Name: Contenuto di screening ad alto contenuto di Malattie Neurodegenerative (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-01-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 32 s
Description: Scopri come utilizzare saggi ad alto contenuto per analizzare vie cellulari nelle malattie neurodegenerative. Questo metodo combina coltura automatizzata e imaging per studiare geni coinvolti nella patogenesi.

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Ringraziamo i programmatori Hamilton e specialisti per il supporto continuo e Blaas Eva per l&#39;assistenza tecnica. Questo lavoro è stato supportato da due sovvenzioni agli investimenti NWO (911-07-031 e 40-00506-98-10011), Il Prinses Beatrix Fonds Wetenschapsprijs 2009 e il Campus di Neuroscienze di Amsterdam; SJ è supportato da Ti-Pharma: T5-207.

1. Automatizzata aderente cultura processo cellulare (Figura 1) 20 <ol><li> Preparare il sistema automatizzato di coltura cellulare per l'inserimento di piastre di coltura cellulare. Carico di consumo (es. puntali, piastre di coltura cellulare, piatti saggio) nel sistema utilizzando l'interfaccia grafica utente (GUI). Assicurarsi che ci sia sufficiente terreni di coltura cellulare, tampone fosfato (PBS) e tripsina nel sistema robotico. </li><li> Manualmente seme due piastre omnitray con 2 x 10 6 cellule per piastra, delle SH-SY5Y linea di cellule di neuroblastoma. Mantenere le cellule in Opti-MEM con il 10% di siero fetale bovino (FBS). Mettere i piatti nel robot coltura cellulare utilizzando la GUI. Le cellule verranno incubate a 37 ° C e 5% di CO 2. </li><li> Scegliere quale delle cellule protocollo cultura ha bisogno di essere iniziato 20. Si può scegliere tra un processo di coltura cellulare aderente 22, coltura ed espansione di staminali embrionali (ES), le cellule sulle cellule del mouse alimentatore 23 o la coltura di sospensione cells 22. </li><li> Selezionare il protocollo aderente colture cellulari (Figura 1) e garantire aderente cellulare file di parametri specifica linea sono regolate in modo che la soglia di confluenza (l'area del piatto omnitray che contiene le cellule) è fissato al 70%. Impostare il tempo totale tripsinizzazione a due minuti. </li><li> Istruire il robot per preparare piatti omnitray nuovo, con un numero di cellule semina di 2 x 10 6 cellule per piastra. </li><li> Omnitray piastre di ingresso nel sistema di coltura cellulare utilizzando il protocollo automatizzato aderente colture cellulari (Figura 1). Questo protocollo prevede le seguenti fasi: le piastre vengono incubate e ripreso fino a raggiungere la soglia prestabilita, confluenza. Se le cellule non raggiungono la soglia di confluenza entro 5 letture, le piastre vengono rimossi dal sistema. Una volta raggiunta la soglia di confluenza definiti dall'utente, le cellule vengono lavate, trypsinized e contati. Un pre-definito numero di cellule sono aggiunti alle piastre omnitray nuovo e se ci sono un numero sufficiente di cellule, un insensibile specificatoer saggio di piastre vengono trasportati al ponte e un numero definito di cellule erogato in ciascun pozzetto. Piastre di test può essere ripreso direttamente utilizzando il microscopio integrato o di uscita dal sistema per ulteriori elaborazioni. </li><li> Istruire il sistema per preparare 4 piatti test per piastra omnitray, con un totale di 5.000 cellule per pozzetto. </li></ol> 2. shRNA produzione di virus e placcatura in piastre di test (Tempo di percorrenza: 6 giorni) <ol><li> Crescono le scorte glicerolo batterico contenente i vettori shRNA (Open Biosystems, TRC1) pernottamento in 2 ml di Luria-Bertani supporti media contenente 100 mg / ml di ampicilin (Sigma-Aldrich). </li><li> Estratto di plasmidi seguendo il protocollo del produttore (Promega Wizard MagneSil TFX). </li><li> Produrre dei virus mediante RNAi Consorzio High-Throughput Produzione lentivirali (96 pozzetti) protocollo 24. Lavorare con i lentivirus è relativamente sicuro, perché le particelle del virus utilizzato per la trasduzione si replica con deficit e split-strategie di imballaggio gene sono utilizzati per la loro produzione. Tuttavia, quando si lavora con lentivirus, ulteriori procedure di biosicurezza sono necessarie per minimizzare il rischio per se stessi e gli altri 25. Tutti gli esperimenti devono essere condotti in un laboratorio di livello MLII o BSL2 sicurezza. Tutte le plastiche (pipette, piatti di plastica, i media) che sono stati in contatto con particelle di lentivirus devono essere incubate con candeggina per 24 ore prima dello smaltimento. </li><li> Calcolare la molteplicità di infezione (MOI) del lentivirus determinando la percentuale di cellule GFP positive con il GFP pLKO.1 plasmide (Sigma-Aldrich). </li><li> Lentivirus piastra in piastre di test, con una MOI di 3. </li></ol> 3. Trasduzione lentivirali e la differenziazione neuronale delle cellule SH-SY5Y (Tempo di percorrenza: 6 giorni) <ol><li> Le cellule sono aggiunti alle piastre test (vedi passo 1.7). Piastre di test di carico contenenti lentivirus shRNA nel sistema automatizzato di coltura cellulare. </li><li> Dopo 24 ore, i media sulpiastre test verrà modificato in Opti-MEM contenente FBS 0,5% e 0,1 mM acido retinoico per iniziare il processo di differenziazione. Differenziazione delle cellule SH-SY5Y permette la visualizzazione di strutture neuritiche e sincronizza la divisione cellulare. </li><li> Continua l'incubazione delle piastre saggio sui media differenziazione per 5 giorni. Questo assicura la massima knockdown di espressione del gene bersaglio. </li><li> Il giorno 5, aggiungere 50 mM H 2 O 2 alla metà delle piastre test per 24 ore per stimolare la traslocazione di DJ1 ai mitocondri. </li><li> Il