2) si proiettano un fascio collimato attraverso aperture di nuovo aperto e ottica condensatore (a). Questa configurazione può essere modificata in alto contrasto ottica patch attraverso la piena chiudendo il diaframma di campo e modulando la larghezza del diaframma di campo (b). Abbreviazioni: a. ventola, dissipatore b., c. serie di LED, d. collimazione obiettivo, e. specchio, diaframma di campo f., g. diaframma, lente condensatrice h., i. sample stadio, j. obiettivo. <img src="/files/ftp_upload/3379/3379fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Immagine di una fetta 300μm orizzontale di bulbo olfattivo di patch clamp e con tutto il campo fotostimolazione (a). Lentivirally infetti adulti nati cellule granulari esprimono ChR2-EYFP si può vedere si irradiano dal centro del bulbo olfattivo. La luce-dose necessaria per evocare spiking si possono trovare aumentando la durata del flash LED (b). La soglia per questa cella dei granuli è stato 5ms alla massima intensità LED (2.43mW/mm 2). Scala in (a) = 500μm, scala in (b) = 50 ms.

<ol><li>Nissant, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+neurogenesis+promotes+synaptic+plasticity+in+the+olfactory+bulb%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Adult neurogenesis promotes synaptic plasticity in the olfactory bulb.</a> Nature Neuroscience. 12, 728-730 (2009).</li>
<li>Apicella, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pyramidal+Cells+in+Piriform+Cortex+Receive+Convergent+Input+from+Distinct+Olfactory+Bulb+Glomeruli%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Pyramidal Cells in Piriform Cortex Receive Convergent Input from Distinct Olfactory Bulb Glomeruli.</a> Journal of Neuroscience. 30, 14255-14260 (2010).</li>
<li>Boyden, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((genetically+targeted+optical+control+of+neural+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">genetically targeted optical control of neural activity.</a> Nature. 8, 1263-1263 (2005).</li>
<li>Bardy, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((where+new+inhibitory+neurons+release+neurotransmitters+in+the+adult+olfactory+bulb%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">where new inhibitory neurons release neurotransmitters in the adult olfactory bulb.</a> The Journal of Neuroscience. 30, 17023-17034 (2010).</li>
<li>Grubb, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+maturation+of+the+first+synapse+in+olfaction%3A+development+and+adult+neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience%22%5BJournal%5D)">Functional maturation of the first synapse in olfaction: development and adult neurogenesis.</a> The Journal of neuroscience. 28, 2919-2932 (2008).</li>
<li>Zhang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circuit-breakers%3A+optical+technologies+for+probing+neural+signals+and+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Circuit-breakers: optical technologies for probing neural signals and systems.</a> Nature reviews. Neuroscience. 8, 577-581 (2007).</li>
<li>Grossman, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-site+optical+excitation+using+ChR2+and+micro-LED+array%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+neural+engineering%22%5BJournal%5D)">Multi-site optical excitation using ChR2 and micro-LED array.</a> Journal of neural engineering. 7, 16004-16004 (2010).</li>
<li>Dhawale, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-redundant+odor+coding+by+sister+mitral+cells+revealed+by+light+addressable+glomeruli+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+neuroscience%22%5BJournal%5D)">Non-redundant odor coding by sister mitral cells revealed by light addressable glomeruli in the mouse.</a> Nature neuroscience. 13, 1404-1412 (2010).</li>
<li>Weick, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+control+of+transplantable+human+ESC-derived+neurons+via+optogenetic+targeting%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+cells%22%5BJournal%5D)">Functional control of transplantable human ESC-derived neurons via optogenetic targeting.</a> Stem cells. 28, 2008-2016 (2010).</li>
<li>Toni, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurons+born+in+the+adult+dentate+gyrus+form+functional+synapses+with+target+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neurons born in the adult dentate gyrus form functional synapses with target cells.</a> Nature Neuroscience. 11, 901-907 (2008).</li>
<li>Grubb, M. S., Burrone, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Channelrhodopsin-2+Localised+to+the+Axon+Initial+Segment%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Channelrhodopsin-2 Localised to the Axon Initial Segment.</a> PLoS ONE. 5, e13761-e13761 Forthcoming.</li>
<li>Tye, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amygdala+circuitry+mediating+reversible+and+bidirectional+control+of+anxiety%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Amygdala circuitry mediating reversible and bidirectional control of anxiety.</a> Nature. 471, 358-362 (2011).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Ultimi anni hanno visto un&#39;esplosione della popolarità di strumenti per la ricerca neuroscientifica optogenetic 6. Di conseguenza, è sempre più importante per abbassare la barriera di ingresso per i laboratori che vogliono iniziare a utilizzare questi nuovi strumenti. Qui descriviamo come condurre un riadattamento semplice ed economica e la calibrazione di un convenzionale impianto di patch-clamp in modo che possa farlo a pieno campo stimolazione ottica di channelrhodopsin che esprimono i neuroni. In part...

