Name: Quantitative e automatica High-throughput Genome-wide Schermi RNAi in C. elegans /em (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-02-27T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 58 s
Description: Scopri come eseguire schermi RNAi ad alto rendimento in C. elegans per analizzare la funzione genica e l'immunità innata antifungina. Questo metodo automatizzato misura parametri fenotipici quantitativi.

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Ringraziamo D. Braendle, CL Kurz e F. Montañana-Sanchis per i loro contributi. Questo progetto è stato sostenuto anche da finanziamenti della ANR e il Conseil Régional PACA e finanziamenti istituzionali da INSERM e il CNRS.

<ol><li>Timmons, L., Fire, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+interference+by+ingested+dsRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Specific interference by ingested dsRNA.</a> Nature. 395, 854-854 (1998).</li>
<li>Kamath, R. S., Ahringer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+RNAi+screening+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Genome-wide RNAi screening in Caenorhabditis elegans.</a> Methods. 30, 313-321 (2003).</li>
<li>Rual, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+improving+Caenorhabditis+elegans+phenome+mapping+with+an+ORFeome-based+RNAi+library%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Toward improving Caenorhabditis elegans phenome mapping with an ORFeome-based RNAi library.</a> Genome Res. 14, 2162-2168 (2004).</li>
<li>Lee, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+systematic+RNAi+screen+identifies+a+critical+role+for+mitochondria+in+C.+elegans+longevity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">A systematic RNAi screen identifies a critical role for mitochondria in C. elegans longevity.</a> Nat. Genet. 33, 40-48 (2003).</li>
<li>Hamilton, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+systematic+RNAi+screen+for+longevity+genes+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">A systematic RNAi screen for longevity genes in C. elegans.</a> Genes Dev. 19, 1544-1555 (2005).</li>
<li>Frand, A. R., Russel, S., Ruvkun, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+genomic+analysis+of+C.+elegans+molting%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Functional genomic analysis of C. elegans molting.</a> PLoS Biol. 3, e312-e312 (2005).</li>
<li>Parry, D. H., Xu, J., Ruvkun, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+whole-genome+RNAi+Screen+for+C.+elegans+miRNA+pathway+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">A whole-genome RNAi Screen for C. elegans miRNA pathway genes.</a> Curr. Biol. 17, 2013-2022 (2007).</li>
<li>O'Rourke, E. J., Conery, A. L., Moy, T. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-animal+high-throughput+screens%3A+the+C+elegans+model%5BTitle%5D)+AND+%22+Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Whole-animal high-throughput screens: the C elegans model.</a> Methods Mol. Biol. 486, 57-75 (2009).</li>
<li>Pujol, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+innate+immune+responses+to+infection+and+wounding+in+the+C.+elegans+epidermis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Distinct innate immune responses to infection and wounding in the C. elegans epidermis.</a> Curr. Biol. 18, 481-489 (2008).</li>
<li>Stiernagle, T. The C. elegans Research Community. Maintenance of C. elegans. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aStiernagle%2C+T+%22WormBook%22">WormBook</a>. , 1551-8507 (2006).</li>
<li>Powell, J. R., Ausubel, F. M. Models of Caenorhabditis elegans Infection by Bacterial and Fungal Pathogens. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPowell%2C+JR+%22Methods+Mol+Biol%22">Methods Mol Biol</a>. Ewbank, J., Vivier, E. 415, Humana Press. 403-427 (2008).</li>
<li>Cardoso, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((XNP-1%2FATR-X+acts+with+RB%2C+HP1+and+the+NuRD+complex+during+larval+development+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">XNP-1/ATR-X acts with RB, HP1 and the NuRD complex during larval development in C. elegans.</a> Dev. Biol. 278, 49-59 (2005).</li>
<li>Pujol, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-fungal+innate+immunity+in+C.+elegans+is+enhanced+by+evolutionary+diversification+of+antimicrobial+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Anti-fungal innate immunity in C. elegans is enhanced by evolutionary diversification of antimicrobial peptides.</a> PLoS Pathog. 4, e1000105-e1000105 (2008).</li>