giorno 6, aggiungere CmxROS Mitotracker (Invitrogen) alle celle, ad una concentrazione finale di 200 Nm per pozzetto e incubare a 37 ° C per 30 minuti. </li><li> Si può istruire il sistema di piastre immagine direttamente mediante l'imager HC o piastre possono essere esportati dal sistema per ulteriori elaborazioni. </li></ol> 4. Immunocolorazione automatizzata delle piastre test (Tempo di percorrenza: 2 giorni) La qualità dell'immagine è paramount per lo svolgimento di un sensibile e affidabile HCS. Danni al monostrato cellulare a causa di pipettaggio inesatte possono portare a scarsa qualità dell'immagine e dei risultati non riproducibili. Al fine di minimizzare i danni strato di cellule, il immunocolorazione è stata condotta utilizzando una stazione robotica. La procedura è simile a uno che è stato descritto in precedenza 26 ma è stato personalizzato per aumentare la produttività e ridurre l'utilizzo di materiali di consumo. <ol><li> Fissare le cellule con 100 ml di paraformaldeide 4% pre-riscaldato a 37 ° C. Incubare per 20 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Lavare le cellule con 200 ml di PBS per 5 minuti, 3 volte. </li><li> Incubare le piastre test con 200 ml di PBS contenente 0,1% Triton (PBST) per 10 minuti. </li><li> Lavare le cellule con 200 ml di PBS per 5 minuti, 3 volte. </li><li> Incubare le piastre test con 200 ml di buffer di blocco (PBST con il 5% FBS) per 1 ora a temperatura ambiente. </li><li> Lavare le cellule con 200 ml di PBS per 5 minuti, 3 volte. </li><li> Incubare con il folla causa anticorpi primari notte a 4 ° C: <ol><li> Capra DJ1 N20 (Santa Cruz, 5 mcg / ml) </li><li> Coniglio β-III tubulina (Sigma-Aldrich, 1 mg / ml) </li></ol></li><li> Il giorno seguente, lavare le cellule con 200 ml di PBS per 5 minuti, 3 volte. </li><li> Incubare le piastre test con i seguenti anticorpi secondari 1 ora a temperatura ambiente: <ol><li> AlexaFluor 488 asino anti-capra (Invitrogen, 2 mg / ml) </li><li> AlexaFluor 647 capra anti-coniglio (Invitrogen, 2 mg / ml </li></ol></li><li> Lavare le cellule con 200 ml di PBS per 5 minuti, 3 volte. </li><li> Incubare le cellule con la Hoechst (Invitrogen, 1 mg / ml) per 10 minuti. </li><li> Lavare le cellule con 200 l PBS per 5 minuti, 3 volte. </li><li> Conservare le piastre a 4 ° C fino a che non possono essere esposte. </li></ol> 5. Alto contenuto di immagine acquisizione e analisi delle immagini (Tempo richiesto: 5 giorni) <ol><li> Immagine per un totale di 30 campi per pozzetto utilizzando la lente dell'obiettivo 20x. Visualizza DJ1 con la FITC filtro impostato, i mitocondri con il set TRITC filtro, β-tubulina III con l'insieme Cy5 filtro e dei nuclei utilizzando il set di filtro UV (Figura 3). </li><li> Analizzare le immagini utilizzando la Bioapplication Compartimentale Analysis (Cellomics, ThermoFisher) per determinare l'intensità media del segnale Mitotracker all'interno dei mitocondri. (Figura 4B, F). </li><li> Per determinare il coefficiente medio di sovrapposizione tra DJ1 ei mitocondri, analizzare le immagini utilizzando la bioapplication Cellomics Colocalisation (Cellomics, ThermoFisher). Definire le aree di interesse (ROI) nel modo seguente: ROI A - nucleo (4A, E), il ROI B - mitocondri (Figura 4 B, F). Escludi ROI ROI A da B per garantire l'analisi di soltanto nel citoplasma. Definire i mitocondri come regione obiettivo I e DJ1 come obiettivo regione II (Figura 4C, G). </li><li> Analizzare le immagini utilizzando la bioapplication neuronale Profiling (Cellomics, Thermofisher) per tracciare la lunghezza media dei neuriti dal β-tubulina III colorazione (Figura4D, H). </li><li> Piastre immagine utilizzando l'Opera LX automatizzato confocale lettore (Perkin-Elmer). Immagine per un totale di 30 campi per pozzetto utilizzando la lente 60x obiettivo con immersione in acqua. Visualizza mitocondri con il laser 561 nM e nuclei con eccitazione UV. </li><li> Analizzare le immagini utilizzando il Spot-Edge-Ridge (SER) texture algoritmo caratteristiche. La SER-Ridge filtro trasmette intensità in pixel che formano cresta simile a modelli. La più frammentati i mitocondri, maggiore è il SER-Ridge score (Figura 8). </li></ol> 6. Normalizzazione dei dati e analisi <ol><li> Importare i dati dal software di analisi delle immagini nel pacchetto Bioconductor CellHTS2 per l'ambiente software R (R versione 2.11.1, la versione Bioconductor 2.6). </li><li> Logaritmo in base (2) trasformare i dati prima di ogni normalizzazione piastra mediana a base 27, 28. Non applicare la regolazione varianza per piastra. </li><li> Per identificare modificatori di un fenotipo, utilizzare due ANOVA strada tra la different i gruppi di trattamento ovvero strapazzate infettate cellule non trattate vs strapazzate tossina cellule trattate rispetto a cellule non trattate rispetto al gene bersaglio le cellule trattate gene bersaglio (figure 5-7). </li></ol> 7. Rappresentante risultati Le mutazioni all'interno DJ1 dar luogo a esordio precoce-recessiva parkinsonismo 21, ma non è chiaro come la perdita di DJ1 dà origine al fenotipo della malattia. E 'noto che le cellule carenti di DJ1 sono più suscettibili a stress ossidativo indotto la morte cellulare e nella risposta allo stress ossidativo, DJ1 trasloca dal citoplasma ai mitocondri 29, 30. Mediante la costruzione di test HC di monitorare questi fenotipi, siamo in grado di identificare i geni che regolano o influenzano fenotipi associati con DJ1. Questo approccio può aiutare a decifrare i percorsi all'interno del quale DJ1 funzioni e che potrebbero essere coinvolti nella patogenesi della malattia. Esempio di interazione con epistatico DJ1 (Figura 5): Atterramento di DJ1 in cellule esposteai risultati tossina in