Quantitative e automatica High-throughput Genome-wide Schermi RNAi in C. elegans

L'obiettivo generale di questa procedura è analizzare la funzione genica in modo quantitativo e osservare l'eleganza su scala genomica. Questo viene ottenuto innanzitutto riducendo l'espressione di ciascun gene mediante RNAi, in piastre a 96 pozzetti.

Successivamente, viene eseguito il test appropriato per la funzione genica. In questo esempio, la capacità dell'*Aiptasia* di rispondere normalmente all'infezione fungina viene valutata analizzando l'espressione di un reporter fluorescente induttibile. Quindi, viene effettuata un'analisi quantitativa automatizzata utilizzando il Coss bio sortt. Infine, l'analisi di caratteristiche quantificabili, come l'espressione di un gene reporter fluorescente, rivela sottoinsiemi di geni necessari per modulare percorsi specifici, regolando lo sviluppo, il comportamento o la fisiologia.

Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali in diversi campi in cui si osserva eleganza, come lo sviluppo, la neurobiologia e le interazioni tra ospite e patogeni. Abbiamo avuto per la prima volta l'idea di questo metodo quando la Oranger lab pubblicò le prime schermate su larga scala di RNA dell'occhio. Sviluppare gli strumenti necessari e perfezionare l'automazione richiese uno sforzo considerevole.

Dimostrerò la procedura insieme a Olivia Ti, scienziata e assistente di ricerca del laboratorio di Jonathan Eubanks. Per preparare da 10 a 1296 piastre, iniziare preparando 100 millilitri di terreno di crescita per nematodi, o NGM, in acqua deionizzata. Si prega di consultare il protocollo scritto per le istruzioni.

Quando il mezzo è ancora caldo, aggiungere 100 microgrammi per millilitro di ampicillina, 12,5 microgrammi per millilitro di tetraciclina, quattro millimolari di IPTG e distribuire rapidamente 75 microlitri in ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti con fondo piatto. Verificare la presenza di bolle d'aria nei pozzetti ed eliminarle immediatamente. Conservare le piastre in una camera umidificata a quattro gradi centigradi.

Successivamente, preparare piastre a 96 pozzetti aggiungendo 1,5 millilitri di LB contenente ampicillina e tetraciclina. Aggiungere a ciascun pozzetto un'etichetta univoca o un codice a barre. Coprire ogni piastra e conservare a quattro gradi centigradi se preparata in anticipo, agitare la piastra di riserva di LB a 96 pozzetti contenente l'RNAI.

Cloni batterici con ampicillina, tetraciclina e glicerolo, e distribuire tre microlitri di ciascun clone batterico nel pozzetto corrispondente di una piastra a 96 pozzetti profondi precedentemente preparata. Utilizzare pozzetti vuoti come controlli, coprire le piastre a 96 pozzetti con una pellicola adesiva e incubare durante la notte a 37 gradi centigradi con agitazione. Collocare la piastra di replica a 96 pozzetti utilizzata a meno 80 gradi Celsius nella mattinata successiva alla coltura notturna.

Trasferire le piastre NGM a 96 pozzetti da quattro gradi centigradi a un armadio a flusso laminare sterile e lasciarle riscaldare ed asciugare per cinque-quindici minuti. Quindi aggiungere l'etichetta o il codice a barre appropriato a ciascuna piastra. Recuperare le piastre a 96 pozzetti profondi con colture notturne dall'incubatrice.

Osservare le colture batteriche cresciute con successo in centrifuga. Le piastre a 96 pozzetti profondi per cinque minuti a 4.000 giri al minuto. Rimuovere il soprannatante capovolgendo bruscamente la piastra e asciugare rapidamente.

I bordi della piastra su un tovagliolo di carta risospendono il pellet batterico nel liquido residuo mediante vortex. Idealmente, utilizzando un agitatore dedicato in modo che ogni piastra riceva esattamente lo stesso trattamento. Trasferire cinque microlitri dei batteri risospesi in Resus sulle piastre NGM a 96 pozzetti utilizzando una pipetta multicanale da otto o dodici canali.

Evitare di toccare l'NGM. Lasciare asciugare i batteri sotto una cappa a flusso laminare sterile per circa due ore. Controllare regolarmente per evitare che l'NGM diventi troppo secco; incubare le piastre R-N-A-I-N-G-M a 96 pozzetti a 37 gradi centigradi durante la notte in una camera umidificata.

Fare riferimento al protocollo scritto per preparare una popolazione sincronizzata di vermi dopo aver raffreddato le piastre a 96 pozzetti R-N-A-I-N-G-M a temperatura ambiente. Aggiungere circa da 100 a 200 vermi in due microlitri di M nine a ciascun pozzetto. Verificare che ogni pozzetto contenga vermi.

I vermi devono nuotare. Lasciare asciugare le piastre in un armadio a flusso laminare sterile per un massimo di un'ora. Controllare regolarmente le piastre.

