Isolando LacZ cellule che esprimono da tessuti dell'orecchio interno del mouse in citometria a flusso

L'obiettivo generale del seguente esperimento è isolare le cellule Z positive lassiste dalla coclea neonatale di topo utilizzando la citometria a flusso. Ciò si ottiene isolando prima un gran numero di coclea di topo in un lasso di tempo relativamente breve per mantenere le cellule vitali e avere un adeguato tessuto di partenza. In una seconda fase, le cellule LAX Z positive vengono dissociate e quindi marcate per preparare il tessuto per lo smistamento.

Le cellule vengono quindi ordinate mediante citometria a flusso. Le popolazioni LAX Z alte e basse risultanti possono quindi essere utilizzate per ulteriori sperimentazioni. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della ricerca sull'orecchio, come ad esempio quali sono i profili genetici o le popolazioni cellulari specifiche all'interno dell'orecchio interno.

A dimostrare la procedura sarà Taha Gen A studente di medicina del nostro laboratorio. Per prima cosa, riempi le piastre di Petri da 35 millimetri con HBSS e posizionale su un blocco di ghiaccio. Poi, dopo aver usato le forbici dell'iride per decapitare da 12 a 15 persone, soppresso postnatale, assone da zero a tre giorni, due reporter lassisti e topi di tipo selvatico.

Posizionare le teste su una capsula di Petri da 60 millimetri su un blocco di ghiaccio. Quindi, usa la pinza Dumont numero cinque e le forbici dell'iride per asportare la mandibola e la lingua dalle teste, quindi taglia la base del cranio a livello della tavolozza. Ora rimuovete la pelle sovrastante del polpaccio e sezionate la base del cranio inserendo le forbici nella parte inferiore del forame magno al centro del palato.

Praticare un'altra incisione con le forbici dal bordo tagliato del palato all'aspetto superiore del polpaccio su entrambi i lati. Facendo attenzione a non danneggiare la capsula otica. Quindi completare l'isolamento dell'osso temporale praticando 2 incisioni angolate di 45 gradi, partendo dall'aspetto superiore del telaio e magnum estendendosi fino al taglio coronale al palato duro.

Quindi posizionare le ossa temporali isolate nelle piastre di Petri da 35 millimetri contenenti HBSS sul blocco di ghiaccio e trasferire il blocco di ghiaccio in una cappa di dissezione sterile. Quindi, riempi un'altra capsula di Petri da 35 millimetri, questa volta con PBS, e posizionala sul blocco di ghiaccio. Usando due pinze numero 55.

Iniziare la microdissezione rimuovendo delicatamente la corteccia, il tronco encefalico e il cervelletto dall'osso temporale sovrastante la capsula otica. Quindi, senza rimuovere la capsula otica, asportare parti della capsula cocleare iniziando dall'ingresso del nervo cocleare vestibolare e continuando nella capsula otica. A seguito dell'esposizione della base della coclea, estrarre delicatamente l'organo del corti e i tessuti circostanti.

Quindi, partendo dalla base, rimuovere il ganglio spirale e la stria rimanenti e trasferire la coclea nella piastra di Petri riempita con la prima pipetta PBS. 50 microlitri di PBS sterile al centro di uno o due pozzetti di una piastra di coltura a sei pozzetti non rivestita. Quindi trasferire non più di 20 assine, due coclee lassiche in ciascuna gocciolina di PBS.

Successivamente, preriscaldare 50 microlitri di aliquote allo 0,125% di tripsina per circa due minuti in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius. E poi aggiungere la tripsina alla coclea. Facendo attenzione a non scuotere il piatto.

Incubare la coclea a 37 gradi Celsius per otto minuti. Terminare la tripsinizzazione aggiungendo 50 microlitri di inibitore della tripsina di soia a ciascuna gocciolina, quindi aggiungere altri 50 microlitri di terreno completo dopo aver impostato una pipetta P 200 man a 125 microlitri. Utilizzare una punta di pipetta smussata da 300 microlitri per tatuare delicatamente le cellule 80 volte, facendo attenzione a non creare bolle.

Quindi, dopo che ogni goccia è stata triturata, aggiungere altri 200 microlitri di terreno pieno a ciascuna. Bene, ora passa le cellule attraverso un colino da 40 micron in un nuovo pozzetto. All'interno della stessa piastra a sei pozzetti e quindi trasferire le cellule da ciascun pozzetto a singoli tubi fax standard.

Quindi, aggiungere 100 microlitri di cellule wild type in ciascuna delle tre provette, quindi diluire con 300 microlitri di terreno pieno solo per il CUG. Controllo diluire 10 microlitri di assone, due cellule LAX Z in 390 microlitri di terreno pieno. Trasferire le restanti due cellule Z lassiste dell'assone in provette fax in OT da 400 microlitri.