una maggiore perdita di vitalità cellulare (BAR-B: image-B) rispetto alle cellule infettate con lentivirus strapazzate (BAR-A: image-A). Knockdown del gene bersaglio A ha un effetto simile a quella osservata nelle cellule con un knockdown DJ1 (BAR-C: image-C). Knockdown sia DJ1 e gene bersaglio Un traduce in una perdita significativamente maggiore di vitalità cellulare di perdita di entrambi i geni da soli (BAR-D: image-D). Questo suggerisce una interazione tra epistatico DJ1 e target gene A. Esempio di un gene che regola il DJ1 traslocazione (Figura 6): Quando le cellule sono esposte ad una tossina, DJ1 trasloca dal citoplasma ai mitocondri, che è quantificato da un coefficiente maggiore sovrapposizione tra DJ1 ei mitocondri (BAR-A: image A contro BAR-C: image C). Nelle cellule B in cui gene bersaglio è stato messo a tacere, meno DJ1 trasloca ai mitocondri quando le cellule sono esposte alla tossina. Ciò suggerisce che il gene B obiettivo è coinvolto nel trasporto di DJ1 ai mitocondri. (BAR-B: immagine B e BAR-D: image D) Esempio di un gene coinvolto nella crescita neuronale (Figura 7): Atterramento di C gene bersaglio nel selvaggio tipo SH-SY5Y cellule si traduce in un significativo aumento della lunghezza dei neuriti (BAR-B: image-B) rispetto alle cellule infettate con lentivirus che esprimono strapazzate shRNA (BAR-A: image A). Questo effetto si perde nelle cellule incubate con tossina (BAR-C e D). Esempio di un gene coinvolto nella morfologia mitocondriale (Figura 8): L'infezione di tipo selvaggio cellule SH-SY5Y con shRNA gene targeting D provocano una diminuzione della mitocondriale SER-Ridge valore di segmentazione (Figura 8, Immagine C e D) rispetto ai cellule infettate con lentivirus strapazzate (Figura 8, Immagine A e B). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3452/3452fig1_lg.jpg"><img alt="Figura 1." src="/files/ftp_upload/3452/3452fig1.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 1."></a> Figura 1 Schema di protocollo automatizzato colture cellulari.: ntent "&gt; <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3452/3452fig2_lg.jpg"><img alt="Figura 2." src="/files/ftp_upload/3452/3452fig2.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 2."></a> Figura 2 Schema del processo di screening, l'analisi delle immagini e dei metodi statistici utilizzati durante il processo di screening:. I) Le cellule sono coltivate fino a quando non sono confluenti e successivamente cromato nelle piastre test contenente il lentivirus shRNA. Le cellule sono differenziate per 5 giorni e la tossina viene quindi aggiunta alle piastre per 24 ore. Piastre di test sono uscita dal sistema e immunoistochimica. La quantità di tempo impiegato per ciascuno dei processi è indicato tra parentesi. ii) I dati sono acquisiti mediante un sensore HC (la vitalità delle cellule, proteine ​​e traslocazione escrescenza neuronale) e un imager automatizzato confocale (morfologia mitocondriale). I dati vengono esportati in CellHTS2 pacchetto entro R, base (2) log trasformati e normalizzati. ANOVA a due vie viene utilizzato per identificare interazioni significative tra le diverse variabili. Figura 3. Immagini composite di cellule acquisita da HC imaging. A) le cellule non trattate, B) Le cellule trattate con H 2 O 2. DJ1 è etichettato in verde, i mitocondri in rosso e in blu i nuclei. Colorazione dei neuriti non è evidenziato. <img alt="Figura 4." src="/files/ftp_upload/3452/3452fig4.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 4."> Figura 4. Quantificazione delle tante caratteristiche cellulari ottenute da un HCS. DC) non trattato cellule SH-SY5Y. EH) H 2 O 2 trattati con cellule SH-SY5Y. A, E) Nuclei segmentazione e la definizione del ROI A, B, F) Identificazione e quantificazione dei mitocondri, ROI B, C, G) Identificazione di DJ1, Target canale II, D, G) Identificazione e calcolo della durata media dei neuriti. Le cellule vicino al bordo dell'immagine sono esclusi dall'analisi. Inset immagini sono immagini prima dell'analisi. <imgalt src='"/' files></imgalt> Figura 5. Identificazione di un gene in epistasi con DJ1 (lettere sulle barre corrispondono alle scritte sulle immagini). Immagini dalla A alla D sono cellule SH-SY5Y etichettati con Mitotracker CMXRos (rosso) che è stato utilizzato per la quantificazione della salute delle cellule. <img alt="Figura 6." src="/files/ftp_upload/3452/3452fig6.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 6."> Figura 6. Identificazione di un gene che regola il DJ1 traslocazione (lettere sulle barre corrispondono alle scritte sulle immagini). Immagini dalla A alla D sono cellule SH-SY5Y etichettato per DJ1 (verde), mitocondri (rosso) e nuclei (blu) che sono stati utilizzati per la quantificazione della traslocazione DJ1 ai mitocondri. <img alt="Figura 7." src="/files/ftp_upload/3452/3452fig7.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 7."> Figura 7. Identificazione di un gene coinvolto nella crescita neuronale (lettere sulle barre corrispondono alle scritte sulle immagini). Immagini dalla A alla D sono cellule SH-SY5Y etichettato per la β-III tubulina (verde) e nuclei (blu) che sono stati utilizzati per la quantificazione della lunghezza dei neuriti. <img alt="Figura 8." src="/files/ftp_upload/3452/3452fig8.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 8."> Figura 8. Identificazione di un gene coinvolto nella regolazione della morfologia mitocondriale. Immagine A e C sono immagini composite di SH-SY5Y cellule infettate con shRNA strapazzate o un gene targeting shRNA D rispettivamente. I mitocondri sono colorati in rosso, mentre i nuclei sono colorati in blu. Immagine B e D sono visualizzazioni di SER-Ridge quantificazione.

