Isolando LacZ cellule che esprimono da tessuti dell'orecchio interno del mouse in citometria a flusso

L'obiettivo generale del seguente esperimento è isolare cellule positive per LAX Z dalla coclea di topo neonato utilizzando la citometria a flusso. Questo risultato si ottiene innanzitutto isolando un elevato numero di coclee di topo in un breve lasso di tempo, al fine di mantenere le cellule vitali e disporre di un quantitativo adeguato di tessuto iniziale. Come secondo passaggio, le cellule positive per LAX Z vengono dissociate e quindi marcate per preparare il tessuto al processo di selezione.

Le cellule vengono quindi separate mediante citometria a flusso. Le popolazioni risultanti con elevata espressione di LAX Z e bassa espressione di lax possono quindi essere utilizzate per ulteriori esperimenti. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della ricerca sull'orecchio, ad esempio quali sono i profili genici o le specifiche popolazioni cellulari presenti nell'orecchio interno.

La procedura sarà dimostrata da Taha Gen, uno studente di medicina del nostro laboratorio. Per prima cosa, riempire piatti di Petri da 35 millimetri con HBSS e posizionarli su un blocco di ghiaccio. Successivamente, dopo aver utilizzato forbici da iridectomia per decapitare da 12 a 15 topi eutanasizzati postnatali, di età compresa tra zero e tre giorni, di ceppo axon, due linee reporter e topi wild type.

Posizionare le teste su una piastra di Petri da 60 millimetri su un blocco di ghiaccio. Successivamente, utilizzare pinze Dumont numero cinque e forbici per iridectomia per asportare la mandibola e la lingua dalle teste, quindi tagliare attraverso la base del cranio al livello del palato. Ora rimuovere la cute sovrastante il cranio e sezionare la base del cranio inserendo le forbici nella parte inferiore del forame magno fino al centro del palato.

Eseguire un'altra incisione con le forbici dal margine tagliato del palato fino all'aspetto superiore del calvario su entrambi i lati, avendo cura di non danneggiare la capsula otica. Quindi completare l'isolamento dell'osso temporale eseguendo due incisioni angolate di 45 gradi, partendo dall'aspetto superiore del forame magno fino al taglio coronale al livello del palato duro.

Quindi posizionare le ossa temporali isolate nelle piastre di Petri da 35 millimetri contenenti HBSS sul blocco di ghiaccio e trasferire il blocco di ghiaccio in una cappa di dissezione sterile. Successivamente, riempire un'altra piastra di Petri da 35 millimetri, questa volta con PBS, e posizionarla sul blocco di ghiaccio. Utilizzando due pinzette numero 55.

Iniziare la microdissezione rimuovendo delicatamente la corteccia, il tronco encefalico e il cervelletto dall'osso temporale sovrastante la capsula otica. Successivamente, senza rimuovere la capsula otica, asportare parti della capsula cocleare a partire dall'ingresso del nervo vestibolococleare e proseguendo all'interno della capsula otica. Dopo aver esposto la base della coclea, estrarre delicatamente l'organo del Corti e i tessuti circostanti.

Quindi, a partire dalla base, rimuovere qualsiasi ganglio spirale e stria vascolare residui e trasferire la coclea nella piastra di Petri riempita con PBS. Pipettare per prima cosa 50 microlitri di PBS sterile al centro di uno o due pozzetti di una piastra per colture da sei pozzetti non rivestita. Successivamente, trasferire non più di 20 coclee assiali, due lassative, in ciascuna goccia di PBS.

Successivamente, preriscaldare aliquote di 50 microlitri di tripsina allo 0,125% per circa due minuti in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius. Quindi aggiungere la tripsina al coclea, avendo cura di non agitare la piastra.

Incubare la coclea a 37 gradi Celsius per otto minuti. Arrestare la tripsinizzazione aggiungendo 50 microlitri di inibitore della tripsina da soia a ciascuna goccia, quindi aggiungere ulteriori 50 microlitri di mezzo completo dopo aver impostato una pipetta P200 a 125 microlitri. Utilizzare una punta da pipetta smussata da 300 microlitri per pipettare delicatamente le cellule 80 volte, avendo cura di non creare bolle.

Successivamente, dopo che ogni goccia è stata triturata, aggiungere ulteriori 200 microlitri di mezzo completo a ciascuna. Ora passare le cellule attraverso un filtro cellulare da 40 micron in una nuova pozzetta della stessa piastra a sei pozzette, quindi trasferire le cellule da ciascuna pozzetta in provette fax standard individuali.

Successivamente, aggiungere 100 microlitri di cellule di tipo selvaggio in ciascuna delle tre provette, seguiti da una diluizione con 300 microlitri di terreno completo solo per il CUG. Come controllo, diluire 10 microlitri di assoni, due cellule LAX Z, in 390 microlitri di terreno completo. Trasferire le restanti cellule assone due LAX Z in provette da fax in 400 microlitri di OTs.