<li>Simmer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-Wide+RNAi+of+C.+elegans+Using+the+Hypersensitive+rrf-3+Strain+Reveals+Novel+Gene+Functions%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Genome-Wide RNAi of C. elegans Using the Hypersensitive rrf-3 Strain Reveals Novel Gene Functions.</a> PLoS Biol. 1, e12-e12 (2003).</li>
<li>Couillault, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TLR-independent+control+of+innate+immunity+in+Caenorhabditis+elegans+by+the+TIR+domain+adaptor+protein+TIR-1%2C+an+ortholog+of+human+SARM%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">TLR-independent control of innate immunity in Caenorhabditis elegans by the TIR domain adaptor protein TIR-1, an ortholog of human SARM.</a> Nat Immunol. 5, 488-494 (2004).</li>
<li>Morton, E., Lamitina, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+suite+of+MATLAB-based+computational+tools+for+automated+analysis+of+COPAS+Biosort+data%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">A suite of MATLAB-based computational tools for automated analysis of COPAS Biosort data.</a> Biotechniques. 48, xxv-xxx (2010).</li>
<li>Rohlfing, A. K., Miteva, Y., Hannenhalli, S., Lamitina, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+and+physiological+activation+of+osmosensitive+gene+expression+mimics+transcriptional+signatures+of+pathogen+infection+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Genetic and physiological activation of osmosensitive gene expression mimics transcriptional signatures of pathogen infection in C. elegans.</a> PLoS One. 5, e9010-e9010 (2010).</li>
<li>Lee, K. Z., Kniazeva, M., Han, M., Pujol, N., Ewbank, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fatty+acid+synthase+fasn-1+acts+upstream+of+WNK+and+Ste20%2FGCK-VI+kinases+to+modulate+antimicrobial+peptide+expression+in+C.+elegans+epidermis%5BTitle%5D)+AND+%22Virulence%22%5BJournal%5D)">The fatty acid synthase fasn-1 acts upstream of WNK and Ste20/GCK-VI kinases to modulate antimicrobial peptide expression in C. elegans epidermis.</a> Virulence. 1, 113-122 (2010).</li>
<li>Duverger, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+semi-automated+high-throughput+approach+to+the+generation+of+transposon+insertion+mutants+in+the+nematode+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">A semi-automated high-throughput approach to the generation of transposon insertion mutants in the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Nucleic Acids Res. 35, e11-e11 (2007).</li>
<li>Pierce-Shimomura, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+analysis+of+crawling+and+swimming+locomotory+patterns+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Genetic analysis of crawling and swimming locomotory patterns in C. elegans.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 20982-20987 (2008).</li>
<li>Ruzanov, P., Riddle, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+SAGE+analysis+of+the+Caenorhabditis+elegans+transcriptome%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Deep SAGE analysis of the Caenorhabditis elegans transcriptome.</a> Nucleic Acids Res. 38, 3252-3262 (2010).</li>
<li>Kurz, C. L., Ewbank, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infection+in+a+dish%3A+high-throughput+analyses+of+bacterial+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Infection in a dish: high-throughput analyses of bacterial pathogenesis.</a> Curr. Opin. Microbiol. 10, 10-16 (2007).</li>
<li>Okoli, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+antifungal+compounds+active+against+Candida+albicans+using+an+improved+high-throughput+Caenorhabditis+elegans+assay%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Identification of antifungal compounds active against Candida albicans using an improved high-throughput Caenorhabditis elegans assay.</a> PLoS One. 4, e7025-e7025 (2009).</li>
<li>Moy, T. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+novel+antimicrobials+using+a+live-animal+infection+model%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Identification of novel antimicrobials using a live-animal infection model.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 103, 10414-10419 (2006).</li>
<li>Ballestriero, F., Thomas, T., Burke, C., Egan, S., Kjelleberg, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+compounds+with+bioactivity+against+the+nematode+Caenorhabditis+elegans+by+a+screen+based+on+the+functional+genomics+of+the+marine+bacterium+Pseudoalteromonas+tunicata+D2%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Identification of compounds with bioactivity against the nematode Caenorhabditis elegans by a screen based on the functional genomics of the marine bacterium Pseudoalteromonas tunicata D2.</a> Appl. Environ. Microbiol. 76, 5710-5717 (2010).</li>
</ol>

Il laboratorio collabora con l&#39;Unione Ewbank Biometrica e Modul-Bio.