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</ol>

Non abbiamo nulla da rivelare

Con la diminuzione dei costi di HT / HC sistemi di screening cellulari, unita alla disponibilità di potenti genoma strumenti per modificare la funzione del gene, HT / HC schermi stanno diventando comune nel mondo accademico. L&#39;approccio è già stato applicato con successo a diverse aree di ricerca quali l&#39;identificazione di bersagli farmacologici nel cancro 9, 31-33 e 34-36 lo sviluppo embrionale e ha anche potenzialità di applicazione nel decifrare i meccanismi coinvolti nei disordini neuropsichiatrici 37,38. Tuttavia implementazione di tale sistema richiede un investimento significativo di tempo e fatica con l&#39;ottimizzazione dei processi che spesso prende un minimo di 6 mesi. Tutte le fasi, quali i tempi di tripsinizzazione, velocità di pipettaggio e densità di semina devono essere adeguati, per assicurare che le cellule sono sane e crescono costantemente. Prevenzione della contaminazione batterica è una delle sfide più difficili di fronte cultura automatizzata delle cellule con protocolli di pulizia settimanale in combination con risciacquo costante di tutte le linee di rilevamento liquidi con etanolo al 70% sia necessario per la contaminazione delle culture libero. Sarà inoltre necessario migliorare la robotica in modo che gli strumenti aggiuntivi, come microscopi confocale per una maggiore risoluzione e -80 ° C congelatori per la conservazione composto può essere integrato. Ci sono anche limitazioni che devono essere affrontate per migliorare la sensibilità, la velocità e l&#39;utilità di questo metodo per lo studio delle reti geniche e identificare i geni coinvolti nei meccanismi patogeni molecolari. Per condurre un HT / HC schermo e garantire che dati affidabili raccolti, diversi aspetti devono essere ottimizzati. In primo luogo, l&#39;affidabilità della misura è fondamentale e dipende dalla robustezza e la sensibilità del test. Ad esempio, il test sopra descritti sono adatti per schermi di piccole dimensioni, ma sono difficili da implementare su larga scala del genoma, a causa di fasi di lavorazione il numero richiesto prima di acquisizione delle immagini.Quindi, bisognerebbe costruire linee cellulari stabili che esprimono il gene reporter, che consentirebbe per l&#39;imaging diretto e portare a variazioni diminuito a causa del ridotto numero di fasi di lavorazione. Attualmente, la progettazione di un saggio che descrive in modo accurato e affidabile quantifica un fenotipo di interesse è un serio ostacolo nel processo di selezione HC. Molte schermate sono condotti in cellule di mammifero utilizzando diverse librerie di RNAi, che soffrono di off-target effetti, limitata efficienza silenziamento genico e la copertura del genoma incompleto. Così le biblioteche devono essere effettuate, che sono più specifici, potenti e hanno una migliore copertura. Si sta cercando di creare tale si spera tali sforzi a migliorare la riproducibilità di HT / HC SCRE<html> it hits. Una limitazione di scala molti schermi a grandi cellule base è che sono condotti in cellule di neuroblastoma perché possono essere geneticamente manipolate e colto ad un gran numero con relativa facilità. Tuttavia, la rilevanza delle &#39;hit&#39; identificati in modelli ex vivo di coltura cellulare in funzione in vivo è discutibile, soprattutto perché il cervello è composto di tipi di cellule altamente specializzate che formano una fitta rete e complicato delle connessioni sinaptiche di funzionare come unità altamente integrata. Di conseguenza, è frequente che colpisce identificato utilizzando l&#39;approccio di screening di cui sopra, sono convalidati in schermi secondari utilizzando tecniche aggiuntive e in più modelli fisiologici rilevanti 39. Per migliorare la traduzione di visite identificati durante HCS, i modelli più rappresentativi e sofisticati, come le cellule primarie e cellule staminali differenziate o co-coltura sistemi devono essere sviluppati e adattati per HT / HC approcci. ntent &quot;&gt; Con una combinazione di coltura delle cellule automatizzati e HC di imaging si può rapidamente acquisire nuove conoscenze sul modo in cui i neuroni funzione e determinare quali percorsi sono importanti per lo sviluppo della malattia. Combinando HCS / HTS dati con le informazioni generate da altri approcci &#39;omiche&#39;, sarà poi sarà possibile costruire una visione d&#39;insieme biologia dei sistemi di malattie cerebrali, facilitando così lo sviluppo terapeutico.