Name: Monitoraggio spaccati Caspase-3 Attività e apoptosi di cellule oligodendrogliali Immortalata dal vivo utilizzando cellule Imaging e Cleaveable fluorogenici-dye seguenti supporti di potassio indotta depolarizzazione della membrana (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-01-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 45 s
Description: Scopri l'imaging in tempo reale dell'apoptosi mediata da caspasi-3 in cellule oligodendrogliali N19 utilizzando il substrato NucView 488. Questo metodo consente di monitorare la morte cellulare programmata con microscopia a fluorescenza.

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Questo laboratorio è stato sostenuto dal Canadian Institutes of Health Research, le scienze naturali e ingegneria Research Council del Canada, e la Multiple Sclerosis Society of Canada (MSSC). GST è stato il destinatario di una borsa di studio di dottorato dal MSSC. Siamo grati al Dott. Joan Boggs (Hospital for Sick Children di Toronto) per molte utili discussioni e commenti su questo manoscritto. Siamo grati a Biotium per il loro generoso dono di ulteriori 488 NucView caspasi-3.

1. Scongelamento e Cellule coltura <ol><li> Ottenere stock di surgelati immortalato N19-oligodendrogliali cellule nei negozi di azoto liquido a lungo termine. </li><li> Immergere fiala contenente cellule a 37 ° C bagnomaria fino a quando la sospensione cellulare è completamente scongelati. </li><li> Aggiungere 7 ml di DMEM (Dulbecco Modified mezzo di Eagle) con alto glucosio supplementato con 10% FBS (siero fetale bovino) e 1% penicillina / streptomicina per un piatto di 10 centimetri cultura. </li><li> Aggiungere la cellula-sospensione goccia a goccia alla piastra, e agitare delicatamente e rock la piastra Petri per disperdere le cellule in modo uniforme. </li><li> Celle di coltura a 34 ° C / 5% di CO2 incubatore. </li><li> Dopo 4 ore, i media aspirare dai piatti per rimuovere qualsiasi residuo di DMSO (dimetilsolfossido), che era stato usato come un crioprotettore, e sostituirla con mezzi freschi (7 ml di DMEM ad alto glucosio mezzi di comunicazione integrato con il 10% FBS e 1% penicillina / streptomicina) . </li></ol> 2. Cellule Passaging <ol><li> Al 70-80%confluenza (4-7 crescita giorni), aspirare i media dalle cellule. </li><li> Aggiungere 1 ml di tripsina 0,25% al ​​piatto. Pipetta tripsina per staccare le cellule (circa 5 minuti). </li><li> Effettuare le diluizioni appropriate per le condizioni sperimentali e il passaggio di ulteriori 10 cm per piatto futuri esperimenti con una densità di cellule non meno di 0,1 x 10 6 cellule / ml. </li></ol> Nota: Si dovrebbe passare le cellule almeno due volte dopo lo scongelamento prima di usarli per esperimenti. 3. Conteggio e placcatura cellule <ol><li> Alle cellule piastra per live-cell imaging, trypsinize come descritto in precedenza. </li><li> Rimuovere circa 30 ml di cellule e contare con un emocitometro. </li><li> Inserire un coprioggetto di vetro rivestito in un piatto ben 6. Aggiungere celle al pozzo ad una densità di 0,1 x 10 6 cellule / ml in 2 mL fenolo senza DMEM high-glucosio media, supplementato con 10% FBS e 1% penicillina / streptomicina, a 34 ° C / 5% di CO 2. </li><li> Permetterecellule di crescere durante la notte (16-20 ore) a 34 ° C / 5% di CO 2 prima di trasfezione. </li></ol> 4. Trasfezione <ol><li> Combina 100 ul serum-free media, 0,5-4 mg DNA plasmidico purificato, e 4 microlitri FuGENE HD (Roche). Vortex delicatamente per mescolare. </li><li> Vortice di nuovo brevemente e lasciare il DNA al complesso per 5 minuti a temperatura ambiente, quindi aggiungere FuGENE miscela DNA HD direttamente alle cellule in coltura. Inclinare delicatamente la piastra per miscelare. </li><li> Coltivare le cellule per ulteriori 48 ore a 34 ° C / 5% CO 2 prima del trattamento o di sperimentazione. </li></ol> 5. Le cellule preparazione per il Live-Cell Imaging (LCI) <ol><li> Accendere il Chamlide LCI live-cell box strumento di controllo per almeno 1 h prima si desidera avviare l'esperimento. La centralina di controllo regola anche la temperatura e l'umidità all'interno del Chamlide LCI, e regola il flusso dei premiscelati 5% di CO 2. </li></ol> Nota: Si consiglia diattivare la casella di controllo fino a 3 ore prima di cominciare gli esperimenti per garantire che l'intera fase raggiunge i 34 ° C. Questo passo sarà ridurre la deriva focale, che è causato da fluxulation e la dilatazione termica del metallo come stadio si riscalda, durante l'imaging. <ol start="2"><li> Lavorare in un flusso cappuccio, spruzzare il Chamlide magnetico di tipo camera di cultura, e pinzette, con il 70% di etanolo e lasciarle asciugare per 5 minuti. </li><li> Rimuovere le cellule da incubatore e confermano che sono sani. Dovrebbero apparire aderente e ben diffuse sul vetrino di vetro con processi a membrana numerosi. Le cellule che sono stressati dalla