<p class="jove_content"&gt; L&#39;attuale protocollo consente su larga scala di screening RNAi in<em&gt; C. elegans</em&gt; Su supporti solidi, utilizzando il livello di espressione di un gene reporter fluorescente come lettura-out. È stato ottimizzato con strumenti automatizzati per facilitare high-throughput saggi, permettendo maneggevolezza e veloce di un gran numero di campioni, in modo efficiente, affidabile e riproducibile. Altri metodi sono stati descritti, che non si basano così pesantemente sulla gestione automatizzata del campione di liquido<sup&gt; 8</sup&gt;.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; Un aspetto fondamentale organizzativo al protocollo è stato lo sviluppo di un metodo affidabile di monitoraggio campione adattando il software commerciale MBioLIMS alla procedura schermo RNAi in collaborazione con la ModulBio azienda. In ogni fase della procedura, le piastre sono ora identificati da codici a barre generati all&#39;interno del LIMS. Come LIMS registra anche l&#39;identità dei cloni in ogni pozzetto su ciascuna piastra, andando da pozzetto a gene putativo è semplice. E di là di questo, i collegamenti LIMS per la WormBase banca dati comunitaria, consentendo l&#39;accesso diretto ai dati molecolari e funzionali in merito a qualsiasi dato gene. Il LIMS facilita anche le analisi da effettuare sul piatto o addirittura a livello dei cromosomi e intero genoma. Per queste analisi, i dati vengono memorizzati in un modo che è perfettamente compatibile con utensili precedentemente descritti come COPAmulti<sup&gt; 16</sup&gt;.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; Un punto critico nel metodo sperimentale è la regolazione della quantità di cibo in relazione al numero di vermi. Per molti saggi, è essenziale che i vermi non fame alla fine dell&#39;esperimento, ma è anche importante non avere troppo cibo all&#39;inizio. Abbiamo osservato che un&#39;alta densità di cibo riduce induzione fluorescenza nel protocollo utilizzando vermi trasportano il p<em&gt; Nlp-29</em&gt; :: Reporter GFP. Questo può riflettere una diminuita efficienza infezione quando i vermi vengono coltivate nei batteri troppo (BS, risultati non pubblicati). Allo stesso tempo, le condizioni di coltura del batterio RNAi è anche importante, poiché questo determina se dsRNA viene prodotta ad un livello ottimale. Alcuni protocolli per la grande RNAi richiedono cultura di cloni RNAi su piastre di agar prima di semina colture liquide<sup&gt; 8</sup&gt;. Abbiamo ottenuto il silenziamento genico robusta omissione di questo passaggio. Abbiamo optato per la coltivazione di un eccesso di ogni cultura per garantire risultati omogenei. Il protocollo descritto, infatti, fornisce materiale sufficiente per condurre 2 o 3 schermi in parallelo. Nell&#39;interesse di ottenere i risultati più robusti, siamo favorevoli, però, conducendo schermi in duplicato utilizzando culture indipendenti di vermi, batteri e spore fungine RNAi.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; Un altro passo fondamentale è legato all&#39;utilizzo di mezzo che non è né troppo umido né troppo secco. Se le piastre non sono asciutti a sufficienza, i batteri RNAi non asciugare bene e vermi nuotare durante il saggio. Ciò può causare problemi. Ad esempio, i worm non sono efficacemente infettati da<em&gt; D. coniospora</em&gt; In un liquido (C. Couillault, risultati non pubblicati). D&#39;altra parte, in lastre secche, l&#39;osmolarità del aumenti medi di coltura. Ciò ha effetti diretti sulla fisiologia a vite senza fine<sup&gt; 17</sup&gt;, Compresa l&#39;induzione di alcuni geni peptidi antimicrobici, come ad esempio<em&gt; Nlp 29</em&gt;<sup&gt; 18</sup&gt;. Il volume utilizzato per erogare i vermi e spore è fondamentale per l&#39;essiccazione efficaci e rapidi. Se più di 10 pl di liquido viene aggiunta alle piastre fresche, i pozzetti può richiedere molte ore per asciugare. Ciò può significare che è difficile da usare metodi robotici per aggiungere vermi alle piastre. Ad esempio, ogni vite senza fine viene erogato dalla Biosort in circa 1 ml di liquido. Al momento distribuire i vermi manualmente che ci permette anche di superare la tendenza di vermi in soluzione a sedimentare.