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td></tr><tr><td> AI.CELLHOST </td><td> HAMILTON </td><td> <a href="http://www.hamiltonrobotics.com/en-uk/applications/cellomics/">http://www.hamiltonrobotics.com/en-uk/applications/cellomics/</a> </td></tr><tr><td> OPTI-MEM </td><td> Invitrogen </td><td> 31985-054 </td></tr><tr><td> Acido Retinoico </td><td> SIGMA-ALDRICH </td><td> R2625 </td></tr><tr><td> OMNITRAY PIASTRE </td><td> NUNC </td><td> 465219 </td></tr><tr><td> 96 piastre di coltura BENE </td><td> GRENIER </td><td> 655086 </td></tr><tr><td> DJ1 N20 ANTICORPI </td><td> SANTA CRUZ </td><td> SC27004 </td></tr><tr><td> BETA-III TUBULINA ANTICORPI </td><td> SIGMA-ALDRICH </td><td> T3952 </td></tr><tr><td> MITOTRACKER CMXROS </td><td> Invitrogen </td><td> M-7512 </td></tr><tr><td> HOECHST-33342 </td><td> Invitrogen </td><td> H1399 </td></tr><tr><td> Perossido di idrogeno </td><td> SIGMA-ALDRICH </td><td> 216763-100ML </td></tr><tr><td> Tripsina </td><td> Invitrogen </td><td> 25050014 </td></tr><tr><td> FOSFATO Dulbecco Buffered Saline </td><td> Invitrogen </td><td> 14190086 </td></tr><tr><td> PROMEGA WIZARD MagneSil TFX </td><td> PROMEGA </td><td> A2380 </td></tr><tr><td> ShRNA CLONI </td><td> APERTO BIOSISTEMI </td><td> <a href="http://www.openbiosystems.com/RNAi/shRNALibraries/TRCLibraryDetails/">http://www.openbiosystems</a>.com / RNAi / shRNALibraries / TRCLibraryDetails / </td></tr><tr><td> CELLOMICS BIOAPPLICATIONS </td><td> THERMO-FISHER </td><td> <a href="http://www.thermo.com/hcs">http://www.thermo.com/hcs</a> </td></tr></tbody></table>

contenuto di screening ad alto contenuto di malattie neurodegenerative

High Content Screening in Neurodegenerative Diseases

L&#39;annotazione funzionale dei genomi, la costruzione di reti molecolari e identificazione di droghe nuovo bersaglio, sono sfide importanti che devono essere affrontati come una questione di grande urgenza 1-4. Molteplici approcci complementari &#39;omiche&#39; hanno fornito indizi utili a capire i fattori di rischio genetici e meccanismi patogenetici alla base di numerose malattie neurodegenerative, ma la maggior parte scoperte richiedono ancora validazione funzionale 5. Per esempio, un recente studio di associazione genome-wide per la malattia di Parkinson (PD), ha individuato loci molti nuovi fattori di rischio per la malattia, ma la variante sottostante causale (s) o meccanismo patogenetico non è noto 6, 7. Come ogni regione associata può contenere diversi geni, la valutazione funzionale di ciascuno dei geni sui fenotipi associati con la malattia, utilizzando le tradizionali tecniche di biologia cellulare sarebbe troppo lungo. Vi è anche una necessità di comprendere le reti molecolari che colleganomutazioni genetiche per i fenotipi che provocano. Si prevede che i fenotipi della malattia sono il risultato di molteplici interazioni che sono state interrotte. La ricostruzione di queste reti con i tradizionali metodi molecolari sarebbe tempo. Inoltre, le previsioni di rete da studi indipendenti di singoli componenti, l&#39;approccio di riduzionismo, probabilmente sottovaluta la complessità della rete 8. Questa sottovalutazione potrebbe, in parte, spiegare il basso tasso di successo di approvazione dei farmaci a causa degli effetti collaterali o tossici. Ottenere una prospettiva di rete di percorsi malattie correlate con HT / HC approcci di screening cellulare e identificare i nodi chiave all&#39;interno di questi percorsi, potrebbe portare alla individuazione di obiettivi che sono più adatti per un intervento terapeutico. High-throughput screening (HTS) è una metodologia ideale per affrontare tali questioni 9-12. ma i metodi tradizionali sono stati uni-dimensionale con tutto il bene saggi cellulari, che utilizzati semplificaSTIC letture per i complessi processi biologici. Essi sono stati in grado di quantificare simultaneamente i fenotipi osservati in molte malattie neurodegenerative, come il deficit di trasporto assonale o alterazioni nelle proprietà morfologia 13, 14. Questo approccio non potrebbe essere utilizzato per indagare la natura dinamica dei processi cellulari o eventi patogeni che si verificano in un sottogruppo di cellule. Per quantificare tali caratteristiche si deve passare al multi-dimensionale fenotipi definito alto contenuto di screening (HCS) 4, 15-17. HCS è la cellula-base quantificazione dei processi contemporaneamente, che fornisce una rappresentazione più dettagliata della risposta cellulare a perturbazioni diverse rispetto a HTS. HCS ha molti vantaggi rispetto HTS 18, 19, ma conducendo una high-throughput (HT)-alto contenuto (HC) schermo nei modelli neuronali è problematico a causa dei costi elevati, variazioni ambientali ed errori umani. Al fine di individuare le risposte cellulari su scala &#39;phenomics&#39;HC utilizzando immagini si deve ridurre le variazioni ed errori, aumentando la sensibilità e riproducibilità. Qui descriviamo un metodo per condurre in modo accurato e affidabile schermi shRNA utilizzando colture di cellule automatizzati 20 e HC di imaging neuronale in modelli cellulari. Ci descrivono come abbiamo utilizzato questa metodologia per identificare modulatori per una particolare proteina, DJ1, che se mutato causa parkinsonismo autosomico recessivo 21. Combinando la versatilità di HC imaging con metodi HT, è possibile quantificare con precisione una pletora di fenotipi. Questo potrebbe essere successivamente utilizzato per far avanzare la nostra comprensione del genoma, i meccanismi coinvolti nella patogenesi della malattia e identificare potenziali bersagli terapeutici.