transfezione non sono adatti per la sperimentazione, e avrà un ridotto numero di estensioni di processo, e spesso hanno un nucleo di forma irregolare. </li><li> Inclinare il 6 pozzetti e rimuovere il vetrino con le pinzette. Rapidamente posizionare il lato cellula coprioggetto su nel piatto fondo della camera di cultura. Non lasciare che il vetrino ad asciugare. </li><li> Attaccare il principale magneticocorpo della camera di cultura e aggiungere 500 microlitri di media dall'originale 6 pozzetti sulla parte superiore del vetrino coprioggetto. Riutilizzare questo supporto diminuirà la quantità di stress sul posto le cellule causato dai cambiamenti ambientali, e può anche essere utile per valutare i fattori extracellulari secreti. </li><li> Mettere il coperchio di vetro della camera di cultura. </li><li> Utilizzare un KimWipe spruzzato con il 70% di etanolo di togliere qualunque materiale residuo dal fondo del vetrino, che interferirebbe con la microscopia. </li><li> Posizionare la camera di cultura nel 34 ° C / 5% CO 2 incubatore per 30 min. Questa operazione farà sì che la camera stessa si riscalda a 34 ° C per ridurre lo spostamento del vetrino come il metallo si riscalda. </li></ol> 6. Impostazioni microscopio Immagini sono state acquisite qui utilizzando un microscopio Leica DMIRE2 invertito con un obiettivo relè personalizzati ed emissione passaruota filtro per il caricamento delle cartucce delle ruote multiple (Quorum Technologies Inc., Guelph, ON). <ol><li> Campo chiaro - Lampada impostato a 2,5 V e tempo di esposizione a 240 ms. </li><li> Proteina fluorescente rossa (RFP) - Guadagno fissato a 140 per 200 ms. </li><li> Proteina verde fluorescente (GFP) - Guadagno fissato a 140 per 500 ms. </li><li> Il nostro microscopio ha una lampada dimmerabile piuttosto che un disco rotante per controllare la quantità di luce disponibile per le cellule. Gestiamo i nostri esperimenti con la luce al 90% della massima intensità della lampada. </li></ol> 7. Il trattamento di cellule con induttori apoptosi e NucView 488 Caspasi-3 substrato <ol><li> E 'importante preparare grandi scorte di induttori dell'apoptosi in anticipo e congelarli in aliquote, in modo che le concentrazioni saranno coerenti tra esperimenti. </li><li> Il NucView 488 substrato è sensibile alla luce. Preparare aliquote di 15 microlitri per ridurre i tubi di gelo / disgelo, e conservare a -20 ° C coperto di carta stagnola. Lavora con la luce ambiente della stanza più bassa possibile per ridurre l'esposizione del NucVIEW 488 substrato alla luce, prima del suo utilizzo. </li><li> Recuperare la cultura della camera rapidamente dal termostato in modo che le cellule non sono esposti a una riduzione della temperatura. Posizionare la camera di cultura sulla camera ambientale del microscopio, e utilizzare pinze per tenere la camera di cultura di muoversi. A questo punto si dovrebbe anche abbassare le luci della stanza. </li><li> Accendere il 5% premiscelato CO 2 serbatoio con doppio regolatore. </li><li> Utilizzando l'obiettivo 10x, messa a fuoco per trovare le celle sul monitor del computer con campo chiaro microscopia. Nota: si vorrebbe utilizzare la più grande apertura numerica sull'obiettivo con l'ingrandimento desiderato di ridurre il tempo di esposizione. </li><li> Fornire induttori di apoptosi nelle cellule (nel nostro caso 80 mM di potassio, o 100 mM glutammato), uno dei seguenti metodi possono essere utilizzati. Useremo la consegna di 80 mM di potassio come un esempio, utilizzando KCl sciolti come concentrato 10x nei nostri terreni di coltura tipica. <ol><li> Mezzi di scambio by perfusione lenta e locale: - Utilizzare una pompa peristaltica di mezzi di scambio nella camera di cultura con i nuovi media contenente 80 mM di potassio. - Una estremità del tubo consegnerà 10 ml di uno stock di 80 mM di potassio sciolto in fenolo-free DMEM, e l'altra estremità del tubo sarà rimuovere il supporto dalla camera. - Vuoi che almeno uno scambio di supporti 10x per garantire che i media nella camera di sinistra ha la corretta concentrazione di potassio. - Dopo che i media si scambia, aggiungere 3 ml di NucView 488 substrato ai media nella camera. Pipetta per mescolare. </li><li> Aggiunta diretta di 80 mm K + e NucView 488 substrato di media in camera di cultura: - Preparare una soluzione stock di 10x 80 mM di potassio sciolto in fenolo-free DMEM. - Aggiungere 3 ml di substrato NucView 488 a 50 l di 10x 80 mM di potassio. Pipetta per mescolare. Aggiungi a 500 microlitri fenolo senza DMEM in camera di cultura. Nota: questo metodo èpreferito se siete interessati a mantenere o valutare la crescita o altri fattori secreti che possono essere presenti nei media originale. Abbiamo scoperto che la NucView 488 substrato è stabile in coltura cellulare per la sperimentazione della durata fino a 36 h. </li></ol></li></ol> 8. Live-cell Imaging <ol><li> Clicca sul canale rosso per