Un protocollo per il rilevamento e scavenging in fase gassosa radicali liberi nel fumo di sigaretta Mainstream

L'obiettivo generale di questa procedura è misurare la quantità di radicali liberi nel fumo principale del tabacco e valutare la capacità di rimozione di diversi antiossidanti. Questo viene ottenuto preparando innanzitutto dei filtri contenenti diversi composti catturanti, oltre a controlli senza filtro catturante. La preparazione è seguita da una simulazione del fumo con il fumo di sigarette di ricerca, fatto passare attraverso una soluzione di intrappolamento di spin.

La risonanza paramagnetica elettronica, abbreviata in ESR, viene quindi utilizzata per registrare gli spettri dei radicali intrappolati e di campioni di riferimento. Gli spettri ESR ottenuti successivamente vengono sottoposti ad analisi routine al fine di separare il segnale dei radicali intrappolati nella fase gassosa dal rumore di fondo e per quantificare la concentrazione dei radicali mediante un campione di riferimento. Alla fine, i risultati forniscono informazioni quantitative sul contenuto di radicali liberi nel fumo principale delle sigarette e stime della capacità di eliminazione degli antiossidanti naturali attraverso la spettroscopia ESR con intrappolamento di spin.

Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti di analisi del fumo di tabacco, come la cromatografia gassosa, è che la RPE è specificamente sensibile ai radicali liberi. Le implicazioni di questa tecnica possono contribuire a ridurre gli effetti nocivi del fumo di tabacco, poiché i radicali liberi rappresentano un importante gruppo di carcinogeni. Questo metodo può fornire informazioni utili nello studio dei radicali liberi presenti nel fumo del tabacco e può essere applicato anche ad altri sistemi, come i fumi industriali e il fumo di marijuana. Il Centro Nazionale di Ricerca Biomedica per la tecnologia di risonanza di spin elettronico, noto anche come cert, è il risultato della nostra vasta esperienza nello sviluppo della moderna tecnologia RPE.

Per i ricercatori impegnati nella risonanza paramagnetica elettronica, offriamo una vasta gamma di servizi a loro e alla comunità biomedica. Rendiamo regolarmente disponibili le nostre strutture per introdurre antiossidanti nel filtro della sigaretta. Prima di tutto, sciogliere gli antiossidanti, il pycnogenolo e l'estratto di uva in etanolo al 95% e sciogliere il licopene in acetone.

Regolare i volumi del solvente in base alla solubilità degli antiossidanti. Successivamente, combinare gli antiossidanti disciolti con carbonio attivo mescolando in condizioni anaerobiche per circa 12 ore. Le condizioni anaerobiche si ottengono spargendo Argonne nella miscela durante l'agitazione.

Dopo l'incubazione, filtrare la soluzione ed essiccare sotto vuoto. Quindi introdurre gli antiossidanti e il carbonio in un normale filtro in acetato tagliando prima il filtro in due pezzi. Inserire gli antiossidanti vegetali rivestiti tra i due pezzi del filtro per formare un "panino" costituito dal filtro con antiossidanti, e reinserire il tutto nel cilindro di carta delle sigarette.

Preparare il filtro di controllo nello stesso modo del filtro con antiossidante, senza aggiungere l'antiossidante prima dell'allestimento dell'esperimento. Le sigarette per la ricerca devono essere sconfezionate e mantenute in un ambiente a umidità costante utilizzando una soluzione satura di bromuro di sodio per un periodo minimo di due giorni. Recuperare i bocchini delle sigarette contenenti tabacco e collegarli al filtro combinato.

Eseguire la simulazione del fumo per analisi di routine a temperatura ambiente utilizzando un dispositivo per il fumo a singola porta, costituito da un aspiratore ad acqua o da una pompa a vuoto/ compressore d'aria collegato all'insieme di cattura in spin attraverso un raccordo a T con un'estremità aperta. Utilizzare un flussimetro per verificare il flusso di gas e regolarlo a circa 2,2 piedi cubi standard all'ora, regolando una valvola posizionata tra la pompa e lo sfiato. Fumare le sigarette di ricerca con un volume di boccata intensa di 35 millilitri per una durata di due secondi, ripetendo ogni 60 secondi.

