Monitoraggio spaccati Caspase-3 Attività e apoptosi di cellule oligodendrogliali Immortalata dal vivo utilizzando cellule Imaging e Cleaveable fluorogenici-dye seguenti supporti di potassio indotta depolarizzazione della membrana

Questa procedura consente di monitorare in tempo reale la morte delle cellule gliali oligo DDR. Ciò si ottiene prima coltivando le cellule, quindi le cellule vengono preparate per l'imaging di cellule vive. Il passo successivo è fornire un trattamento alle cellule e monitorare gli effetti utilizzando la microscopia a fluorescenza.

Il passaggio finale consiste nell'eseguire l'analisi dei dati. In definitiva, i risultati mostrano i tassi di morte cellulare in una popolazione cellulare a seguito di un trattamento o di uno stimolo monitorando la fluorescenza nucleare da un colorante fluro attivato dalla caspasi. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come l'immunocolorazione, è la capacità di raccogliere più punti temporali contemporaneamente.

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nella biologia cellulare, come le risposte a farmaci, reagenti e vari trattamenti. Ora, questo metodo può fornire informazioni sulla morte all'interno delle colture cellulari. Può essere applicato anche ad altri sistemi come ex vivo, tessuti organotipici, comprese le fette di cervello.

In generale, gli individui che non conoscono questo metodo avranno difficoltà ad adattarsi a lavorare con tessuti vivi piuttosto che con tessuti fissi. La dimostrazione visiva di questa tecnica è importante in quanto ci sono molti passaggi per preparare campioni di cellule vive rispetto al tessuto fissato. Per prima cosa scongelare le cellule gliali N 19 oligo droog congelate in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius mentre le cellule si scongelano.

Aggiungere sette millilitri di DMEM ad alto contenuto di glucosio integrato con il 10% di FBS e l'1% di penicillina streptomicina a un piatto di coltura di 10 centimetri. Quindi aggiungere la sospensione cellulare goccia a goccia alla piastra e agitare delicatamente la piastra di Petri per disperdere le cellule in modo uniforme. Coltiva le cellule a 34 gradi Celsius in un incubatore ad anidride carbonica da 5 centesimi per quattro ore dopo quattro ore.

Aspirare il supporto dalle piastre per rimuovere l'eventuale DMSO residuo. Crioprotettore. Sostituire con sette millilitri di terreno fresco dopo quattro-sette giorni di crescita. Quando le cellule hanno raggiunto il 70-80% di confluenza, aspirare il terreno e pipettare un millilitro di gocce sul foglio cellulare, incubato a temperatura ambiente per cinque minuti.

Quindi raccogliere le cellule del seme successivo, un piatto di coltura tissutale di 10 centimetri con le cellule raccolte a una densità di 0,1 volte 10 per sei cellule per millilitro, e posizionare questo piatto nell'incubatore di coltura tissutale. Dopo un ulteriore massaggio, le cellule possono essere piastrate per esperimenti di imaging di cellule vive. Per fare ciò, raccogliere le cellule come prima, quindi rimuovere 30 microlitri di sospensione cellulare e contare le cellule utilizzando un emocitometro.

Quindi, utilizzare una pinza sterile per posizionare i vetrini di copertura in vetro non rivestiti. Nei pozzetti di una piastra a sei pozzetti, aggiungere celle al pozzetto a una densità di 0,1 volte 10 per sei celle per millilitro. In due millilitri di DMEM privo di fenoli, i mezzi ad alto contenuto di glucosio integrati con il 10% di FBS e l'1% di penicillina, la streptomicina consentono alle cellule di crescere durante la notte a 34 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica prima della trasfezione.

Il giorno successivo, combinare 100 microlitri di terreno privo di siero da 0,5 a quattro microgrammi di plasmide purificato, DNA e quattro microlitri di FU gene hd. Agitare delicatamente la miscela due volte e poi lasciare che il DNA si complessi a temperatura ambiente per cinque minuti. Trascorso il tempo di incubazione, aggiungere la miscela di DNA HD del gene FU direttamente alle cellule in coltura.

Inclinare delicatamente il piatto per mescolare. Quindi coltivare le cellule per altre 48 ore a 34 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica prima del trattamento o della sperimentazione. Per prima cosa accendere la scatola di controllo dello strumento LCI Cham light live cell.

Questo dovrebbe essere fatto tre ore prima dell'inizio dell'esperimento per garantire un riscaldamento completo dello stadio. Come minimo, la scatola di controllo deve essere accesa un'ora prima di iniziare l'esperimento. Successivamente, lavorando in una cappa a flusso, spruzzare la camera di coltura di tipo magnetico LCI Cham light e le pinze con etanolo al 70% e lasciarle asciugare per cinque minuti.

Rimuovi le cellule dall'incubatrice ed esaminale al microscopio per confermare che siano sane. Le celle devono apparire duranti e ben distese sul vetrino coprioggetto con numerosi processi a membrana. Le cellule con un numero ridotto di estensioni di processo o un nucleo di forma irregolare sono probabilmente stressate dalla trasfezione e non sono adatte per ulteriori esperimenti che lavorano nella cappa di flusso.