visualizzare le cellule transfettate. </li><li> Selezionare e salvare intorno ad una decina di frame in cui ci sono parecchie cellule transfettate e salvare questi "punti tappa XY". A seconda della quantità di memoria del computer, si può essere limitato al numero di punti tappa che si sarà in grado di acquisire. </li><li> Hanno la immagini al microscopio di cattura (in campo chiaro, canale rosso e il canale verde) in questi stadio salvato punti ogni 6 minuti. </li><li> Qualsiasi colorazione verde che si vede durante le prime fasi degli esperimenti indicano probabile cellule che sono già in fase di apoptosi, di solito a causa di trasfezione e / o di stress ambientale. ApoptOsis a causa di trattamenti sperimentali verrà rilevato in un timepoint dopo l'esperimento. </li></ol> 9. Analisi Statistica <ol><li> Per ogni esperimento, si programma il microscopio per acquisire punti XY più di raccogliere un set di dati di grandi dimensioni in modo efficiente. Ogni esperimento è eseguito in doppio o triplo, ed i dati sono compilati da esperimenti separati eseguiti in giorni diversi. Da ogni set di dati, analizziamo fino a 15 campi di visualizzare e confrontare il rapporto della caspasi-negativo alle cellule di caspasi-cellule positive (numero totale di celle nel campo di vista / numero totale di caspasi-cellule positive). </li><li> Le misurazioni registrate da ciascun set di dati sono raggruppati in un set campione più ampio, e sono quindi confrontati tra loro utilizzando una tabella ANOVA (p = 0,05). Mostriamo gli errori standard della media (SEM) di ogni esperimento, e quindi confrontare la differenza di mezzi con l'esecuzione di un test di Tukey mezzo di confronto (p = 0,05) per determinare which trattamenti sono significativamente diverse l'una dall'altra. </li></ol> 10. Rappresentante Risultati Abbiamo descritto un esperimento per illustrare come il NucView 488 substrato può indicare un aumento del tasso di apoptosi di N19-Corte di Appello di colture cellulari a seguito di un trattamento con un'alta concentrazione di potassio extracellulare. L'N19-cellule sono state trasfettate con richiesta di offerta, e sono stati trattati con 3 ml NucView 488 substrato (controllo), o 3 ml NucView 488 substrato e 80 mm [K +] (trattamento). Le cellule sono state monitorate e le immagini sono state acquisite nel corso di un corso di 12 ore di tempo, che è adeguata per gli studi che coinvolgono insulti neurologici (Figura 1A). In condizioni di controllo, non abbiamo osservato una notevole quantità di apoptosi rispetto al 80 mm [K +] colture trattate (box hash), che ha mostrato circa il 45% delle cellule morte dopo 12 ore (Figura 1B). Il segnale verde sfondo osservanod nelle condizioni di controllo indica le cellule che sono in fase di apoptosi senza l'aggiunta di potassio extracellulare. Praticamente nessuna delle celle nella apoptosi mostra esperimento di controllo dal punto 12 h di tempo, anche se in altre situazioni gli esperimenti può essere richiesto di eseguire più a lungo. Le immagini sono state acquisite utilizzando un obiettivo 10x. Bar = 100 micron. <img alt="Figura 1a" src="/files/ftp_upload/3422/3422fig1.jpg"> <img alt="Figura 1b" src="/files/ftp_upload/3422/3422fig1b.jpg"> Figura 1. (A) A 12 esperimento tempo h corso di N19 culture Corte di Appello di 48 ore post-trasfezione esprimono RFP-MBP (canale rosso) con 3 ml di NucView 488 substrato (canale verde). Le culture sono stati trattati con una concentrazione finale di 80 mM [K +] (pannelli a sinistra), o nessun trattamento come controllo (pannelli di destra). Le immagini sono state acquisite a intervalli di 6 minuti, e l'attivazione significativa di spaccati caspasi-3 (segnale verde) si può osservared in colture trattate con 80 mM [K +] all'interno del nucleo cellulare (scatola hash) rispetto al esperimento di controllo. (B) Percentuale di spaccati caspasi-3 celle (calcolato dividendo il numero totale delle cellule nel campo visivo di il numero totale di caspasi-cellule positive). Rispetto alle condizioni di controllo, abbiamo osservato circa la morte delle cellule del 45% a seguito K +-trattamento di 12 h. SVideo 1. Un h 12 corso esperimento tempo di N19-Corte di Appello di culture 48 ore post-trasfezione esprimono RFP-MBP (canale rosso) con 3 ml di NucView 488 substrato (canale verde), insieme con vivaci immagini a campo e una a tre vie immagine risultante dalla fusione, in seguito al trattamento con 80 mM [K +]. SVideo 2. Un corso di 12 ore il tempo di sperimentare N19-Corte di Appello di culture 48 ore post-trasfezione esprimono RFP-MBP (canale rosso) con 3 ml di NucView 488 substrato (canale verde), con campo chiaro images e un tre vie immagine fusa. Nessun trattamento è stato applicato alle culture e N19-OLGs può essere visto migrazione attraverso il campo microscopio in contrasto con colture di cellule trattate con 80 mM [K +] (confrontare con SVideo 1).

