Selettiva trasduzione virale di neuroni olfattivi per adulti nati per cronica In vivo Optogenetic Stimolazione

Lo scopo di questa procedura è utilizzare un controllo remoto per attivare i neuroni del bulbo olfattivo e osservare come la loro attivazione influisca sul comportamento. Questo viene ottenuto introducendo un gene codificante per Channel Redin due, accoppiato alla YFP, nei neuroni bersaglio di soggetti adulti mediante iniezioni stereotassiche di un vettore lentivirale. Successivamente, un LED viene calibrato e preparato per l'innesto, al fine di ottenere un'idea generale della quantità di luce trasmessa nel cervello.

L'ultimo passaggio della procedura consiste nell'implantazione del LED sopra il bulbo olfattivo, assicurandone il corretto posizionamento e fissaggio. Infine, l'attivazione neuronale viene confermata mediante CFO, colorazione immunoistochimica e i risultati dei test comportamentali. Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come la stimolazione elettrica standard o le perturbazioni farmacologiche, è che la stimolazione optogenetica dei neuroni marcati è altamente specifica sia per quanto riguarda il tipo sia per il numero di neuroni attivati.

L'implicazione di questa tecnica si pone in evidenza per la terapia o la diagnosi delle malattie neurodegenerative grazie al controllo temporale e spaziale preciso che offre. Questo metodo può fornire informazioni sul ruolo dei neuroni ossei adulti nella rete olfattiva ossea. Può essere applicato ad altre regioni superficiali, come i neuroni polmonari corticali o cerebrali.

Iniziare prelevando i titoli del vettore preparati dal congelatore a meno 80 gradi Celsius. Mantenerli congelati prima dell'uso e scartare eventuali titoli rimanenti. Tagliare la punta delle pipette in vetro borosilicato raggruppate utilizzando un paio di forbici.

L'obiettivo è ottenere punte con un diametro compreso tra 30 e 40 micron. Conservare le pipette preparate in una scatola priva di polvere. Successivamente, configurare un microiniettore per iniettare 50 nanolitri di olio minerale nella pipetta preparata con riempitore posteriore e inserirla nel pistone del microiniettore, che deve essere fissato al telaio stereotassico.

Dopo aver scongelato il titolo virale, svuotare parzialmente l'olio dalla pipetta di vetro, quindi riempirla nuovamente con il titolo. Trasferire due microlitri di virus su un pezzo sterile di pellicola parafilm. Abbassare delicatamente la pipetta di vetro nella goccia e riempire la pipetta con uno o due microlitri di virus.

Verificare che non ci siano bolle d'aria nella pipetta, quindi procedere con la preparazione dell'animale dopo aver anestetizzato un topo utilizzando chetamina e xilazina diluite in soluzione salina sterile. Assicurarsi che il topo non risponda a stimoli dolorosi, come una compressione delle dita dei piedi, prima di procedere. A questo punto, rimuovere i peli dal cuoio capelluto del topo e disinfettare la cute.

Posizionare l'animale in un telaio stereotassico e utilizzare i supporti auricolari e un supporto nasale per fissare la testa con un bisturi. Incidere il cuoio capelluto dalla regione tra gli occhi fino a quella tra le orecchie. Scostare la pelle per esporre il cranio e fissare la pelle con una coppia di pinze.

Quindi pulire la superficie del cranio utilizzando soluzione salina sterile. Azzerare l'apparato stereotassico con la punta della pipetta di vetro in corrispondenza del bregma. Successivamente posizionare la punta nel sito di iniezione.

Regolare la posizione della barra nasale in base al calcolo delle coordinate stereotassiche. Utilizzando queste coordinate, il bgma e il sito di iniezione vengono allineati alla stessa altezza. Utilizzando un trapano chirurgico ad alta velocità, praticare con attenzione un piccolo foro nel cranio in corrispondenza di ciascun sito di iniezione.

