L'utilizzo di nanostrutture di cristallo plasmoniche e fotonici per Enhanced manipolazione micro e nanoparticelle

L'obiettivo generale di questa procedura è intrappolare oggetti biologici di dimensioni micrometriche mediante pinzette plasmoniche e a cristallo fotonico. Questo risultato si ottiene innanzitutto fabbricando il substrato plasmonico o il substrato a cristallo fotonico. Successivamente, il campione biologico viene preparato aggiungendo BSA alla soluzione cellulare e garantendo un adeguato spazio per la soluzione cellulare al di sotto del vetrino superiore.

Successivamente, il laser viene allineato al microscopio, al quale è stato applicato lo schema di filtri corretto. Il microscopio viene quindi messo a fuoco sul campione ed eseguita la trappola ottica. Infine, particelle di dimensioni micro o nanometriche possono essere intrappolate riducendo l'intensità incidente grazie all'ausilio di nanostrutture a cristallo fotonico o plasmoniche.

Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come i tradizionali tweezers ottici, è che la conversione dei campi ottici attraverso nanostrutture plasmoniche e a cristallo fotonico riduce l'intensità necessaria per intrappolare particelle piccole come le cellule, e inoltre non richiede un fascio fortemente focalizzato, riducendo così il rischio di danno fotoindotto alle cellule dovuto all'esposizione alle radiazioni. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali in numerosi ambiti biologici, come l'interazione tra cellula e cellula e lo studio delle diverse forze in biologia. Può inoltre rappresentare uno strumento utile per la fabbricazione in micro e nanotecnologia, consentendo una manipolazione precisa di micro e nanoparticelle. Per formare un array di nanoparticelle d'oro utilizzando un evaporatore a fascio elettronico e cromo come strato adesivo, evaporare oro su un coprioggetto di vetro fino a uno spessore di 20 nanometri.

Pulire il campione utilizzando un plasma di ossigeno per circa un minuto per rimuovere le impurità organiche sulla superficie. Dopo aver indotto il monostato di polistirene ad autoassemblarsi, depositare o versare il liquido sul campione, incubare per circa un'ora, quindi utilizzare un grande volume di acqua per lavare via le sfere non adsorbite e farle asciugare all'aria. Sul monostato, evaporare infine un secondo strato di oro di 20 nanometri sulle sfere di lattice, formando un monostato di array di nanoparticelle d'oro casuali.

L'array di nanoparticelle è ora pronto per il campione biologico. Posizionare il vetrino con le nanoparticelle preparato sul portacampioni di un microscopio a fluorescenza. Il passaggio successivo consiste nel preparare i nuclei di cellule di topo per il trappolamento ottico.

Iniziare con nuclei cellulari di topo marcati con arancione aina per impedire che i nuclei aderiscano al substrato. Collocare i nuclei cellulari in una provetta piccola e aggiungere BSA al 10% in PBS a una concentrazione da uno a 10 di BSA mescolato mediante vortex. Quindi pipettare cinque microlitri della soluzione di nuclei con BSA sul vetrino preparato.

Per creare uno spazio tra i nuclei e il vetrino da copertura, posizionare una pila di due vetrini spaziatori intorno alla goccia, quindi appoggiare un altro vetrino sopra. Per il trattenimento e l'acquisizione simultanea di immagini, utilizzare una configurazione personalizzata di microscopio a fluorescenza, comprendente un filtro di eccitazione bypassato e due divisori dicroici personalizzati. I pinzette ottiche sono realizzate inviando un laser a elio-neon da 35 milliwatt attraverso un microscopio zes axio imager D one M, dotato di un set di filtri GFP 17, modificato in modo da permettere al fascio laser a 633 nanometri di raggiungere il campione.

Il microscopio focalizzerà il fascio laser sul campione, quindi il fascio verrà diffratto dal substrato di nanoparticelle plasmoniche o dal reticolo di diffrazione. Per ottenere un'immagine dei nuclei cellulari, che hanno un diametro di circa cinque micron, utilizzare un obiettivo Zeiss LDEC epi plan con obiettivo Neola 50x. Iniziare posizionando il campione sull'obiettivo e mettendo a fuoco il piano con il maggior numero di nuclei, poiché si trovano sulla superficie del substrato.

Successivamente, mettere a fuoco al microscopio un nucleo da intrappolare individuando nuclei cellulari liberi in movimento sopra gli strati di cellule sulla superficie. Quindi posizionare il punto del trappolamento laser sul campione. A questo punto, il campione dovrebbe essere intrappolato e mantenere la propria posizione all'interno del punto laser anche quando si sposta la piastra.