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</ol>

Gli autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare.

Anche se questo non è l&#39;unico prodotto disponibile per il rilevamento fluorogenici apoptosi, ci sono diversi vantaggi significativi a utilizzare il NucView 488 substrato. Uno dei vantaggi principali è la capacità di seguire l&#39;apoptosi in cellule vive in tempo reale, mentre la maggior parte prodotti alternativi o richiedono la lisi cellulare o hanno scarsa permeabilità delle cellule. Altri benefici includono ad alta sensibilità per il riconoscimento della caspasi-3, la permeabilità delle cellule di alta, bassa citotossicità, e nessuna interferenza con la progressione della apoptosi. Il substrato è anche bassa fluorescenza di fondo fino a quando non viene scissa e entra nel nucleo, che elimina fluorescenza di fondo. La sequenza della caspasi-3 riconoscimento contiene 3 cariche negative e il legame al DNA colorante ha una carica positiva 2. Il DEVD-NucView 488 molecola ha quindi una carica netta negativa, che impedisce l&#39;attivazione e vincolante del colorante al DNA nelle cellule in cui caspasi non è attivo. Maintaining coerenza tra gli esperimenti è necessario per essere in grado di tracciare confronti significativi tra le repliche. Uno dei parametri principali per mantenere costante è la densità delle cellule, in quanto influenza il tasso di trasfezione. Ottenere elevati tassi di trasfezione in immortalato N19-Corte di Appello di colture cellulari è più difficile che con le altre linee cellulari comuni come HeLa o HEK293, ed è fortemente dipendente dalla densità, nella nostra esperienza di 12, 13. La nostra migliore efficienza di trasfezione per le cellule sono state ottenute con Fugene HD (Roche) e sono normalmente circa il 15%, ma può raggiungere oltre il 30%, a seconda del costrutto. Conteggio delle cellule attento aiuterà ad ottenere tassi di trasfezione coerente. E &#39;anche importante per esporre le cellule dai trattamenti diversi per lo stesso grado di stress ambientale, in particolare quando si misurano i tassi di apoptosi. In particolare, la durata del tempo durante il quale sono esposte le cellule ai reagenti di trasfezione, o la quantità di esposizione alla luce, sono importanti variabili ambientaliAbles di prendere in considerazione, e deve rimanere costante attraverso esperimenti. Per le nostre applicazioni, abbiamo scoperto che raccogliendo un gran numero di campi-di-vista fornisce un campione sufficientemente ampio per fare confronti statisticamente significative [ibidem].

