Formulazione di nanoparticelle polimeriche diblock attraverso Tecnica Nanoprecipitation

L'obiettivo generale di questa procedura è sintetizzare nanoparticelle polimeriche utilizzando un metodo di nano precipitazione. Ciò si ottiene eseguendo prima una reazione E-D-C-N-H-S per generare il copolimero A-P-L-G-A PEG. Il copolimero PLGA PEG viene quindi utilizzato per generare nanoparticelle, incapsulando il farmaco o il carico di interesse attraverso la nanoprecipitazione.

A questo punto, la caratterizzazione biofisica di base, comprese le dimensioni, la carica superficiale e l'efficienza di caricamento dei farmaci, può essere eseguita attraverso la microscopia elettronica a trasmissione dinamica a diffusione di luce o HPLC. Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla terapia dei tumori perché le nanoparticelle possono fornire terapie antitumorali scarsamente solubili, che possono essere più efficaci dei trattamenti attuali. Anche se questo metodo può fornire informazioni sul trattamento del cancro.

Può anche essere utilizzato per studiare altri sistemi come il traffico cellulare. Le nanoparticelle possono essere coniugate con un ligando bersaglio e visualizzate in vivo o in vi in vitro attraverso l'uso di un agente di imaging che dimostra la tecnica. Oggi saranno due tecnici del nostro laboratorio, Rohit Sukumar e Natalie Cummings, ad iniziare la sintesi del copolimero PLGA PEG a sciogliere PLGA, carbossilato in acetonitrile ad una concentrazione di cinque millimolari con una delicata agitazione.

Quindi aggiungere abbastanza NHS ed EDC per ottenere concentrazioni di 25 millimolari, fornendo un eccesso metrico di cinque volte la storia rispetto al PLGA, agitare delicatamente la soluzione per circa un'ora per consentire al carbossilato di PLGA di essere convertito in PGA NHS. Dopo un'ora, precipitare il prodotto di reazione PGA NHS aggiungendo la soluzione di lavaggio metanolo a circa 10 volte il volume, eccesso di metanolo alla soluzione centrifugare la soluzione a 2000 volte G in pellet, il P-L-G-A-N-H-S dopo la centrifugazione scartare il NIN SUP per rimuovere le tracce di EDC e NHS. Questa procedura di lavaggio con metanolo viene ripetuta almeno tre volte.

Al termine del lavaggio. Asciugare il P-L-G-A-N-H-S sotto vuoto per 30 minuti per rimuovere eventuali tracce della soluzione di lavaggio. Ora il rosso scioglie il pellet P-L-G-A-N-H-S in aceto NI trial alla stessa concentrazione che è stata inizialmente utilizzata per sciogliere il PLGA.

Una volta sciolto. Aggiungere il PEG etero bifunzionale alla soluzione PLGA. Aggiungere una concentrazione di cinque millimolari.

Incubare la soluzione di miscela per 24 ore mescolando costantemente dopo 24 ore. Precipitare il prodotto di reazione del copolimero a blocchi PLGA PEG aggiungendo metanolo in eccesso. Eseguire il processo di lavaggio e centrifugazione e altre tre volte per rimuovere tutto il piolo non reattivo in eccesso.

Quando la fase finale della sintesi si asciuga, il copolimero a blocchi PLGA PEG sotto vuoto, la precipitazione di nanoparticelle inizia con la dissoluzione del copolimero a blocchi PLGA PEG e del farmaco da incapsulare nel solvente A-P-L-G-A. La scelta del solvente è fondamentale in quanto influenza le proprietà della nanoparticella. Quindi aggiungere la miscela di polimero-farmaco, goccia a goccia fino a 3-10 volumi di acqua di agitazione per ottenere una concentrazione finale di polimero di circa tre milligrammi per millilitro. Goccia a goccia.

L'aggiunta della soluzione organica alla fase acquosa è fondamentale per la formazione di nanoparticelle della dimensione corretta. Continuare l'agitazione per due ore a pressione ridotta per consentire alle nanoparticelle di formarsi per autoassemblaggio e rimuovere le tracce del solvente organico. Dopo due ore di agitazione.

Concentrare le nanoparticelle per centrifugazione a 2.700 volte G per 10 minuti utilizzando un filtro Amon. Quindi lavare le nanoparticelle con PBS per rimuovere qualsiasi farmaco non intrappolato e seguire con la centrifugazione. Infine, ricostituire le nanoparticelle in PBS A questo punto.

La caratterizzazione biofisica di base, comprese le dimensioni, la carica superficiale e l'efficienza di caricamento del farmaco, può essere eseguita per comprendere meglio le proprietà delle nanoparticelle. Le nanoparticelle possono essere conservate come descritto nel protocollo scritto per caratterizzare la microscopia elettronica a trasmissione di nanoparticelle PLGA PEG è stata utilizzata per confermare le dimensioni, la distribuzione e la struttura delle nanoparticelle. La dimensione delle particelle è generalmente nell'ordine dei nanometri.

Particelle di grandi dimensioni con distribuzioni dimensionali non uniformi potrebbero indicare un errore nella reazione di coniugazione o che il metodo di nanoprecipitazione necessita di ottimizzazione. Di seguito è riportato uno studio cinetico sul rilascio del farmaco in cui l'efficienza di carico e il rilascio di paclitaxel sono stati quantificati con l'HPLC standard. Quantità fisse note delle nanoparticelle sono state dializzate a intervalli di tempo fissi.

Il contenuto nell'unità di dialisi è stato raccolto ed è stato aggiunto un volume uguale di solvente organico per sciogliere le nanoparticelle. L'HPLC è stata quindi eseguita su questi campioni. Per quantificare il contenuto di Paclitaxel, una volta padroneggiata, questa tecnica di nano precipitazione può essere eseguita correttamente in tre ore.

Ricordare, quando si esegue questa tecnica, di aggiungere sempre lentamente la fase organica alla fase acquosa per evitare la generazione di particelle di grandi dimensioni dopo il suo sviluppo. Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori sul cancro nel campo della nanomedicina per esplorare l'uso di farmaci scarsamente solubili che una volta erano ritenuti troppo tossici nei pazienti oncologici dopo questa procedura. Altri metodi, come gli studi di efficacia in vivo o gli studi di imaging, possono essere eseguiti per rispondere a domande come l'efficacia dei farmaci scarsamente solubili, quando la tossicità sistemica non è più un problema, o se i ligandi mirati indirizzano correttamente le nanoparticelle a destinazione.