Formulazione di nanoparticelle polimeriche diblock attraverso Tecnica Nanoprecipitation

L'obiettivo generale di questa procedura è sintetizzare nanoparticelle polimeriche utilizzando un metodo di nanoprecipitazione. Questo viene realizzato innanzitutto eseguendo una reazione E-D-C-N-H-S per generare un copolimero A-P-L-G-A PEG. Il copolimero PLGA PEG viene quindi utilizzato per generare nanoparticelle, incapsulando il farmaco o il carico di interesse mediante nanoprecipitazione.

A questo punto, è possibile eseguire una caratterizzazione biofisica di base, inclusi dimensioni, carica superficiale ed efficienza di caricamento del farmaco, mediante microscopia elettronica a trasmissione, scattering dinamico della luce o HPLC. Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla terapia dei tumori poiché le nanoparticelle possono veicolare terapeutici antitumorali scarsamente solubili, che potrebbero risultare più efficaci rispetto ai trattamenti attuali. Sebbene questo metodo possa fornire spunti utili per il trattamento del cancro.

È inoltre possibile utilizzarlo per lo studio di altri sistemi, come il traffico cellulare. Le nanoparticelle possono essere coniugate con un ligando bersaglio e visualizzate in vivo o in vitro mediante l'uso di un agente di imaging che dimostra la tecnica. Oggi saranno presenti due tecnici del nostro laboratorio, Rohit Sukumar e Natalie Cummings, per iniziare la sintesi del copolimero PLGA PEG sciogliendo il PLGA carbossilato in acetonitrile a una concentrazione di cinque millimolari, con leggera agitazione.

Quindi aggiungere quantità sufficienti di NHS e EDC per ottenere concentrazioni di 25 millimolari, fornendo un eccesso stechiometrico di cinque volte rispetto al PLGA; agitare delicatamente la soluzione per circa un'ora per permettere la conversione del carbossilato di PLGA in PGA NHS. Dopo un'ora, precipitare il prodotto di reazione PGA NHS aggiungendo la soluzione di lavaggio, metanolo, in un volume approssimativamente dieci volte superiore, in eccesso rispetto alla soluzione; centrifugare la soluzione a 2000 × g per formare il pellet di P-L-G-A-N-H-S. Dopo la centrifugazione, scartare il sopranatante per rimuovere le tracce di EDC e NHS. Questa procedura di lavaggio con metanolo viene ripetuta almeno tre volte.

Al termine del lavaggio, asciugare il P-L-G-A-N-H-S sotto vuoto per 30 minuti per rimuovere eventuali tracce della soluzione di lavaggio. A questo punto, risolubilizzare nuovamente il pellet di P-L-G-A-N-H-S in acetone alla stessa concentrazione utilizzata inizialmente per sciogliere il PLGA.

Dopo averlo sciolto, aggiungere il PEG etero-bifunzionale alla soluzione di PLGA. Aggiungere una concentrazione di cinque millimolari.

Incubare la soluzione della miscela per 24 ore con agitazione costante dopo 24 ore. Precipitare il prodotto della reazione del copolimero a blocchi PLGA PEG aggiungendo metanolo in eccesso. Eseguire il lavaggio e la centrifugazione per altre tre volte per rimuovere tutto l’eccesso di peg non reagito.

Come passaggio finale della sintesi, essiccare il copolimero a blocchi PLGA PEG sotto vuoto. La precipitazione delle nanoparticelle inizia sciogliendo il copolimero a blocchi PLGA PEG e il farmaco da incapsulare nel solvente A-P-L-G-A. La scelta del solvente è fondamentale poiché influenza le proprietà delle nanoparticelle. Successivamente, aggiungere la miscela polimero-farmaco, goccia a goccia, in tre-dieci volumi di acqua in agitazione per ottenere una concentrazione finale di polimero di circa tre milligrammi per millilitro. Goccia a goccia.

L'aggiunta della soluzione organica alla fase acquosa è fondamentale per formare nanoparticelle della dimensione corretta. Proseguire l'agitazione per due ore sotto pressione ridotta per consentire la formazione delle nanoparticelle mediante autoassemblaggio ed eliminare le tracce di solvente organico. Dopo due ore di agitazione.

Concentrare le nanoparticelle mediante centrifugazione a 2.700 ×g per 10 minuti utilizzando un filtro Amon. Successivamente, lavare le nanoparticelle con PBS per rimuovere qualsiasi farmaco non intrappolato e procedere con una nuova centrifugazione. Infine, ricostituire le nanoparticelle in PBS a questo punto.

È possibile eseguire una caratterizzazione biofisica di base, inclusi dimensioni, carica superficiale ed efficienza di caricamento del farmaco, per comprendere meglio le proprietà delle nanoparticelle. Le nanoparticelle possono essere conservate come descritto nel protocollo scritto; per caratterizzare le nanoparticelle di PLGA PEG, è stata utilizzata la microscopia elettronica a trasmissione al fine di confermare dimensioni, distribuzione e struttura delle nanoparticelle stesse. Le dimensioni delle particelle sono generalmente nell'ordine del nanometro.

Dimensioni elevate delle particelle con distribuzioni dimensionali irregolari potrebbero indicare un errore nella reazione di coniugazione oppure la necessità di ottimizzare il metodo di nanoprecipitazione. Qui viene mostrato uno studio cinetico sul rilascio del farmaco, in cui l'efficienza di caricamento e il rilascio del paclitaxel sono stati quantificati mediante HPLC standard. Quantità fisse note di nanoparticelle sono state dializzate a intervalli di tempo prefissati.

Il contenuto dell'unità di dialisi è stato raccolto ed è stato aggiunto un volume uguale di solvente organico per sciogliere le nanoparticelle. Successivamente, è stata eseguita la HPLC su questi campioni. Per quantificare il contenuto di Paclitaxel, una volta acquisita la tecnica, questa procedura di nanoprecipitazione può essere correttamente eseguita in tre ore.

Ricordare che, durante l'esecuzione di questa tecnica, è sempre necessario aggiungere lentamente la fase organica alla fase acquosa per evitare la formazione di particelle di grandi dimensioni dopo il loro sviluppo. Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della nanomedicina oncologica, permettendo di esplorare l'uso di farmaci scarsamente solubili che in precedenza erano considerati troppo tossici nei pazienti oncologici dopo questo procedimento. Altri metodi, come studi sull'efficacia in vivo o studi di imaging, possono essere eseguiti per rispondere a domande quali se i farmaci scarsamente solubili siano efficaci, quando la tossicità sistemica non è più un problema, oppure se i ligandi di targeting indirizzano correttamente le nanoparticelle alla loro destinazione.