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; Abbiamo già segnalato un adeguamento del Biosort che ha permesso uno piastra a 96 pozzetti da analizzare in 36 minuti<sup&gt; 19</sup&gt;. La macchina fabbricante UBI offre una modifica del Biosort per ridurre ulteriormente il tempo di analisi. Con il &quot;FastReFlex&quot;, i campioni vengono indirizzate direttamente attraverso la cella di flusso per l&#39;analisi, bypassando la bolla-trappola filtro. Ciò comporta una riduzione significativa del tempo di acquisizione dati; una piastra intero può essere analizzata in 22 min consentendo circa 20 piastre da trattare al giorno. Se i pannelli non sono state congelate, tuttavia, ci sarebbe un intervallo 8 ore tra i primi e gli ultimi. Data la durata relativamente breve dell&#39;esperimento, con l&#39;infezione dura solo 18 ore, ciò introduce una variabile inaccettabile in piastre. Non solo piastre di congelamento prima dell&#39;analisi risolvere questo problema, ma è anche essenziale nel contesto di high-throughput di analisi che, con l&#39;attuale protocollo e il liquido standard di gestione dei robot, 2 le persone possono facilmente elaborare fino a 50 piastre una settimana. Attualmente, abbiamo regolarmente schermo 30 piastre una settimana, che permette uno schermo intero genomada effettuare una volta in meno di 2 mesi.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; Una caratteristica interessante di questo protocollo è il fatto che essa utilizza agar solido, permettendo dosaggi che non possono essere eseguite in coltura liquida. Come fisiologia verme differisce a seconda delle condizioni di coltura<sup&gt; 20,21</sup&gt;, Essendo in grado di eseguire saggi su supporto solido può anche integrare usuali base liquida schermi. Per alcuni fenotipi movimento (ad esempio), l&#39;analisi può essere effettuata direttamente con 96-well solidi piastre di terreno. Per la schermata corrente, tuttavia, come il Biosort non può campionare da piastre di terreno solido, i vermi vengono prima trasferiti a liquido prima del congelamento. D&#39;altra parte, il Biosort COPAS consente un&#39;analisi multiparametrica quantitativa compatibile con la misurazione di molti diversi fenotipi. È probabile che per ogni dato schermo non tutti i parametri misurati sarà la lettura primaria out. Tuttavia, queste misurazioni possono essere utili per varie ragioni. Essi permettono di determinare se il saggio eseguito correttamente. Ad esempio, si può controllare il numero e la dimensione dei vermi in ciascun pozzetto. Solo quando un clone RNAi dovrebbe bloccare la crescita o la riproduzione dovrebbe esserci uno scostamento dai valori attesi. Wells con meno di 20 vermi o / e degli animali del 30% più piccoli (TOF) rispetto ad una standarddard di controllo con nessun effetto sulla crescita (<em&gt; Ad esempio, GFP (RNAi</em&gt;)) Può essere escluso dal analisi successive. La funzione di questi cloni possono essere identificati utilizzando un protocollo alternativo in cui i vermi sono esposti ai batteri RNAi dopo il loro sviluppo è in fase avanzata<sup&gt; 15</sup&gt;. I vari parametri possono anche essere utilizzati per perfezionare gene candidato (hit) selezione, per esempio, limitando riscontro solo a quelle che influiscono fluorescenza verde, ma non rosso. Il metodo preciso prescelte per la selezione riscontro dipenderà dal tipo di schermo e la sua esatta lettura-out. Data la complessità dei dati generati da un punto di genome-wide screen, la collaborazione con un esperto di statistica può essere richiesta.