L'estremità aperta del dispositivo per fumare deve essere tappata per eseguire le boccate e lasciata aperta tra una boccata e l'altra. Quando l'estremità è scoperta, il tiraggio attraverso la sigaretta è minimo, condizione che corrisponde a quella tra una boccata e l'altra. Effettuare 10 boccate intense per ogni sigaretta, raccogliendo i radicali liberi nella fase gassosa facendo passare il fumo principale della sigaretta attraverso un tampone filtrante Cambridge, per poi introdurlo nella soluzione di intrappolamento di spin.

La trappola di azoto liquido rimuove il vapore acqueo dal fumo principale, ma non influenza in modo significativo i radicali nella fase gassosa. Dopo l'ultima boccata, trasferire un'aliquote della soluzione di trappolamento in una provetta di vetro lunga circa 25 cm e con un diametro interno di tre millimetri. Poiché l'ossigeno allarga gli spettri ESR e riduce la sensibilità del metodo, desossigenare la soluzione mediante il metodo di congelamento-pompa-scongelamento: immergere innanzitutto la provetta in azoto liquido, poi evacuare la soluzione con una pompa a olio e successivamente scongelare la soluzione sotto argon.

Ripetere più volte questo metodo di congelamento, aspirazione e scongelamento. Successivamente, sigillare il tubo sotto vuoto. Il tubo è ora pronto.

Per ulteriori misurazioni di RPE, registrare spettri RPE in banda X su uno spettrometro Bruker EMX a una frequenza di 9,34 gigahertz. In condizioni standard, consultare il protocollo scritto per conoscere le impostazioni tipiche dello spettrometro utilizzate. Per questi esperimenti, effettuare 25 accumuli RPE, che richiedono tipicamente circa 20 minuti.

Sebbene gli addotti di cattura del spin siano relativamente stabili nelle condizioni sperimentali dopo 12 ore, l'intensità dei segnali ESR in soluzione di benzene è diminuita di un fattore cinque. Per quantificare la concentrazione dell'addotto di cattura, integrare lo spettro iniziale di prima derivata ESR. Lo spettro di assorbimento risultante mostra un fondo ampio di tipo singoletto, probabilmente dovuto a prodotti di fuliggine e catrame presenti nel fumo.

Dopo la sottrazione di questo fondo, integrare il tripletto separato del composto trappolato. Un'ulteriore integrazione è necessaria per ottenere la concentrazione del radicale libero. I valori dei doppi integrali per la soluzione di trappolamento di spin vengono confrontati con quelli di una soluzione di un radicale nitroxilico tempo di concentrazione nota, ottenuti dall'esperimento qui dimostrato, nonché con ulteriori calcoli riportati nel protocollo scritto.

È stata ottenuta una concentrazione di radicali liberi nella fase gassosa del fumo principale di sigaretta di circa 7,1 × 10⁻⁹ M. Da questo valore, si è determinato che il numero totale di radicali intrappolati dalla fase gassosa di un'intera sigaretta è di circa 1,5 × 10¹⁵. Durante questo esperimento, le misurazioni iniziali hanno prodotto segnali ESR deboli e una bassa riproducibilità a causa dell'umidità nel flusso di fumo.

Per risolvere questo problema, è stato aggiunto un trappola di azoto liquido al dispositivo di simulazione del fumo tra il filtro Cambridge e la soluzione trappola di spin. La trappola di azoto liquido ha rimosso l'acqua dal flusso di fumo principale della sigaretta congelandola rapidamente e catturandola sulla parete interna del tubo di vetro. Ciò ha notevolmente migliorato i segnali di RPE e ha permesso di ottenere risultati altamente riproducibili.

Sono stati osservati diversi livelli di effetto scavenger degli antiossidanti vegetali nei confronti dei radicali liberi nella fase gassosa del fumo principale delle sigarette e vengono presentati i relativi tassi di rimozione. Il licopene e l'estratto di semi d'uva hanno mostrato i tassi più elevati, mentre un tasso inferiore è stato osservato per il pycnogenol. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in meno di un'ora se effettuata correttamente.

Dopo aver eseguito la procedura, è importante far passare il fumo attraverso una trappola a azoto liquido. Ciò migliora la qualità degli spettri di SR e la riproducibilità una volta sviluppati. La tecnica ha aiutato i ricercatori nel settore della salute e dell'ambiente a esplorare e valutare la presenza di radicali liberi pericolosi per la salute in vari composti volatili.

Dopo aver visto il video, dovresti avere una buona comprensione di come quantificare i radicali liberi nel fumo principale del tabacco al fine di ridurre gli effetti pericolosi del fumo.