Inclinare la piastra a sei pozzetti e rimuovere il vetrino coprioggetti con una pinza. Posizionare rapidamente la cella del vetrino coprioggetto con il lato rivolto verso l'alto nella piastra inferiore della camera. Non lasciare asciugare il vetrino coprioggetto.

Quindi, collegare il corpo principale magnetico della camera di coltura e aggiungere 500 microlitri di terreno dalla piastra originale a sei pozzetti sulla parte superiore del vetrino di copertura. Il riutilizzo del terreno riduce la quantità di stress posto sulle cellule causato dai cambiamenti ambientali e può anche essere utile per valutare i fattori secreti extracellulari. Dopo aver aggiunto il terreno, posizionare il coperchio di vetro sulla camera di coltura e utilizzare una treccia Kim wipes al 70% per rimuovere qualsiasi materiale residuo che potrebbe interferire con la microscopia dalla parte inferiore del vetrino coprioggetto.

Posizionare la camera di coltura nell'incubatore a 34 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica per 30 minuti. Questo passaggio assicurerà che la camera stessa si riscaldi di 34 gradi per ridurre lo spostamento del vetrino coprioggetto. Man mano che il metallo si riscalda, è necessario lavorare con l'illuminazione ambientale della stanza il più bassa possibile durante i passaggi successivi.

Per prima cosa, Thora ha precedentemente preparato elequa di nuke view a temperatura ambiente. Quindi recuperare la camera di coltura dall'incubatore e posizionarla rapidamente nella camera ambientale del microscopio. Accendere il serbatoio di anidride carbonica premiscelata al 5% con doppio regolatore.

Successivamente, utilizzando l'obiettivo 10 volte con la lampada del microscopio impostata a circa 2,5 volt e il tempo di esposizione a 240 millisecondi. Messa a fuoco utilizzando la microscopia a campo chiaro per visualizzare le cellule sul monitor del computer. Quindi aggiungere una concentrazione di 80 millimolari di ione potassio o altro induttore dell'apoptosi alle cellule tramite scambio di terreno con perfusione lenta e locale utilizzando una pompa peristaltica.

Il substrato nuke view 4 88 è stabile in coltura cellulare per esperimenti che durano fino a 36 ore. Pertanto, è possibile condurre esperimenti per questo periodo di tempo. Per prima cosa impostare il microscopio per visualizzare la fluorescenza della proteina fluorescente rossa e verde.

Quindi fare clic sul canale rosso per visualizzare le celle trasfettate. Seleziona e salva circa 12 fotogrammi in cui sono presenti diverse celle trasfettate e salva questi punti dello stadio XY. Ogni sei minuti il microscopio acquisisce le immagini nel canale rosso in campo chiaro e nel canale verde in questi punti di fase salvati.

Dopo aver raccolto più punti XY da esperimenti duplicati o triplicati, compilare i dati da esperimenti separati eseguiti in giorni diversi ed eseguire l'analisi dei dati e i test statistici come descritto nel protocollo scritto per confrontare il rapporto tra le celle negative della baia CASP e quelle positive della baia CASP. Nuke view 4 88 può indicare un aumento del tasso di apoptosi delle colture cellulari gliali N 19 oligo DDR. A seguito di un trattamento con un'alta concentrazione extracellulare di potassio, queste immagini di base sono state acquisite utilizzando un obiettivo 10 volte.

Le cellule N 19 sono state trasfettate con RFP e sono state trattate con tre microlitri di nuke view, 4 88 substrato per le cellule di controllo, o tre microlitri di nuke view, 4 88 substrato e 80 millimolari di potassio. Queste immagini illustrano che il numero di cellule apoptotiche aumenta nel tempo, tre, sei e nove ore dopo il trattamento con 80 millimolari di potassio in condizioni di controllo, non sono state osservate quantità significative di apoptosi rispetto alle colture trattate con 80 millimolari di potassio. Il segnale verde di fondo osservato nelle condizioni di controllo indica le cellule che stanno subendo apoptosi senza l'aggiunta di potassio extracellulare.

Un corso di 12 ore è adeguato per gli studi che coinvolgono insulti neurologici Dopo 12 ore, le colture trattate con potassio hanno dimostrato circa il 45% di morte cellulare. Praticamente nessuna delle cellule nell'esperimento di controllo mostra apoptosi entro il punto temporale di 12 ore. Anche se in altre situazioni, gli esperimenti potrebbero essere necessari per durare più a lungo.

Questo grafico mostra l'aumento delle tre cellule positive della caspasi nel corso del tempo dell'esperimento di 12 ore. Una volta infastidita, questa tecnica può essere eseguita in un'ora e i dati possono essere raccolti durante la notte se eseguita correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di essere coerenti tra i trattamenti Dopo questa procedura.

Altri metodi, come l'immunocolorazione, possono essere utilizzati per esaminare altre proteine a valle coinvolte nei percorsi studiati. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come preparare i campioni per l'imaging. Acquisisci un set di dati e analizza i tuoi dati.