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; Il protocollo che descriviamo può essere facilmente adattato ad altri tipi di saggi. Ad esempio, al passo infezione<em&gt; D. coniospora</em&gt; Potrebbe essere sostituita da qualsiasi altro agente patogeno in grado di infettare su supporti solidi. Questo è potenzialmente utile che abbiamo trovato che molti dei fattori di virulenza importanti per l&#39;infezione da Serratia marcescens in coltura liquida non svolgono un ruolo durante l&#39;infezione su terreno solido (E. Pradel, comunicazione personale). Il protocollo è inoltre pienamente compatibile con i test di composti chimici<sup&gt; 22-24</sup&gt;, O per identificare composti con attività biologica utilizzando diverse librerie di batteri<sup&gt; 25</sup&gt;, Quindi dovrebbe trovare un programma di utilità generale nel<em&gt; C. elegans</em&gt; Comunità di ricerca.</p

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reattivo </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Comments </td></tr><tr><td> BactoAgar </td><td> BD Diagnostic Systems </td><td> 214010 </td><td></td></tr><tr><td> Ampicillin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A9518 </td><td></td></tr><tr><td> BactoPeptone </td><td> BD Diagnostic Systems </td><td> 211677 </td><td></td></tr><tr><td> CaCl 2 </td><td> Ogni fornitore </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Pellicola adesiva AeraSeal </td><td> Dutscher </td><td> 760214 </td><td></td></tr><tr><td> Isopropil β-D-tiogalattopiranoside (IPTG) </td><td> Thermo Scientific </td><td> AB-0481 </td><td></td></tr><tr><td> K 2 HPO 4 </td><td> Ogni fornitore </td><td></td><td></td></tr><tr><td> KH 2 PO 4 </td><td> Ogni fornitore </td><td></td><td></td></tr><tr><td> MgSO 4 </td><td> Ogni fornitore </td><td></td><td></td></tr><tr><td> NaCl </td><td> Ogni fornitore </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Na 2 HPO 4 </td><td> Ogni fornitore </td><td></td><td></td></tr><tr><td> NaOH </td><td> Ogni fornitore </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Piastra da 96 pozzi profondi </td><td> Thermo Scientific </td><td> AB-0932 </td><td></td></tr><tr><td> Piastra a 96 pozzetti piatta </td><td> FALCON </td><td> 353072 </td><td></td></tr><tr><td> Piastra a 96 pozzetti rotonda </td><td> FALCON </td><td> 353077 </td><td></td></tr><tr><td> Tetracycline </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T8032 </td><td></td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> Ogni fornitore </td><td></td><td></td></tr><tr><td> TECAN robot </td><td> TECAN </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Liquidator96 TM </td><td> RAININ </td><td></td><td></td></tr><tr><td> COPAS Biosort </td><td> Union Biometrica </td><td></td><td></td></tr><tr><td> LIMS </td><td> Modul-Bio </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

quantitative e automatica high-throughput genome-wide schermi rnai in c. elegans</em

Quantitative and Automated High-throughput Genome-wide RNAi Screens in C. elegans

RNA interferenza è un potente metodo per capire la funzione dei geni, soprattutto se condotta in un intero genoma scala e in un contesto quantitativo. In C. elegans, la funzione del gene può essere abbattuto modo semplice ed efficiente da mangiare vermi con i batteri che esprimono un dsRNA corrispondente a un gene specifico 1. Mentre la creazione di librerie di cloni RNAi che copre la maggior parte del C. elegans genoma 2,3 aperto la strada a veri e propri studi di genomica funzionale (vedi per esempio 4-7), la maggior parte dei metodi stabiliti sono laboriosi. Moy e colleghi hanno sviluppato protocolli semi-automatici che facilitano la genome-wide schermi 8. L&#39;approccio si basa su immagini microscopiche e analisi delle immagini. Qui si descrive un protocollo alternativo per un alto throughput genoma