Tabella di reagenti e attrezzature specifiche <table border="1"><tr><th> Nome del reagente </th><th> Azienda </th><th> Numero di catalogo </th></tr><tr><td> NucView 488 Kit Caspasi-3 Saggio di cellule vive </td><td> Biotium </td><td> 30029 </td></tr><tr><td> FuGENE HD reagenti di trasfezione </td><td> Roche </td><td> 04709705001 </td></tr><tr><td> Dulbecco modificato Aquila Media </td><td> Gibco </td><td> 31053-028 </td></tr><tr><td> 0,25% tripsina </td><td> Gibco </td><td> 15050-065 </td></tr><tr><td> Siero bovino fetale </td><td> Gibco </td><td> 12483-020 </td></tr><tr><td> Penicillina / streptomicina </td><td> Gibco </td><td> 15140122 </td></tr><tr><td> # 1,5-25 mm vetro coprioggetto </td><td> Warner Instruments </td><td> 64-0715 </td></tr><tr><td> Chamlide CMB magnetico camera di coltura per 25 millimetri coprioggetto </td&gt; <td> Quorum Technologies </td><td> CM-B-40 </td></tr><tr><td> Cellstart coltura tissutale 10 piatti centimetri </td><td> VWR </td><td> 82050-576 </td></tr><tr><td> BD Falcon 6-bene di coltura tissutale piatti </td><td> VWR </td><td> CA62406-161 </td></tr></table>

monitoraggio spaccati caspase-3 attività e apoptosi di cellule oligodendrogliali immortalata dal vivo utilizzando cellule imaging e cleaveable fluorogenici-dye seguenti supporti di potassio indotta depolarizzazione della membrana

Monitoring Cleaved Caspase-3 Activity and Apoptosis of Immortalized Oligodendroglial Cells using Live-cell Imaging and Cleaveable Fluorogenic-dye Substrates Following Potassium-induced Membrane Depolarization

Il sistema nervoso centrale possono sperimentare una serie di sollecitazioni e insulti neurologici, che possono avere numerosi effetti negativi che alla fine portano ad una riduzione della popolazione neuronale e la funzione. Assoni danneggiati possono rilasciare molecole tra cui potassio o eccitatorio glutammato nella matrice extracellulare, che a loro volta, possono produrre ulteriori insulti e lesioni alle cellule gliali di supporto tra cui astrociti e oligodendrociti 8, 16. Se l&#39;insulto persiste, le cellule saranno sottoposti a morte cellulare programmata (apoptosi), che è regolamentato e attivato da una serie di cascate di segnale ben consolidata trasduzione 14. Apoptosi e necrosi dei tessuti può verificarsi dopo trauma cranico, ischemia cerebrale, e convulsioni. Un esempio classico di regolazione apoptotica è la famiglia di cisteina-dipendente aspartato-diretto proteasi, o caspasi. Proteasi caspasi attivate tra cui sono stati implicati nella morte delle cellule in risposta alla neuro cronicamalattie degenerative tra cui l&#39;Alzheimer, la corea di Huntington e Sclerosi Multipla 4, 14, 3, 11, 7. In questo protocollo viene descritto l&#39;uso del NucView 488 caspasi-3 substrato per misurare la velocità della caspasi-3 apoptosi mediata in immortalato N19-oligodendrociti (OLG) colture cellulari 15, 5, a seguito di esposizione a diverse sollecitazioni extracellulare, come alte concentrazioni di potassio o glutammato. Il condizionale-immortalata N19-Corte di Appello di linea cellulare (che rappresenta il capostipite O2A) è stato ottenuto dal Dott. Antonio Campagnoni (UCLA Semel Institute for Neuroscience) 15, 5, ed è stato precedentemente utilizzato per studiare i meccanismi molecolari di espressione genica mielina e trasduzione del segnale che porta OLG di differenziazione (ad esempio 6, 10). Abbiamo trovato questa linea cellulare per essere robusto rispetto alla trasfezione con esogeni proteina basica della mielina (MBP) costruisce fusi a uno RFP o GFP (rosso o proteina verde fluorescente) 13,12. Qui, il colture cellulari N19-Corte di Appello sono stati trattati con 80 mM di cloruro di potassio o 100 mM glutammato di sodio per imitare perdita assonale nella matrice extracellulare di indurre apoptosi 9. Abbiamo usato un bi-funzionale della caspasi-3 contenente un substrato (Asp-Glu-Val-Asp) DEVD caspasi-3 subunità riconoscimento e un DNA-binding dye 2. Il substrato entra rapidamente nel citoplasma dove viene scissa dalla intracellulare caspasi-3. Il colorante, NucView 488 è rilasciato e entra nel nucleo della cellula dove si lega il DNA e fluorescente verde a 488 nm, segnalando l&#39;apoptosi. L&#39;utilizzo del NucView 488 caspasi-3 substrato permette di vivere a cellule di imaging in tempo reale 1, 10. In questo video, ci descrivono anche la coltura e trasfezione delle cellule immortalato N19-Corte di Appello, così come dal vivo di cellule tecniche di imaging.