Successivamente, dopo aver incubato i tubi in un incubatore umidificato a 37 gradi Celsius per 10 minuti, aggiungere 200 microlitri di CUG diluito in ciascun tubo da provetta appropriato. Poi, proteggendo tutti i tubi dalla luce, incubare le cellule in un incubatore umidificato a 37 gradi Celsius per 25 minuti. Per la colorazione, mentre le cellule sono in incubazione, versare 10 millilitri di heaps appena preparato più FBS in un tubo da 15 millilitri e porre il tubo sul ghiaccio.

Quindi aggiungere 1,8 millilitri di soluzione heap ghiacciata in ciascuna delle provette fax all'interno della cappa sterile con le luci spente per minimizzare l'esposizione alla luce. Successivamente, centrifugare le cellule a 1200 giri/min per cinque minuti a temperatura ambiente. Poi rimuovere il soprannatante e risospendere i pellet in 300 microlitri di mezzo completo.

Riunire tutti gli aliquote per il campione da ordinare, quindi aggiungere l'ioduro di propidio in ogni provetta appropriata fino a una concentrazione finale di un microgrammo per millilitro. Infine, dopo aver coperto le cellule, riporle nuovamente sul ghiaccio. Impostare le finestre di selezione raccogliendo innanzitutto 1000 eventi delle cellule selvagge non colorate per determinare la distribuzione cellulare nel grafico di dispersione anterograde rispetto a quello laterale.

Regolare i parametri di diffusione anteriore e laterale secondo necessità. Quindi effettuare la compensazione con il tipo selvatico non colorato, il tipo selvatico colorato con ioduro di propidio e l'assone colorato con CUG. Due cellule LAX Z.

Riempire due provette FACS con 500 microlitri di mezzo completo. Quindi avviare l'analisi con le cellule di tipo selvaggio colorate con PI e le cellule axon due Lae CUG colorate, impostando un gate per escludere i detriti in base al grafico di diffusione anterograde rispetto a quello laterale. Escludere doppietti e aggregati utilizzando il grafico di altezza della diffusione anterograde rispetto all'area della diffusione anterograde.

Quindi escludere le cellule morte positive al PI in base al grafico dell'area dello scatter anteriore rispetto all'area PE sci five. Per ogni posizionamento del gate, impostare un grafico dell'area dello scatter anteriore rispetto all'area cascade o Pacific blue. Analizzare 10.000 eventi dal tubo del campione da ordinare contenente cellule colorate con axon two laxy PI e CUG utilizzando tutti i gate impostati con le cellule di tipo selvaggio mediante grafici ottenuti dalle cellule di tipo selvaggio.

Crea dei gate per le cellule ad alto livello di cascade blue che rappresentano meno dell'1% del numero totale di eventi. I gate per le cellule ad alto livello di cascade blue dovrebbero ora contenere circa dal 15 al 20% delle cellule nel campione Axon two laxy. Utilizzando queste cellule Axon two ad alto livello, sulla base del grafico di analisi delle cellule Axon two laxy, crea ora un gate per le cellule con fluorescenza minore, pari al 15-20% delle cellule, utilizzando la strategia di gating sopra descritta.

Separare le cellule nei tubi FACS contenenti il terreno completo, mantenendo i tubi di raccolta in una camera raffreddata a quattro gradi Celsius durante il sorting. Registrare il numero di cellule contate dal citometro a flusso per ciascuna popolazione in queste due figure. Le aree di scattering laterale rispetto alle aree di scattering anteriore del tipo selvatico dissociato a sinistra e dell’axon due LA Z a destra.

Vengono mostrate cellule cocleari. Si noti il gating dei gruppi distinti di eventi di dimensioni molto maggiori rispetto a quegli eventi più vicini all'asse Y, indicati come popolazione negativa per i detriti. Tipicamente, dal 40 al 45% di cellule libere da detriti viene recuperato sia dalla coclea di tipo selvaggio che da quella axin two LAX Z in questi due pannelli.

L'altezza dello scatter anteriore rispetto all'area dello scatter anteriore viene utilizzata per escludere i doppietti dai detriti precedentemente selezionati. Vengono esclusi gli eventi della popolazione negativa che si discostano dalla natura lineare prevista del grafico. Questa preparazione fornisce tipicamente il 71,1% di eventi all'interno della finestra definita. Qui.

L'ioduro di propidio, rilevato tramite il canale PE SCI a cinque canali, viene utilizzato per escludere le cellule morte, come osservato in questi grafici a dispersione. Circa il 95% delle cellule ordinate risultava vitale e non ha assorbito PI nei presenti pannelli. Il canale Cascade blue è stato utilizzato per rilevare il substrato fluorescente CUG, come mostrato nella figura a destra.

In media, le cellule positive al CUG più elevate, circa il 20%, sono le cellule lae high, che corrispondono a circa 15.000 assoni, due cellule alte ogni 10-12 animali. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come preparare e isolare le cellule laxy high mediante citometria a flusso a partire da tessuti dell'orecchio interno, sia per esperimenti di cell Turing che per esperimenti come il profilo genico.