schermo, sulla base del manipolatore batterica cloni RNAi, analisi quantitativa utilizzando la Biosort COPAS (Union Biometrica (UBI)), e unosoftware integrato: il MBioLIMS (Laboratory Information System della Direzione di Modul-Bio), una tecnologia che offre un throughput maggiore per la gestione dei dati e tracciabilità del campione. Il metodo consente di schermi essere realizzato su piastre di terreno solido. Ciò è particolarmente importante per alcuni studi, come quelli riguardanti le interazioni ospite-patogeno in C. elegans, dal momento che alcuni microbi non si infettano in modo efficiente i vermi in coltura liquida. Si mostrano come il metodo può essere utilizzato per quantificare l&#39;importanza di geni anti-fungini immunità innata in C. elegans. In questo caso, l&#39;approccio si basa sull&#39;utilizzo di un ceppo transgenica che trasporta un epidermica un&#39;infezione-inducibile gene fluorescente reporter, con GFP sotto il controllo del promotore del gene NLP peptide antimicrobico 29 e un reporter fluorescente rossa che si esprime costitutivamente nella epidermide. Quest&#39;ultimo fornisce un controllo interno per l&#39;integrità funzionale dell&#39;epidermidetransgene e aspecifica tacere 9. Quando i vermi di controllo sono infettate dal fungo che fluorescenza verde. Abbattere da RNAi un gene necessario per nlp 29 risultati di espressione a fluorescenza diminuita dopo l&#39;infezione. Attualmente, questo protocollo permette di oltre 3.000 cloni RNAi per essere testato e analizzato a settimana, aprendo la possibilità di screening dell&#39;intero genoma in meno di 2 mesi.

Descriviamo un protocollo usando<em&gt; C. elegans</em&gt; E librerie di alimentazione RNAi che permette la misurazione automatica dei molteplici parametri come la fluorescenza, le dimensioni e l&#39;opacità dei vermi individuali in una popolazione. Diamo un esempio di uno schermo per identificare i geni coinvolti in anti-fungine immunità innata<em&gt; C. elegans</em&gt;.

Quantitative e automatica High-throughput Genome-wide Schermi RNAi in C. elegans</em

L'interferenza dell'RNA è un metodo potente per comprendere la funzione genica, specialmente quando condotta su scala dell'intero genoma e in un contesto quantitativo. In C. ...

L'obiettivo generale di questa procedura è analizzare la funzione genica in modo quantitativo e osservare l'eleganza su scala genomica. Questo viene ottenuto innanzitutto riducendo l'espressione di ciascun gene mediante RNAi, in piastre a 96 pozzetti.Successivamente, viene eseguito il test appropriato per la funzione genica. In questo esempio, la capacità dell'*Aiptasia* di rispondere normalmente all'infezione fungina viene valutata analizzando l'espressione di un reporter fluorescente induttibile. Quindi, viene effettuata un'analisi quantitativa automatizzata utilizzando il Coss bio sortt. Infine, l'analisi di caratteristiche quantificabili, come l'espressione di un gene reporter fluorescente, rivela sottoinsiemi di geni necessari per modulare percorsi specifici, regolando lo sviluppo, il comportamento o la fisiologia.Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali in diversi campi in cui si osserva eleganza, come lo sviluppo, la neurobiologia e le interazioni tra ospite e patogeni. Abbiamo avuto per la prima volta l'idea di questo metodo quando la Oranger lab pubblicò le prime schermate su larga scala di RNA dell'occhio. Sviluppare gli strumenti necessari e perfezionare l'automazione richiese uno sforzo considerevole.Dimostrerò la procedura insieme a Olivia Ti, scienziata e assistente di ricerca del laboratorio di Jonathan Eubanks. Per preparare da 10 a 1296 piastre, iniziare preparando 100 millilitri di terreno di crescita per nematodi, o NGM, in acqua deionizzata. Si prega di consultare il protocollo scritto per le istruzioni.Quando il mezzo è ancora caldo, aggiungere 100 microgrammi