I vermi devono strisciare invece di nuotare. Posizionare le piastre in una camera umida a 25 gradi centigradi durante la notte. Dopo aver selezionato un lotto altamente infettivo di spore di Judge Miria.

Utilizzare il buffer M nove per raccogliere le spore da una piastra di nove centimetri. Distribuire quattro microlitri di spore in ogni pozzetto e verificare la presenza di spore in ciascun pozzetto. I vermi dovrebbero nuotare.

Lasciare asciugare le piastre sotto una cappa a flusso laminare sterile per circa un'ora. Controllare regolarmente le piastre finché i vermi non iniziano a strisciare. Successivamente, collocare le piastre infette in una camera umida a 25 gradi centigradi per tutta la notte.

Verificare i vermi prima dell'analisi osservandoli rapidamente al microscopio fluorescente per accertare uno sviluppo adeguato, una buona induzione di GFP nei pozzetti del controllo negativo e una ridotta fluorescenza di GFP nei pozzetti del controllo positivo. Se l'induzione è soddisfacente, utilizzando una pipetta multicanale a otto o dodici canali trasferire i vermi con 100 microlitri di NACL 50 millimolari e 0,05% di Triton in una nuova piastra rotonda a 96 pozzetti, etichettata o con codice a barre.

Congelare le piastre a meno 80 gradi Celsius fino all'analisi. Nel giorno dell'analisi, scongelare le piastre congelate a temperatura ambiente. Una volta che le piastre si sono scongelate, procedere all'analisi automatizzata utilizzando il COPA bios.

La macchina elabora la piastra pozzetto per pozzetto e analizza i parametri di ciascun verme, come la loro fluorescenza. Trascrivere le informazioni ottenute da COPA bios sortt in un file Excel per verificare la qualità dei dati. Successivamente, archiviare i dati grezzi, inclusi densità ottica, lunghezza assiale e emissioni fluorescenti, in un pacchetto limbs per analisi quantitative dettagliate successive.

In questo esperimento, vermi transgenici esprimevano costitutivamente un reporter P call 12 ds red e un PNLP 29 GFP induttibile. I vermi reporter sono stati esposti a un clone controllo o a un clone A-G-F-P-R-N-A eye per 48 ore. I pannelli a sinistra mostrano vermi non infetti, mentre quelli a destra mostrano vermi 18 ore dopo l'infezione con D spora.

Quando il fenotipo di interesse è l'espressione di un reporter GFP, le pozzette con il clone RNAi per GFP costituiscono un controllo robusto. COPA bios SORTT genera dati numerici per ciascun verme analizzato. Questi grafici mostrano la media e la deviazione standard per ciascuna pozzetta di vermi transgenici.

Esprimendo costitutivamente un reporter rosso p call 12 DS e un reporter GFP PNLP 29 induttibile dopo RNAI e infezione con diaspora. Il sorter analizza il tempo di volo (TOF), che corrisponde alle dimensioni dei vermi, la fluorescenza rossa e il rapporto tra fluorescenza verde e TOF. Alcuni cloni provocano difetti di crescita e/o influenzano l'espressione di P 12 DS rosso.

Altri influenzano specificamente l'espressione delle proteine fluorescenti. Ad esempio, questo particolare clone ha come bersaglio il gene NS Y, precedentemente dimostrato essere importante per la regolazione di NLP 29. La fluorescenza verde e rossa e il TOF vengono misurati in unità arbitrarie ma costanti.

Una delle innovazioni di questo protocollo è l'utilizzo di piastre congelate per posticipare la loro analisi. Il congelamento consente di conservare le piastre fino a due settimane senza alterare sostanzialmente i risultati, come mostrato in questo caso. Sebbene i valori assoluti della fluorescenza misurata possano variare, i loro rapporti relativi rimangono simili.

Quattro vermi portatori dei transgeni PNLP-29 GFP e Pcall-12 dsRed sono stati infettati o meno con diaspora. Dopo 18 ore, ogni piastra è stata approssimativamente divisa in due metà: una metà è stata analizzata immediatamente, l'altra è stata congelata a -80 gradi Celsius per 24 ore prima di essere scongelata. Per ogni campione sono stati calcolati i valori medi di dimensione, opacità e fluorescenza verde e rossa.

Il grafico mostra il rapporto tra la media dei campioni infetti e quella dei campioni non infetti per i campioni congelati e vivi mostrati qui. Da analisi duplicate di una piastra rappresentativa derivano i rapporti di fluorescenza normalizzati per ogni pozzetto, calcolati come media della fluorescenza di un pozzetto divisa per la media tagliata della piastra. Una volta padroneggiato, questo protocollo permette a un gruppo di due o tre persone di eseguire uno screening su scala genomica in due o tre mesi.

L'esecuzione corretta di questo protocollo richiede un ottimo lavoro di squadra. I membri del mio gruppo hanno investito un enorme sforzo per realizzare un protocollo efficiente e relativamente semplice da eseguire.