<table><tbody><tr><td>Chetamina</td><td>Imalg&amp;#232;ne 1000</td><td></td><td>100 mg/ml</td></tr><tr><td>Xilazina</td><td>Rompun</td><td></td><td>2%</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5886</td><td>&amp;amp;nbps;</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5405</td><td></td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1880</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>NaHPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5011</td><td></td></tr><tr><td>Glucosio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7902</td><td></td></tr><tr><td>Agarosio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9539</td><td></td></tr><tr><td>Tirafili per pipette</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td></td><td>P-97</td></tr><tr><td>Capillari di vetro</td><td>Harvard Apparatus</td><td>GC150T-10</td><td>1,5 mm diametro esterno / 1,17 mm diametro interno</td></tr><tr><td>Matrice a LED</td><td>Bridgelux</td><td>BXRA-C2000</td><td></td></tr><tr><td>Lente collimatrice</td><td>Thorlabs Inc.</td><td>LEDC1</td><td>40 mm di diametro del fascio</td></tr><tr><td>Alimentatore</td><td>A1W Electronik</td><td>HKO2800</td><td>2,8 ampere</td></tr><tr><td>Misuratore di potenza ottica</td><td>Thorlabs Inc.</td><td>PM 100</td><td></td></tr><tr><td>Dissipatore di calore</td><td>Thermaltake</td><td>A1838</td><td>Silent Boost K8</td></tr><tr><td>Ventola</td><td>Thermaltake</td><td>A1838</td><td>Silent Boost K8</td></tr><tr><td>Vibratomo</td><td>Leica Microsystems</td><td>VT1200S</td><td></td></tr></tbody></table>

utilizzando conveniente array led per la foto-stimolazione dei neuroni

Using Affordable LED Arrays for Photo-Stimulation of Neurons

Elettrofisiologia fetta standard ha permesso ai ricercatori di sondare i singoli componenti dei circuiti neurali registrando le risposte elettriche di singole cellule in risposta a elettrica o farmacologica 1,2 manipolazioni. Con l&#39;invenzione di metodi per controllare visivamente i neuroni geneticamente mirata (optogenetics), i ricercatori hanno ora un livello senza precedenti di controllo su gruppi specifici di neuroni nella preparazione fetta standard. In particolare, fotosensibile channelrhodopsin-2 (ChR2) permette ai ricercatori di attivare i neuroni con la luce 3,4. Grazie alla combinazione di calibrazione accurata basata su LED di fotostimolazione ChR2 con elettrofisiologia fetta standard, siamo in grado di riconoscere con maggior dettaglio il ruolo di adulto-nato interneuroni nel bulbo olfattivo, il primo relè centrale del sistema olfattivo. Utilizzando l&#39;espressione virale di ChR2-YFP specificamente in neuroni adulti nati, siamo in grado di controllare selettivamente i giovani adulti nati i neuroni in un ambiente di un vecchiod neuroni maturi. Il nostro controllo ottico utilizza un sistema semplice e poco costoso a LED, e si mostra come questo sistema può essere calibrato per capire quanta luce è necessaria per evocare spiking attività in singoli neuroni. Quindi, brevi lampi di luce blu può controllare a distanza il modello lancio di ChR2-trasdotte neonato.

Adulti-nato neuroni che esprimono ChR2 può essere manipolata in preparati fetta elettrofisiologici al fine di esaminare il loro contributo verso la funzione olfattiva di circuiti neurali.

Utilizzando conveniente array LED per la foto-stimolazione dei neuroni

L'elettrofisiologia standard su fette ha permesso ai ricercatori di sondare i singoli componenti dei circuiti neurali registrando le risposte elettriche di singoli...