Noi descriviamo una metodologia che combina coltura automatizzati cella con alto contenuto di imaging per visualizzare e quantificare molteplici processi cellulari e le strutture, in un high-throughput modo. Tali metodi possono aiutare nel ulteriore annotazione funzionale dei genomi, oltre a identificare le reti gene della malattia e potenziali bersagli farmacologici.

Contenuto di screening ad alto contenuto di Malattie Neurodegenerative

L'annotazione funzionale dei genomi, la costruzione di reti molecolari e l'identificazione di nuovi target terapeutici sono sfide cruciali che devono essere...

L'obiettivo generale del seguente esperimento è utilizzare saggi ad alto contenuto informativo in modelli cellulari di malattia per quantificare i percorsi metabolici coinvolti nelle malattie neurodegenerative. A tal fine, un modello cellulare del fenotipo della malattia viene inserito nel sistema automatizzato di coltura cellulare e le cellule vengono incubate fino al raggiungimento del numero cellulare richiesto. Le cellule vengono quindi suddivise, contate e distribuite in piastre a 96 pozzetti contenenti lentivirus che esprimono diverse SH RNA.Dopo sei giorni di differenziazione cellulare, le cellule vengono raccolte dal sistema per l'immunomarcatura e l'analisi mediante imaging ad alto contenuto. Infine, le immagini vengono analizzate utilizzando una serie di algoritmi di analisi per quantificare caratteristiche relative alla salute cellulare, alla crescita neuritica e alla funzione mitocondriale.I risultati vengono inoltre analizzati mediante un test a due vie in Novas per identificare effetti di interazione significativi. Questo metodo può accelerare la risposta a domande fondamentali riguardo la funzione dei geni associati alle malattie e ai percorsi in cui essi operano complessivamente. Ciò porterà quindi a una migliore comprensione dei meccanismi patogenetici coinvolti nelle malattie neurodegenerative.Per iniziare il processo di coltura cellulare, preparare il sistema automatizzato di coltura cellulare per l'inserimento delle piastre per coltura cellulare. Caricare nel sistema materiali monouso come punte per pipetta, piastre per coltura cellulare e piastre per saggio. Verificare inoltre manualmente che nel sistema siano presenti quantità sufficienti di mezzo di coltura cellulare, PBS e tripsina.Piastre da seme due omni con due volte 10 alla sesta cellule per piastra della linea cellulare di neuroblastoma SH-SY5Y. Mantenere le cellule in un mezzo ottimale con 10% di siero fetale bovino (FBS) posizionando le piastre sullo scaffale di ingresso del robot per colture cellulari. Utilizzando l'interfaccia utente grafica (GUI), selezionare il protocollo di coltura cellulare aderente A e regolare i file dei parametri specifici per la linea cellulare aderente in modo che la soglia di confluenza sia impostata al 70%.Tempo totale di semina: due minuti. Istruire il sistema a preparare nuove piastre omni tray con una concentrazione cellulare di due volte 10 alla sesta cellule per piastra. Istruire il sistema a preparare quattro piastre saggio per ogni piastra omni tray, con un totale di 5.000 cellule per pozzetto, e incubare le cellule a 37 gradi Celsius e 5% CO₂.I seguenti passaggi sono previsti in questo protocollo di coltura cellulare per l'adesione. Le piastre vengono incubate e sottoposte a imaging fino al raggiungimento della soglia di confluenza predefinita. Se le cellule non raggiungono la soglia di confluenza entro cinque letture, le piastre vengono rimosse dal sistema.Una volta raggiunta la soglia di confluenza definita dall'utente, le cellule vengono lavate, trattate con tripsina e contate. Un numero predeterminato di cellule viene aggiunto a nuove piastre omni trait e, se il numero di cellule è sufficiente, un numero specificato di piastre per saggi viene trasportato sul deck e un numero definito di cellule viene dispensato in ciascun pozzetto. Infine, le piastre per saggi possono essere immediatamente analizzate mediante il microscopio integrato oppure estratte dal sistema per ulteriori elaborazioni, avviando così la procedura di produzione del virus.Inoculare il mezzo LB contenente ampicillina con stock glicerolati batterici contenenti i vettori HRNA e far crescere durante la notte; il giorno seguente, centrifugare le cellule ed eliminare il sopranatante; estrarre i plasmidi utilizzando il sistema di purificazione di plasmidi da cellule Wizard Magnus. Il DNA plasmidico finale contenente E EIT viene raccolto in piastre a 96 pozzetti. Il lentivirus S-H-R-N-A viene prodotto utilizzando il consorzio RNAi, mediante una produzione lentivirale in piastre a 96 pozzetti; tutti gli esperimenti devono essere condotti in un laboratorio di sicurezza ML due o BSL due LA e tutti i reagenti e materiali di consumo utilizzati devono essere decontaminati con cloro al 30% dopo l'uso.La procedura per la produzione di lentivirus non verrà dimostrata in questo video, ma richiede quattro giorni e consiste nei seguenti passaggi. Innanzitutto, le cellule impacchettanti vengono seminate al giorno zero nel pomeriggio successivo. Al primo giorno, le cellule impacchettanti vengono trasfettate con tre plasmidi di lentivirus 18 ore dopo la trasfezione.Al secondo giorno, il mezzo viene sostituito con un mezzo fresco ad alto contenuto di BSA o di siero. Dopo 24 ore dal cambio del mezzo. Al terzo giorno, il virus viene raccolto e il mezzo viene nuovamente sostituito con un mezzo fresco ad alto contenuto di BSA o di siero.Infine, 24 ore dopo il primo prelievo del virus, al quarto giorno, il virus viene prelevato nuovamente e le cellule impacchettanti vengono scartate per calcolare la molteplicità di infezione (MOI) del lentivirus. Trasduci le cellule SHSY5Y con diluizioni seriali del virus, incuba le cellule a 37 gradi Celsius e, 72 ore dopo la trasduzione, visualizza l'espressione di GFP al microscopio e determina la percentuale di cellule positive a GFP. Piazza il lentivirus S-H-R-N-A in piastre per saggi con un MOI di tre. Dopo aver seminato il lentivirus SHRNA nelle piastre per saggi, carica le piastre nel sistema automatizzato di coltura cellulare per la trasduzione lentivirale.Dopo 24 ore, il mezzo sui piatti del saggio verrà sostituito con mezzo ottimale contenente FBS allo 0,5% e acido retinoico a 0,1 micromolare. Per avviare il processo