per millilitro di ampicillina, 12,5 microgrammi per millilitro di tetraciclina, quattro millimolari di IPTG e distribuire rapidamente 75 microlitri in ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti con fondo piatto. Verificare la presenza di bolle d'aria nei pozzetti ed eliminarle immediatamente. Conservare le piastre in una camera umidificata a quattro gradi centigradi.Successivamente, preparare piastre a 96 pozzetti aggiungendo 1,5 millilitri di LB contenente ampicillina e tetraciclina. Aggiungere a ciascun pozzetto un'etichetta univoca o un codice a barre. Coprire ogni piastra e conservare a quattro gradi centigradi se preparata in anticipo, agitare la piastra di riserva di LB a 96 pozzetti contenente l'RNAI.Cloni batterici con ampicillina, tetraciclina e glicerolo, e distribuire tre microlitri di ciascun clone batterico nel pozzetto corrispondente di una piastra a 96 pozzetti profondi precedentemente preparata. Utilizzare pozzetti vuoti come controlli, coprire le piastre a 96 pozzetti con una pellicola adesiva e incubare durante la notte a 37 gradi centigradi con agitazione. Collocare la piastra di replica a 96 pozzetti utilizzata a meno 80 gradi Celsius nella mattinata successiva alla coltura notturna.Trasferire le piastre NGM a 96 pozzetti da quattro gradi centigradi a un armadio a flusso laminare sterile e lasciarle riscaldare ed asciugare per cinque-quindici minuti. Quindi aggiungere l'etichetta o il codice a barre appropriato a ciascuna piastra. Recuperare le piastre a 96 pozzetti profondi con colture notturne dall'incubatrice.Osservare le colture batteriche cresciute con successo in centrifuga. Le piastre a 96 pozzetti profondi per cinque minuti a 4.000 giri al minuto. Rimuovere il soprannatante capovolgendo bruscamente la piastra e asciugare rapidamente.I bordi della piastra su un tovagliolo di carta risospendono il pellet batterico nel liquido residuo mediante vortex. Idealmente, utilizzando un agitatore dedicato in modo che ogni piastra riceva esattamente lo stesso trattamento. Trasferire cinque microlitri dei batteri risospesi in Resus sulle piastre NGM a 96 pozzetti utilizzando una pipetta multicanale da otto o dodici canali.Evitare di toccare l'NGM. Lasciare asciugare i batteri sotto una cappa a flusso laminare sterile per circa due ore. Controllare regolarmente per evitare che l'NGM diventi troppo secco; incubare le piastre R-N-A-I-N-G-M a 96 pozzetti a 37 gradi centigradi durante la notte in una camera umidificata.Fare riferimento al protocollo scritto per preparare una popolazione sincronizzata di vermi dopo aver raffreddato le piastre a 96 pozzetti R-N-A-I-N-G-M a temperatura ambiente. Aggiungere circa da 100 a 200 vermi in due microlitri di M nine a ciascun pozzetto. Verificare che ogni pozzetto contenga vermi.I vermi devono nuotare. Lasciare asciugare le piastre in un armadio a flusso laminare sterile per un massimo di un'ora. Controllare regolarmente le piastre.I vermi devono strisciare invece di nuotare. Posizionare le piastre in una camera umida a 25 gradi centigradi durante la notte. Dopo aver selezionato un lotto altamente infettivo di spore di Judge Miria.Utilizzare il buffer M nove per raccogliere le spore da una piastra di nove centimetri. Distribuire quattro microlitri di spore in ogni pozzetto e verificare la presenza di spore in ciascun pozzetto. I vermi dovrebbero nuotare.Lasciare asciugare le piastre sotto una cappa a flusso laminare sterile per circa un'ora. Controllare regolarmente le piastre finché i vermi non iniziano a strisciare. Successivamente, collocare le piastre infette in una camera umida a 25 gradi centigradi per tutta la notte.Verificare i vermi prima dell'analisi osservandoli rapidamente al microscopio fluorescente per accertare uno sviluppo adeguato, una buona induzione di GFP nei pozzetti del controllo negativo e una ridotta fluorescenza