Attenzione a non danneggiare i vasi sanguigni sulla superficie del cervello durante la foratura. Ora, utilizzando un ago da siringa piegato con la punta ricurva, rimuovere i residui di osso sottile per esporre la meningi del SRA. Verificare che il foro sia centrato nella posizione corretta.

Abbassare la pipetta e azzerare l'altezza dorsoventrale. Quando la punta della pipetta tocca la superficie del cervello, abbassare ulteriormente la pipetta alla profondità dorsoventrale corretta e attendere 30 secondi per raggiungere l'equilibrio della pressione. Iniettare ora 50 nanolitri di virus per quattro volte, per un totale di 200 nanolitri di virus, attendendo 30 secondi tra un'iniezione e l'altra.

Un minuto dopo l'ultima iniezione, ritirare lentamente la pipetta e rimuovere il mouse dall'apparecchiatura. Pulire il sito dell'incisione con soluzione di Betadine e suturare la pelle. Utilizzando filo chirurgico, lasciare che il mouse si riprenda su un tappetino riscaldante prima di riposizionarlo definitivamente nella gabbia prima dell'innesto del micro-LED blu.

Per la stimolazione optogenetica, è necessario preparare e testare il dispositivo. I pin del LED devono essere saldati a un connettore elettrico femmina in modo che il connettore si trovi sul lato opposto rispetto al LED. Verificare l'assenza di cortocircuiti elettrici e identificare il pin positivo e quello negativo sul connettore.

Infine, testare il LED collegandolo a un controller LED per misurare o impostare la potenza luminosa assoluta del supporto LED, del LED su un micromanipolatore e preparare il misuratore di luce. Praticare un foro di tre millimetri in una tavola opaca in PVC e fissare questo foro al misuratore di potenza. Posizionare ora il LED a diretto contatto con il fotodetettore del misuratore di potenza ed effettuare le misurazioni all'intensità luminosa di picco del LED, che di solito è di 470 nanometri.

Utilizzare il misuratore di potenza per costruire una curva standard di potenza ottica rispetto alla corrente di ingresso. Quindi utilizzarla per calcolare la potenza per millimetro quadrato al fine di misurare la propagazione della luce attraverso il cervello. Ottenere blocchi di tessuto cerebrale fresco tagliati con vibrometro di spessori pari a 300, 500, 1000, 1500 e 2500 micron, utilizzando un frammento di cranio con una craniotomia identica a quella eseguita nei topi vivi.

Posizionarlo tra il LED e il rilevatore. Ora, misurare la potenza luminosa senza il tessuto. Quindi posizionare ciascun campione di tessuto tra il LED e il fotodetettore del misuratore di potenza e misurare la variazione di potenza.

Costruire una curva degli spessori del tessuto in funzione della frazione relativa di trasmissione. La frazione di trasmissione è il rapporto tra la potenza misurata attraverso il tessuto e quella misurata in assenza del tessuto. Utilizzare questi dati per calibrare il LED e quindi procedere con l'intervento chirurgico di impianto.

Preparare il LED e il connettore disinfettandoli con etanolo al 70% e collegando il connettore a un supporto stereotassico. Dopo aver posizionato un topo anestetizzato nel telaio stereotassico, utilizzare una barra nasale per allineare perfettamente orizzontale e parallela alla superficie del LED in miniatura la superficie del cranio. In questo caso, viene allineata la regione del cranio corrispondente al bulbo olfattivo.

Ora, con un bisturi, tagliare il cuoio capelluto a partire da tre millimetri anteriormente agli occhi fino a tre millimetri posteriormente alle orecchie. Tirare da parte la pelle e fissarla con una coppia di morsetti. Rimuovere le membrane sulla superficie del cranio utilizzando una lametta da rasoio.

Prepararsi a eseguire una craniotomia rettangolare sopra le bulbi dell'effetto off. In primo luogo, utilizzare un trapano ad alta velocità per assottigliare con attenzione l'osso cranico fino a quando rimane solo uno strato sottile di osso. In secondo luogo, rimuovere con cura l'osso residuo con l'aiuto di un ago curvo per siringa.