di differenziazione, proseguire l'incubazione dei piatti del saggio nel mezzo di differenziazione per cinque giorni; per garantire un silenziamento massimo dell'espressione del gene bersaglio al giorno cinque, aggiungere H2O a metà dei piatti del saggio per 24 ore al fine di stimolare la traslocazione della proteina DJ1 ai mitocondri al giorno sei. Aggiungere MIT tracker alle cellule a una concentrazione finale di 200 nanomolari per pozzetto e incubare a 37 gradi Celsius per 30 minuti.Dopo questa fase, le piastre possono essere trasportate verso un sistema di imaging ad alto contenuto o HC per l'acquisizione delle immagini. In alternativa, le piastre possono essere estratte dal sistema per ulteriori lavorazioni, come la colorazione immunoistochimica. Per l'imaging ad alto contenuto, verranno acquisite in totale 30 campi per pozzetto utilizzando l'obiettivo 20x: DJ uno con il set di filtri fitzy, mitocondri con il set di filtri trixy, beta tre tubulina con il set di filtri S cinque e nuclei con il set di filtri UV.Questo è un esempio di immagini composite di cellule acquisite mediante imaging ad alto contenuto. Nella figura, tre cellule non trattate sono mostrate nel pannello A e cellule trattate con H2O2 sono mostrate nel pannello B. DJ1 è marcato in verde, le mitocondri in rosso e i nuclei in blu. Per determinare il coefficiente medio di sovrapposizione tra DJ1 e i mitocondri, analizzare le immagini utilizzando l'applicazione bio per la codistribuzione.Definire le regioni di interesse. ROI come segue: ROIA nucleo figura quattro A ed E e ROIB mitocondri, figura quattro B e F; escludere ROIA da ROIB. Per garantire l'analisi esclusiva del citoplasma, definire i mitocondri come regione bersaglio uno e DJ uno come regione bersaglio due, figura quattro C e G. Analizzare le immagini utilizzando l'applicazione bio di analisi compartimentale per determinare l'intensità media del segnale di MIT tracker all'interno dei mitocondri.Figura quattro B e F per tracciare le lunghezze medie dei neuriti mediante la colorazione per la beta tre tubulina. Analizzare le immagini utilizzando l'applicazione bio per il profilo neuronale, figura quattro D e H, con le piastre per immagini successive sull'Opera LX. Lettore confocale automatizzato.Visualizzare i mitocondri con il laser a 561 nanometri e i nuclei con l'immagine ad eccitazione UV. Un totale di 30 campi per pozzetto utilizzando l'obiettivo da 60x con immersione in acqua. Analizzare infine le immagini utilizzando l'algoritmo basato sulle caratteristiche testurali del contorno dei punti o SER.Il filtro a cresta del SER trasmette l'intensità in pixel formando schemi simili a creste. Maggiore è la frammentazione dei mitocondri, più elevato sarà il punteggio della cresta del SER. In questo video, sono stati utilizzati saggi ad alto contenuto o saggi HC per identificare modulatori della proteina DJ-1A, la cui perdita provoca un parkinsonismo autosomico recessivo.Questo primo risultato rappresentativo illustra un'interazione epistatica con DJ uno. L'istogramma a sinistra mostra unità di fluorescenza normalizzate e le immagini a destra mostrano cellule SHSY cinque Y marcate in rosso con mito tracker per la quantificazione della vitalità cellulare.È stato osservato che l'abbattimento di DJ one in cellule esposte alla tossina ha determinato una maggiore perdita di vitalità cellulare rispetto alle cellule infettate con lentivirus scramble. L'abbattimento del gene bersaglio A ha avuto un effetto simile a quello osservato nelle cellule con abbattimento di DJ one. Tuttavia, l'abbattimento sia di DJ one che del gene bersaglio A ha causato una perdita significativamente maggiore di vitalità cellulare rispetto alla perdita di ciascun gene singolarmente, il che suggerisce un'interazione epistatica tra DJ one e il gene bersaglio A. Questo prossimo esempio riguarda un gene che regola la traslocazione di DJ one.L'istogramma mostra il coefficiente di sovrapposizione normalizzato tra DJ1 e i mitocondri, che riflette la traslocazione di DJ1 dal citoplasma ai mitocondri. I pannelli da A a D sono immagini di cellule SHSY5Y marcate in verde per DJ1, in rosso per i mitocondri e in blu per i nuclei. Quando le cellule sono esposte a una tossina, DJ1 si trasloca dal citoplasma ai mitocondri, fenomeno quantificato da un coefficiente di sovrapposizione più elevato tra DJ1 e i mitocondri.In cellule in cui il gene bersaglio B &egrave; stato silenziato, meno DJ uno si trasloca nei mitocondri quando le cellule sono esposte alla tossina; ci&ograve; suggerisce che il gene bersaglio B &egrave; coinvolto nel trasporto di DJ uno verso i mitocondri. Qui &egrave; mostrato un esempio di un gene coinvolto nella crescita assonale. Le lunghezze normalizzate dei neuriti sono riportate nel grafico a barre, mentre le cellule utilizzate per la quantificazione delle lunghezze dei neuriti sono mostrate nelle immagini con la beta tre tubulina in verde e i nuclei in blu.L'abbattimento del gene bersaglio C in cellule SHSY cinque Y di tipo selvaggio determina un aumento significativo della lunghezza dei neuriti rispetto alle cellule infettate con lentivirus che esprimono SH RNA mescolato. Questo effetto si perde nelle cellule incubate con la tossina. Infine, questi risultati mostrano un esempio di gene coinvolto nella morfologia mitocondriale.I valori medi di segmentazione delle creste della membrana SER mitocondriale per cellule SHSY five Y infettate con HRNA randomizzato o A-S-H-R-N-A mirato al gene D sono mostrati nel grafico. L'immagine A e l'immagine C sono immagini composite di cellule SHSY five Y infettate rispettivamente con HRNA randomizzato o A-H-R-N-A mirato al gene D. I mitocondri sono colorati in rosso, mentre i nuclei sono colorati in blu.Le immagini B e D sono visualizzazioni della quantificazione delle creste del RER osservata in questo caso. L'infezione di cellule SHSY5Y di tipo selvaggio con HRNA mirato al gene D determina un aumento del valore di segmentazione delle creste mitocondriali del RER rispetto alle cellule infettate con lentivirus scrambled. Questo approccio può aprire la strada ai ricercatori nel campo della neurodegenerazione per esplorare e annotare tempestivamente i percorsi coinvolti nella patogenesi delle malattie.Questo porterà quindi a individuare bersagli migliori per lo sviluppo di terapie.