L'obiettivo di questa procedura è preparare ed operare a distanza matrici di LED per controllare l'attività neuronale in fettine cerebrali. Questo viene realizzato utilizzando fettine in vitro da animali i cui neuroni esprimono il canale REDSIN due, e impiegando una matrice di LED in combinazione con un microscopio per attivare tali neuroni. Questo video illustra come calibrare un LED e un microscopio per erogare intensità note di luce alla camera per fettine.Con questa configurazione, le soglie di attivazione dei neuroni esprimenti il canale due possono essere misurate con precisione in risposta a stimolazione luminosa mediante stimolazione in campo ampio dei neuroni esprimenti l'opsina del canale due. Questa tecnica consente un controllo ottico temporale preciso di una vasta popolazione neuronale. Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi optogenetici esistenti, inclusi quelli che utilizzano laser o metodi basati su otturatore, è che è molto economica e può essere facilmente adattata a un microscopio per patch clamp già esistente.Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della neurogenesi adulta, ad esempio in che modo l'attività influisce sull'integrazione di nuovi neuroni nel cervello adulto. Le implicazioni di questa tecnica si estendono a terapie o diagnosi basate su cellule staminali neurali adulte, poiché offre un controllo temporale preciso sull'attività dei neuroni nati nell'età adulta che si integrano nella circuitazione neurale esistente. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulle conseguenze funzionali della neurogenesi adulta, può essere applicato anche a qualsiasi preparazione in vitro.Neuroni che esprimono canali di adozione Iniziare selezionando un array di LED che produca la potenza massima alla lunghezza d'onda desiderata. Inoltre, scegliere l'array con una corrente massima nominale. Integrare l'array di LED nel microscopio.Iniziare fissando l'array LED a un ventilatore chiamato dissipatore di calore utilizzando pasta termica per aumentare l'efficacia del dissipatore. Successivamente, rimuovere il LED standard a bassa potenza dal suo gruppo ottico e fissare il LED ad alta potenza alla lente. Sostituire ora la lampada a campo chiaro con l'apparato LED assemblato e assicurarsi che il ventilatore sia correttamente messo a terra al contatto di massa comune del sistema.Un posizionamento accurato degli array LED è necessario per assicurare che la luce emessa sia allineata con l'obiettivo. Obiettivo: ottenere l'illuminazione Köhler focalizzando il condensatore in modo che l'immagine del diaframma del campo sia a fuoco sulla camera per sezioni e centrata sotto il percorso ottico dell'obiettivo. Un sottile strato di carta per lenti può aiutare a focalizzare l'immagine della diaframma posteriore a diverse profondità.Ora, praticare fori di diametro noto in un materiale opaco che possa fungere da apertura per il misuratore di potenza. Posizionare uno di questi piccoli fori sul sensore del misuratore di potenza ottica. Quindi fissare il misuratore di potenza al microscopio per mettere a fuoco il condensatore sul foro.Posizionare manualmente il misuratore di potenza fino a ottenere una lettura massima. Fissare il misuratore di potenza in questa posizione. Se il valore massimo del misuratore di potenza si trova al di sopra del piano della sezione, ristabilire l'illuminazione di Köhler in quel piano.Successivamente, aprire completamente tutte le aperture. Spostare sistematicamente il misuratore di potenza rispetto al percorso ottico della luce utilizzando i manipolatori dello stage. Al termine, misurare l'uniformità della potenza ottica all'interno dell'area illuminata effettuando in modo sistematico letture di potenza disposte a griglia attorno al valore massimo di potenza, che dovrebbe trovarsi sotto il fuoco dell'obiettivo. Il microscopio è correttamente configurato quando l'illuminazione più omogenea è centrata sul fuoco dell'obiettivo; la potenza