I nuclei di topo che si trovano nel piano focale del microscopio potrebbero spostarsi leggermente a causa di una debole corrente microfluidica provocata dal riscaldamento e dall'evaporazione del campione, ma i nuclei intrappolati rimarranno in una posizione fissa. Questa figura mostra una microfotografia al microscopio elettronico a scansione di nanoparticelle d'oro autoassemblate, ciascuna con un diametro di circa 450 nanometri. Qui è riportata un'immagine di microscopia ottica a scansione in campo vicino del substrato plasmonico in cui la distribuzione delle nanoparticelle è scarsa, che mostra la radiazione in campo vicino.

La lunghezza d'onda del laser di eccitazione è di 633 nanometri; qui viene mostrato lo spettro di efficienza di scattering del substrato plasmonico con un picco a 624 nanometri. Lo spettro di efficienza di assorbimento del substrato plasmonico mostra un picco a 668 nanometri. Nanosfere d'oro distribuite in modo casuale su un dominio bidimensionale di un metro per un metro quadrato.

I micrometri sono mostrati qui. Ogni cerchio blu rappresenta il centro della nanostruttura sferica. Negli schemi sono mostrate le distribuzioni del campo disperso su piani di osservazione, che sono paralleli all'array casuale di nanostrutture sferiche.

Questi grafici mostrano le intensità minime del laser necessarie per mantenere il trappolamento in funzione della portata del fluido circostante. Utilizzando il trappolamento plasmonico, tutte le intensità ottiche sono state misurate nel piano del campione al di sotto dell'obiettivo del microscopio. Ogni pannello mostra i risultati delle misurazioni effettuate su singole microsfere di polistirene con diversi diametri.

Gli insetti mostrano le corrispondenti immagini microscopiche delle particelle. Le barre della scala in tutte le immagini rappresentano una lunghezza di cinque micrometri. Qui viene riportato il coefficiente angolare della retta interpolata passante per l'origine nei grafici precedenti in funzione della dimensione delle particelle.

Per il trappolamento plasmonico. Le barre di errore mostrano le deviazioni standard degli adattamenti lineari. I risultati mostrano che particelle più grandi richiedono una maggiore intensità del laser per mantenere una stabilità di trappolamento adeguata.

Questo schema mostra il trappolamento ottico potenziato mediante nanostrutture periodiche unidimensionali. Il fascio incidente viene diffratto dalla nanostruttura periodica in campo lontano. Qui è mostrata la distribuzione dell'intensità della luce con due polarizzazioni ortogonali sulla superficie di un reticolo in alluminio.

Con un periodo di 417 nanometri ottenuto mediante simulazioni nel dominio spaziotemporale alle differenze finite, la distribuzione viene normalizzata rispetto all'intensità su una superficie piana di alluminio. Queste figure mostrano il potenziale di trappolamento per particelle direttamente al di sopra della superficie graduata in funzione della posizione della particella. Per la microsfera di polistirene CA da 350 nanometri e la microsfera di polistirene DA da un micrometro, i cerchi bianchi illustrano le dimensioni delle particelle.

Gli insetti mostrano il potenziale di trappolamento al di sopra di una superficie piana in alluminio. Per dimensioni delle particelle identiche a quelle dei confronti. I valori sono normalizzati per ciascuna dimensione delle particelle.

Per tutte le figure delle simulazioni FDTD, il campo visivo è di 10 per otto micrometri quadrati. Qui è riportata l'efficienza del trappolamento e l'intensità minima di trappolamento misurata per microsfere di polistirene di diverse dimensioni, con la polarizzazione del fascio perpendicolare alle linee del reticolo. L'inserto mostra l'asimmetria del trappolamento nell'efficienza quando una microsfera di polistirene di 3,87 micrometri viene spostata perpendicolarmente e parallelamente alle righe del reticolo.

Di seguito è riportata una rappresentazione schematica dell'angolo traslazionale della particella. Questo particolare mostra il miglioramento in funzione della direzione di traslazione per diverse polarizzazioni e dimensioni delle particelle. La linea continua indica un'elevata asimmetria ottenuta con luce incidente polarizzata perpendicolarmente al gradiente, mentre la linea tratteggiata.

Un'asimmetria ridotta si ottiene con luce incidente polarizzata parallelamente al gradiente. Questi pannelli rappresentano una dimostrazione dell'incapsulamento di un microsfera fluorescente in polistirene da 590 nanometri. Il cerchio rosso indica la posizione del punto laser, poiché inizialmente la luce laser era troppo debole per essere visibile.

La particella è intrappolata all'interno del punto a potenza più elevata. Riducendo la potenza, il moto browniano della particella supera la forza di intrappolamento, consentendo alla particella di sfuggire. In questo caso, un nucleo di cellula tumorale ovarica fluorescente è stato intrappolato; l'intensità minima richiesta per iniziare l'intrappolamento era di 16 micro watt per micrometro quadrato, ottenuta utilizzando un obiettivo da 20x.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come creare una trappola ottica a bassa intensità per la manipolazione non invasiva di campioni biologici di dimensioni micro e nanometriche, utilizzando substrati nanostrutturati a base di plasmonica e cristalli fotonici.