Evitare con attenzione di perforare la dura madre. Sciacquare ora l'area chirurgica con soluzione salina sterile e quindi asciugare il cranio. Dopo aver pulito e asciugato il cranio esposto, applicare uno strato sottile di adesivo a base di cianoacrilato sul cranio per l'adesione successiva dell'acrilato dentale.

Potrebbe essere necessario aggiungere due piccole viti per fissare il LED. Le viti devono essere inserite nel cranio posteriormente al LED e ricoperte con entrambi gli acrilici. Dopo aver collegato il connettore del LED al supporto, posizionare il LED miniaturizzato sopra i bulbi olfattivi con il suo asse principale parallelo all'asse rostrale cordale.

Quindi fissare il LED al cranio con due strati di acrilico dentale. Mentre l'acrilico è ancora liquido, tirare indietro i bordi liberi del cuoio capelluto e incollarli a due strati di acrilico dentale. Fare attenzione a non applicare alcun acrilico al connettore una volta che l'acrilico si è indurito.

Rimuovere l'animale dal supporto e lasciarlo svegliare su un tappetino riscaldato. Una volta restituito alla gabbia, il recupero completo richiede almeno sette giorni. Un sottile cavo elettrico leggero viene utilizzato per collegare l'animale a un controllore LED, consentendo ampia libertà di movimento, rispettando la polarità del cavo poiché l'inversione.

La polarità potrebbe danneggiare il LED. Al termine dell'esperimento, rimuovere il LED per verificare che fosse funzionale CH opsin. Due YFP sono stati espressi nei neuroni transdotti circa 48 ore dopo l'iniezione ed sono rimasti stabili per diversi mesi.

Una sezione sagittale di un animale fissato con paraldeide a 15 giorni dall'iniezione ha mostrato un'etichettatura densa e le dimensioni del sito di iniezione. Nella RMS, un elevato numero di cellule neonate ha migrato lungo la RMS per colonizzare i diversi strati del bulbo olfattivo. La proteina di fusione è stata espressa in tutti i compartimenti neuronali, inclusi il soma, le dendriti e le spine.

L'innesto di LED miniaturizzati ha permesso una stimolazione ottica su larga scala ed economica di un'ampia regione di interesse, caratterizzando la diffusione della luce nel tessuto cerebrale e la soglia di attivazione del canale rosso in due attivazioni. Si stima che l'attivazione ottica venga innescata a una profondità di circa due millimetri al di sotto della superficie del LED per monitorare l'attivazione funzionale dell'adozione del canale, in due neuroni esprimenti in vivo. L'espressione dei CFOs.

Un marcatore dell'attività neuronale è stato analizzato dopo una stimolazione luminosa ripetuta. Un singolo responsabile. Questa tecnica può essere eseguita in un'ora per iniettare il virus e, dopo almeno tre settimane, richiede altre due ore per impiantare il LAD.

La calibrazione del LAD è importante e richiede tempo aggiuntivo dopo aver seguito questa procedura. Altri metodi, come la registrazione elettrocirurgica in vivo, possono essere eseguiti per rispondere ad ulteriori domande, ad esempio sul rapporto tra l'attivazione di un tipo di cellula e la risposta in un'altra dopo il suo sviluppo. Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della neuroscienza dei sistemi per esplorare correlazioni precise tra l'attivazione dei neuroni neonati e la percezione olfattiva nel sistema olfattivo del topo.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come iniettare un vettore virale utilizzando coordinate STEREOTASSICHE, di come preparare e calibrare un LED per l'innesto, di come impiantare il LED e di come utilizzare l'ossigeno e la stimolazione per condurre esperimenti comportamentali. Inoltre, ricorda che l'uso di vettori virali può essere estremamente pericoloso e che devono essere adottate adeguate precauzioni, come una formazione appropriata e lo smaltimento corretto dei materiali pericolosi.