massima dell'array dovrebbe trovarsi in corrispondenza di questo fuoco, mentre le regioni esterne al fuoco ora ricevono una quantità nota di potenza in base al grafico di uniformità.Ora, misurare la potenza massima per ogni pinhole in base alla dimensione, conoscendo il diametro della punta del trapano utilizzata per realizzare ciascun foro, e riportare la potenza ottica in funzione dell'area del pinhole. Poiché i fori realizzati con il trapano non sono perfetti, fare la media di questi valori produrrà una buona stima della densità di potenza ottica. L'array LED verrà utilizzato per l'ottica di patching.Assicurarsi di prendere in considerazione tutti gli elementi ottici necessari per l'esecuzione della patch durante la creazione del grafico della potenza e del grafico di uniformità. Ad esempio, molti microscopi sono dotati di uno schermo diffusore girevole che può essere utilizzato sacrificando potenza a vantaggio dell'uniformità. Preparare sezioni di tessuto cerebrale utilizzando metodi standard e, mentre si lasciano riposare le sezioni per 30-45 minuti in un liquido CSF riscaldato, procedere alla preparazione delle pipette per la patch.Dopo che i tessuti si sono ripresi, posizionare delicatamente una sezione nella camera di registrazione del microscopio sotto perfusione costante di ACSF ossigenato. Confermare la presenza del canale EYFP red in due canali mediante fluorescenza episcopica sotto illuminazione fluorescente. Individuare nella sezione un neurone EYFP del canale due sano con morfologia matura.Quindi localizzare il soma di questo neurone mediante l'ottica per il patching e creare un sigillo di giga ohm tra la membrana plasmatica e le pareti dell'elettrodo di patch. Se l'elettrodo è sufficientemente vicino a un neurone che genera potenziali d'azione, l'attività spontanea dovrebbe produrre un potenziale di campo locale misurabile anche in assenza di un sigillo di giga ohm. A questo punto, attivare il canale adotta due in questo neurone mediante stimolazione luminosa con diverse dosi di luce, poiché la dose di luce dipende sia dalla potenza del LED sia dalla durata; calcolare quindi quanta luce è necessaria per evocare un potenziale d'azione a diverse potenze e durate.Un microscopio Olympus BX 51 wi è stato configurato con un LED allineato a due diaframmi e a una lente condensatrice. Un contrasto sufficiente in campo chiaro per la registrazione con patch clamp è stato ottenuto chiudendo sia il diaframma del campo che il diaframma dell'apertura. È stato costruito un grafico di uniformità dell'intensità della luce LED in una regione attorno al campo visivo dell'obiettivo indicato dal cerchio tratteggiato.Con tutti i diaframmi completamente aperti, i taglierini sono stati esposti alla potenza massima di luce per l'attivazione del canale adoptin. Questa configurazione produce una luce tre ordini di grandezza più potente rispetto alla configurazione utilizzata per la visualizzazione con patch clamp. Un'etichettatura diffusa dei granuli dell'olfactory bulb e dei neuroni per glomerulari nati nell'età adulta è stata osservata quattro settimane dopo l'infezione lentivirale dei neuroblasti migranti nel rostral migratory stream.Le registrazioni in modalità patch loose da un singolo canale formatosi in una cellula granulare esprimente EYFP hanno indicato che, per questo neurone, una stimolazione di cinque millisecondi alla potenza massima era sufficiente per indurre potenziali d'azione. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita nel corso di un pomeriggio. È importante ricordare che, dopo questa procedura, occorre monitorare sempre l'attrezzatura e le impostazioni per rilevare eventuali deriva nel tempo. Da quando sono state sviluppate, tecniche optogenetiche di questo tipo hanno aperto la strada ai ricercatori nel campo delle neuroscienze per esplorare la trasmissione e l'integrazione sinaptica in diversi organismi modello, come il verme, la mosca, il topo e persino la scimmia.