di GFP nei pozzetti del controllo positivo. Se l'induzione è soddisfacente, utilizzando una pipetta multicanale a otto o dodici canali trasferire i vermi con 100 microlitri di NACL 50 millimolari e 0,05% di Triton in una nuova piastra rotonda a 96 pozzetti, etichettata o con codice a barre.Congelare le piastre a meno 80 gradi Celsius fino all'analisi. Nel giorno dell'analisi, scongelare le piastre congelate a temperatura ambiente. Una volta che le piastre si sono scongelate, procedere all'analisi automatizzata utilizzando il COPA bios.La macchina elabora la piastra pozzetto per pozzetto e analizza i parametri di ciascun verme, come la loro fluorescenza. Trascrivere le informazioni ottenute da COPA bios sortt in un file Excel per verificare la qualità dei dati. Successivamente, archiviare i dati grezzi, inclusi densità ottica, lunghezza assiale e emissioni fluorescenti, in un pacchetto limbs per analisi quantitative dettagliate successive.In questo esperimento, vermi transgenici esprimevano costitutivamente un reporter P call 12 ds red e un PNLP 29 GFP induttibile. I vermi reporter sono stati esposti a un clone controllo o a un clone A-G-F-P-R-N-A eye per 48 ore. I pannelli a sinistra mostrano vermi non infetti, mentre quelli a destra mostrano vermi 18 ore dopo l'infezione con D spora.Quando il fenotipo di interesse è l'espressione di un reporter GFP, le pozzette con il clone RNAi per GFP costituiscono un controllo robusto. COPA bios SORTT genera dati numerici per ciascun verme analizzato. Questi grafici mostrano la media e la deviazione standard per ciascuna pozzetta di vermi transgenici.Esprimendo costitutivamente un reporter rosso p call 12 DS e un reporter GFP PNLP 29 induttibile dopo RNAI e infezione con diaspora. Il sorter analizza il tempo di volo (TOF), che corrisponde alle dimensioni dei vermi, la fluorescenza rossa e il rapporto tra fluorescenza verde e TOF. Alcuni cloni provocano difetti di crescita e/o influenzano l'espressione di P 12 DS rosso.Altri influenzano specificamente l'espressione delle proteine fluorescenti. Ad esempio, questo particolare clone ha come bersaglio il gene NS Y, precedentemente dimostrato essere importante per la regolazione di NLP 29. La fluorescenza verde e rossa e il TOF vengono misurati in unità arbitrarie ma costanti.Una delle innovazioni di questo protocollo è l'utilizzo di piastre congelate per posticipare la loro analisi. Il congelamento consente di conservare le piastre fino a due settimane senza alterare sostanzialmente i risultati, come mostrato in questo caso. Sebbene i valori assoluti della fluorescenza misurata possano variare, i loro rapporti relativi rimangono simili.Quattro vermi portatori dei transgeni PNLP-29 GFP e Pcall-12 dsRed sono stati infettati o meno con diaspora. Dopo 18 ore, ogni piastra è stata approssimativamente divisa in due metà: una metà è stata analizzata immediatamente, l'altra è stata congelata a -80 gradi Celsius per 24 ore prima di essere scongelata. Per ogni campione sono stati calcolati i valori medi di dimensione, opacità e fluorescenza verde e rossa.Il grafico mostra il rapporto tra la media dei campioni infetti e quella dei campioni non infetti per i campioni congelati e vivi mostrati qui. Da analisi duplicate di una piastra rappresentativa derivano i rapporti di fluorescenza normalizzati per ogni pozzetto, calcolati come media della fluorescenza di un pozzetto divisa per la media tagliata della piastra. Una volta padroneggiato, questo protocollo permette a un gruppo di due o tre persone di eseguire uno screening su scala genomica in due o tre mesi.L'esecuzione corretta di questo protocollo richiede un ottimo lavoro di squadra. I membri del mio gruppo hanno investito un enorme sforzo per realizzare un protocollo efficiente e relativamente semplice da eseguire.

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