Live-cell imaging di caspasi-3 apoptosi mediata in immortalato N19-oligodendrociti colture cellulari usando il<em&gt; NucView</em&gt; 488 caspasi-3 substrato. Questa tecnica è applicabile per le analisi programmate morte cellulare in tempo reale in una varietà di tipi di cellule e tessuti.

Monitoraggio spaccati Caspase-3 Attività e apoptosi di cellule oligodendrogliali Immortalata dal vivo utilizzando cellule Imaging e Cleaveable fluorogenici-dye seguenti supporti di potassio indotta depolarizzazione della membrana

Il sistema nervoso centrale può essere soggetto a diversi tipi di stress e insulti neurologici, che possono causare numerosi effetti avversi che portano infine a un...

Questa procedura permette di monitorare in tempo reale la morte cellulare gliale indotta da oligo DDR. Ciò viene ottenuto coltivando prima le cellule, quindi preparandole per l'immagine in tempo reale. Il passaggio successivo consiste nell'applicare un trattamento alle cellule e monitorarne gli effetti mediante microscopia a fluorescenza.L'ultimo passaggio consiste nell'eseguire l'analisi dei dati. In definitiva, i risultati mostrano i tassi di morte cellulare in una popolazione cellulare dopo un trattamento o uno stimolo, monitorando la fluorescenza nucleare derivante da un colorante fluorimetrico attivato dalle caspasi. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come la colorazione immunoistochimica, è la capacità di raccogliere contemporaneamente più punti temporali.Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nella biologia cellulare, come le risposte a trattamenti farmacologici, con reagenti e di varia natura. Attualmente, questo metodo può fornire informazioni sulla morte cellulare all'interno di colture cellulari. Può inoltre essere applicato ad altri sistemi, come tessuti organotipici ex vivo, inclusi fetti di tessuto cerebrale.Generalmente, le persone nuove rispetto a questo metodo incontreranno difficoltà mentre si adattano a lavorare con tessuti vivi piuttosto che con tessuti fissati. Una dimostrazione visiva di questa tecnica è importante poiché ci sono molti passaggi da eseguire per preparare campioni di cellule vive rispetto ai tessuti fissati. Scongelare innanzitutto le cellule gliali oligodendrocitarie immortalizzate N 19 in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius mentre le cellule si stanno scongelando.Aggiungere sette millilitri di DMEM ad alto contenuto di glucosio integrato con il 10% di FBS e l'1% di penicillina-streptomicina in una piastra da coltura da 10 centimetri. Quindi aggiungere la sospensione cellulare goccia a goccia sulla piastra e agitare delicatamente la capsula di Petri per distribuire uniformemente le cellule. Coltivare le cellule a 34 gradi Celsius in un incubatore con il 5% di anidride carbonica per quattro ore dopo quattro ore.Aspirare il mezzo dalle piastre per rimuovere qualsiasi residuo di DMSO.Crioprotettante. Sostituire con sette millilitri di mezzo fresco dopo quattro a sette giorni di crescita. Quando le cellule hanno raggiunto una confluenza del 70-80%, aspirare il mezzo e pipettare un millilitro di trypsinina sulla pellicola cellulare, incubando a temperatura ambiente per cinque minuti.Quindi raccogliere le cellule e seminare in una piastra per coltura tissutale da 10 centimetri con le cellule raccolte a una densità di 0,1 volte 10 alla sesta cellule per millilitro, e posizionare questa piastra nell'incubatore per colture cellulari. Dopo un ulteriore passaggio, le cellule possono essere seminate per esperimenti di imaging su cellule vive. A tal fine, raccogliere le cellule come in precedenza, quindi prelevare 30 microlitri della sospensione cellulare e contare le cellule utilizzando un emocitometro.Successivamente, utilizzare pinzette sterili per posizionare copriletto in vetro non rivestiti. In ciascun pozzetto di una piastra a sei pozzetti, aggiungere le cellule a una densità di 0,1 × 