Quindi, dopo aver incubato le provette in un'incubatrice umidificata a 37 gradi Celsius per 10 minuti, aggiungere 200 microlitri di CUG diluito a ciascuna provetta fax appropriata. Quindi, proteggendo tutte le provette dalla luce, incubare le cellule in un incubatore umidificato a 37 gradi Celsius per 25 minuti. Per la colorazione durante l'incubazione delle cellule, mettere 10 millilitri di cumuli appena preparati più FBS in una provetta da 15 millilitri e mettere la provetta sul ghiaccio.

Quindi aggiungere 1,8 millilitri di soluzione ghiacciata a ciascuno dei tubi fax sotto il cofano sterile con le luci spente per ridurre al minimo l'esposizione alla luce. Quindi, centrifugare le celle a 1200 giri/min per cinque minuti a temperatura ambiente. Quindi rimuovere il surnatante e risospendere i pellet in 300 microlitri di terreno pieno.

Raggruppare tutte le aliquote per il campione di selezione, quindi aggiungere ioduro di propidio a ciascuna provetta appropriata fino a una concentrazione finale di un microgrammo per millilitro. Infine, dopo aver coperto le celle, ancora una volta, adagiatele sul ghiaccio. Imposta i cancelli di smistamento raccogliendo prima 1000 eventi delle celle di tipo selvatico non colorate per determinare la distribuzione delle celle sul grafico di dispersione anteriore rispetto a quello laterale.

Regolare i parametri di dispersione in avanti e lateralmente secondo necessità. Quindi compensare con il tipo selvatico non colorato, il tipo selvatico colorato con PI e l'assone colorato con CUG. Due celle Z LAX.

Riempi due tubi fax con 500 microlitri di supporto pieno. Quindi iniziare l'analisi con il gate di celle colorate PI wild type e l'assone due Lae CUG per escludere i detriti in base al grafico di dispersione in avanti rispetto a quello laterale. Escludere doppietti e gruppi utilizzando il grafico dell'altezza di dispersione in avanti rispetto all'area di dispersione in avanti.

Quindi escludere le cellule morte positive PI in base all'area di dispersione diretta rispetto al grafico PE sci a cinque aree. Per ogni posizionamento dell'andatura, impostare un grafico dell'area di dispersione in avanti rispetto alla cascata o all'area blu del Pacifico. Analizza 10.000 eventi dalla provetta del campione di smistamento contenente l'assone, due cellule colorate con PI laxy e CUG utilizzando tutti i gate impostati con le cellule wild type utilizzando i grafici delle cellule wild type.

Crea gate per celle alte blu a cascata inferiori all'1% del numero totale di eventi. La cascata Blue High Gates dovrebbe ora contenere circa il 15-20% delle cellule nel campione di laxy dell'assone due. Rendendo questi assoni due cellule alte utilizzando il grafico di analisi delle cellule lassiche Axon two ora crea un cancello per l'influenza minima, dal 15 al 20% delle cellule utilizzando la suddetta strategia di gating.

Smistare le celle nei tubi fax contenenti i supporti pieni, mantenendo i tubi di raccolta in una camera raffreddata a quattro gradi Celsius durante lo smistamento. Registrare il numero di cellule contate dal citometro a flusso per ciascuna popolazione in queste due cifre. Le aree di dispersione laterali rispetto alle aree di dispersione in avanti del tipo selvatico dissociato a sinistra e dell'assone due LA Z a destra.

Sono mostrate le cellule cocleari. Si noti il gating dei gruppi distinti di eventi di dimensioni molto più grandi rispetto a quegli eventi più vicini all'asse Y designati come popolazione negativa dei detriti. In genere, in questi due pannelli vengono recuperate dal 40 al 45% di cellule prive di detriti sia dalla coclea Z LAX wild type che dall'axin two.

L'altezza di dispersione diretta rispetto all'area di dispersione diretta viene utilizzata per escludere i doppietti dai detriti precedentemente controllati. Sono esclusi gli eventi negativi della popolazione che si discostano dalla natura lineare prevista del grafico. Questa preparazione produce in genere il 71,1% di eventi all'interno del gate designato. Qui.

Lo ioduro di propidio, come rilevato dal PE SCI a cinque canali, viene utilizzato per escludere le cellule morte, come osservato in questi grafici a dispersione. Circa il 95% delle cellule selezionate era vitale e non assorbiva PI PI in questi pannelli. Il canale blu Cascade è stato utilizzato per rilevare il substrato fluorescente CUG come si vede nella figura a destra.

In media, le cellule positive per circa il 20% di CUG sono cellule ad alto lae che sono correlate a circa 15.000 assoni, due cellule ad alto alto numero di cellule per 10-12 animali. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come preparare e isolare le cellule lassiche alte utilizzando la citometria a flusso dai tessuti dell'orecchio interno sia per esperimenti di Turing cellulare che per esperimenti come la profilazione genica.