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I neuroni adulti, nato del bulbo olfattivo può essere controllato tramite optogenetically Channelrhodopsin2 che esprimono iniezione lentivirali nel flusso migratorio rostrale e fotostimolazione cronica con una miniatura impiantato LED.

Selettiva trasduzione virale di neuroni olfattivi per adulti nati per cronica In vivo Optogenetic Stimolazione

Questo video mostra una procedura per analizzare la connettività sinaptica tra la corteccia prefrontale mediale (mPFC) e i neuroni dell'amigdala utilizzando fette di cervello acuto dell'amigdala da topi. I neuroni mPFC in questi topi esprimono la canalrodopsina fusa con una proteina fluorescente. Le canalrodopsine facilitano l'afflusso di ioni e la generazione di potenziale d'azione nei neuroni mPFC dopo l'attivazione della luce. Di conseguenza, i neuroni mPFC rilasciano neurotrasmettitori che...

Visualizzazione e mappatura dei percorsi neuronali in una fetta di cervello dell'amigdala

Il recente sviluppo di strumenti neuroscienza che combinano genetica e ottica, definito "optogenetics", consente il controllo sulle attività del circuito neurale con un livello senza precedenti di risoluzione spaziale e temporale. Qui forniamo un protocollo per l'integrazione nella registrazione vivo con la manipolazione optogenetic di sottoinsiemi geneticamente definiti di neuroni piramidali corticali prefrontali e subicular.

Un metodo per High Fidelity optogenetic controllo dei singoli Piramidale neuroni<em&gt; In vivo</em

Qui descriviamo la nostra strategia per ottenere registrazioni stabili e ben isolate di singole unità da interneuroni inibitori identificati nella corteccia del topo anestetizzata. I neuroni che esprimono ChR2 sono identificati dalla loro risposta alla luce blu. Il metodo utilizza apparecchiature di registrazione extracellulare standard e rappresenta un'alternativa economica all'imaging del calcio o al patching guidato visivamente.

Una guida per In vivo Singola unità di registrazione da Optogenetically Identificato corticale inibitorio interneuroni

Viene descritto un protocollo per generare un sistema di co-coltura costituito da neuroni derivati da cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC), neuroni corticali primari e astrociti. Questo sistema di co-coltura consente di rilevare la formazione di contatti sinaptici e circuiti tra nuovi neuroni derivati da iPSC e neuroni corticali preesistenti che esprimono la canalrodopsina-2.

Un approccio per la valutazione optogenetic Formazione di connessioni neuronali in un sistema di co-coltura

Viene descritto un metodo per la stimolazione dell'attività elettrica di colture cellulari in vitro con luce visibile, basato sull'uso di polimeri semiconduttori organici.

Controllo ottico di cellule viventi attività elettrica da coniugati Polimeri

Qui, viene presentata una procedura per attivare selettivamente una proteina neuronale con un breve impulso di luce codificando geneticamente un amminoacido innaturale foto-reattivo in una proteina neuronale bersaglio espressa in neuroni in coltura o in vivo.

Controllo ottico di una proteina neuronale Utilizzando un acido Innaturale Amino geneticamente codificata in neuroni

Nel cuore, eventi molecolari coordinare le funzioni elettriche e contrattili dell'organo. Un insieme di campo fluorescenza tecniche di microscopia locali qui presentati consente la registrazione di variabili cellulari nei cuori intatti. Identificare i meccanismi che definiscono la funzione cardiaca è fondamentale per capire come funziona il cuore in situazioni patologiche.

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Questo protocollo descrive come eseguire esperimenti optogenetici per controllare l'espressione genica con luce rossa e rossa lontana utilizzando PhyB e PIF3. Sono incluse istruzioni dettagliate per la costruzione di un sistema di illuminazione semplice e flessibile, che consente il controllo dell'espressione genica o di altre optogenetiche con un computer.

Costruire un sistema di illuminazione semplice e versatile per esperimenti optogenetici

Qui, presentiamo il metodo di fabbricazione di un sistema optrode con fibre ottiche per l'erogazione della luce e un array di elettrodi per la registrazione neurale. Esperimenti in vivo con topi transgenici che esprimono channelrhodopsin-2 mostrano la fattibilità del sistema per la stimolazione optogenetica simultanea e la registrazione elettrofisiologica.

Optrode Array per la modulazione optogenetica simultanea e la registrazione neurale elettrica

I recenti sviluppi nella ricerca sul dolore evidenziano il potenziale della fotoneuromodulazione utilizzando diodi emettitori di luce verde (GLED) come trattamento non farmacologico. GLED modula le vie del dolore, offrendo un efficace sollievo dal dolore. Questo articolo mira a standardizzare e perfezionare i protocolli di esposizione GLED, migliorando la coerenza tra gli studi e facendo progredire l'applicazione clinica di questa terapia.

Ottimizzazione delle tecniche di fotoneuromodulazione per valutare il ruolo dei diodi emettitori di luce verde nella gestione del dolore

Impara a controllare l'attività neuronale con array LED convenienti per studiare l'integrazione dei neuroni neonati nell'adulto. Questo metodo ottogenetico offre controllo temporale preciso su popolazioni neuronali in preparazioni di fette cerebrali.

Utilizzando conveniente array LED per la foto-stimolazione dei neuroni

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