10⁶ cellule per millilitro. In due millilitri di terreno DMEM ad alto contenuto di glucosio, privo di fenolo, integrato con 10% di FBS e 1% di penicillina-streptomicina, lasciare crescere le cellule durante la notte a 34 °C e 5% di anidride carbonica prima della trasfezione.Il giorno successivo, combinare 100 microlitri di mezzo privo di siero con da 0,5 a quattro microgrammi di plasmide purificato, DNA e quattro microlitri di FU gene hd. Vortexare delicatamente la miscela due volte, quindi lasciare che il DNA formi complessi a temperatura ambiente per cinque minuti. Trascorso il tempo di incubazione, aggiungere direttamente la miscela di DNA FU gene HD alle cellule in coltura.Inclinare delicatamente la piastra per mescolare. Quindi coltivare le cellule per ulteriori 48 ore a 34 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica prima del trattamento o dell'esperimento. Accendere innanzitutto il blocco di controllo dello strumento per cellule vive LCI Cham light.Questa operazione deve essere eseguita tre ore prima dell'inizio dell'esperimento per garantire un riscaldamento completo della piastra. Al minimo, la scatola di controllo deve essere accesa un'ora prima dell'inizio dell'esperimento. Successivamente, lavorando in una cappa a flusso laminare, spruzzare la camera di coltura magnetica di tipo LCI Cham light e le pinzette con etanolo al 70% e lasciarle asciugare per cinque minuti.Rimuovere le cellule dall'incubatore ed esaminarle al microscopio per confermare che siano sane. Le cellule dovrebbero apparire duranti e ben espanse sul vetrino di copertura, con numerosi prolungamenti della membrana. Le cellule con un numero ridotto di prolungamenti o con un nucleo di forma irregolare sono probabilmente stressate a causa della trasfezione e non sono adatte per ulteriori esperimenti da eseguire nella cappa a flusso laminare.Inclinare la piastra a sei pozzetti ed estrarre il cover slip con le pinzette. Posizionare rapidamente il cover slip con il lato delle cellule rivolto verso l'alto nel fondo della camera. Non permettere al cover slip di asciugarsi.Successivamente, fissare il corpo principale magnetico della camera di coltura e aggiungere 500 microlitri di mezzo proveniente dalla piastra a sei pozzetti originale sulla superficie del vetrino. Il riutilizzo del mezzo riduce lo stress imposto alle cellule a causa dei cambiamenti ambientali e può inoltre essere utile per valutare i fattori secreti extracellulari. Dopo aver aggiunto il mezzo, posizionare il coperchio in vetro sulla camera di coltura e utilizzare una striscia di salviette Kim inumidite al 70% per rimuovere eventuali residui che potrebbero interferire con la microscopia dalla parte inferiore del vetrino.Posizionare la camera di coltura nell'incubatrice a 34 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica per 30 minuti. Questo passaggio garantirà che la camera stessa si riscaldi a 34 gradi, riducendo lo spostamento del coprivetrino. Mentre il metallo si riscalda, è necessario eseguire i passaggi successivi con l'illuminazione ambiente della stanza ridotta al minimo.Per prima cosa, Thora in precedenza ha preparato l'acqua elettricamente pura della vista nucleare a temperatura ambiente. Successivamente, prelevare la camera di coltura dall'incubatrice e posizionarla rapidamente nella camera ambientale del microscopio. Accendere la bombola di anidride carbonica al 5% pre-miscelata con doppio regolatore.Successivamente, utilizzare l'obiettivo 10x con la lampada del microscopio impostata a circa 2,5 volt e il tempo di esposizione a 240 millisecondi. Mettere a fuoco mediante microscopia in campo chiaro per visualizzare le cellule sul monitor del computer. Quindi aggiungere alle cellule una concentrazione di 80 millimolare di ioni potassio o di un altro inductor di apoptosi, sostituendo il mezzo mediante perfusione lenta e localizzata tramite una pompa peristaltica.Il substrato nuke view 4 88 è stabile nella coltura cellulare per esperimenti della durata massima di 36 ore. Pertanto, è possibile eseguire esperimenti per questo intervallo di tempo. Prima di tutto, configurare il microscopio per visualizzare la fluorescenza delle proteine fluorescenti rossa e verde.Quindi fare clic sul canale rosso per visualizzare le cellule trasfettate. Selezionare e salvare circa 12 fotogrammi in cui sono presenti diverse cellule trasfettate e salvare questi punti della fase XY. Impostare il microscopio affinché acquisisca immagini nel canale rosso in campo chiaro e nel canale verde in corrispondenza di questi punti della fase salvati ogni sei minuti.Dopo aver raccolto più punti XY da esperimenti duplicati o triplicati, compilare i dati provenienti da esperimenti separati effettuati in giorni diversi ed eseguire l'analisi dei dati e i test statistici come descritto nel protocollo scritto, al fine di confrontare il rapporto tra cellule negative per CASP bay e cellule positive per CASP bay. Il substrato Nuke view 4 88 può indicare un aumento del tasso di apoptosi nelle colture cellulari gliali oligo DDR N 19. Successivamente a un trattamento con una concentrazione elevata di potassio extracellulare, queste immagini di base sono state acquisite utilizzando un obiettivo 10 volte.Le cellule N 19 sono state trasfettate con RFP e sono state trattate con tre microlitri di nuke view, substrato 4 88 per le cellule di controllo, oppure con tre microlitri di nuke view, substrato 4 88 e 80 millimolare di potassio. Queste immagini mostrano che il numero di cellule apoptotiche aumenta nel tempo, a tre, sei e nove ore dopo il trattamento con 80 millimolare di potassio; in condizioni di controllo, non sono stati osservati quantitativi significativi di apoptosi rispetto alle colture trattate con 80 millimolare di potassio. Il segnale verde di fondo osservato nelle condizioni di controllo indica le cellule che stanno subendo apoptosi senza l'aggiunta di potassio extracellulare.Un corso temporale di 12 ore è adeguato per studi che coinvolgono lesioni neurologiche. Dopo 12 ore, le colture trattate con potassio hanno mostrato circa il 45% di morte cellulare. Praticamente nessuna delle cellule nell'esperimento di controllo mostra apoptosi al tempo di 12 ore. Tuttavia, in altre situazioni, potrebbe essere necessario proseguire gli esperimenti per un periodo più lungo.Questo grafico mostra l'aumento delle cellule positive per la caspasi 3 nel corso dell'esperimento della durata di 12 ore. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in un'ora e i dati possono essere raccolti durante la notte se eseguita correttamente. Durante l'esecuzione di questa procedura, è importante ricordare di mantenere la coerenza tra i diversi trattamenti seguendo questa procedura.Altri metodi, come la colorazione immunoistochimica, possono essere utilizzati per osservare altre proteine a valle coinvolte nei percorsi studiati. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come preparare campioni per l'analisi mediante imaging, acquisire un set di dati e analizzare i tuoi risultati.

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Saggio della caspasi-3/7: un test basato sulla luminescenza per quantificare l'apoptosi misurando le attività della caspasi-3/7 negli espianti di pelle di rana

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Monitoraggio spaccati Caspase-3 Attività e apoptosi di cellule oligodendrogliali Immortalata dal vivo utilizzando cellule Imaging e Cleaveable fluorogenici-dye seguenti supporti di potassio indotta depolarizzazione della membrana (Video) | JoVE Journal

Monitoraggio spaccati Caspase-3 Attività e apoptosi di cellule oligodendrogliali Immortalata dal vivo utilizzando cellule Imaging e Cleaveable fluorogenici-dye seguenti supporti di potassio indotta depolarizzazione della membrana

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