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Questo articolo descrive un nuovo protocollo e reagenti impostare progettato per la misura sensibile degli effetti neurotossici di composti e trattamenti sulla co-culture di neuroni e astrociti utilizzando l'analisi ad alto contenuto. Risultati dimostrano che l'analisi ad alto contenuto rappresenta una tecnologia entusiasmante romanzo per la valutazione neurotossicità.

Un neuronale e astrociti Co-Cultura Assay per l&#39;analisi dei contenuti elevati di neurotossicità

Fonte: Bétemps, D., et al.,  Rilevamento della α-sinucleina associata alla malattia mediante ELISA potenziato nel cervello di topi transgenici che sovraesprimono la α-sinucleina umana mutata A53T. J. Vis. Exp. (2015). Questo video mostra la procedura per rilevare la proteina α-sinucleina associata alla malattia neurodegenerativa nel tessuto cerebrale di topi transgenici utilizzando ELISA. Le fasi includono l'omogeneizzazione dei tessuti, la centrifugazione e il rilevamento ELISA della proteina...

Rilevamento della proteina associata alla malattia neurodegenerativa α-sinucleina mediante ELISA

Vi presentiamo un metodo di screening rapido e poco costoso per identificare regolatori trascrizionali utilizzando high-throughput transfezioni robotici e un dual-bagliore saggio di luciferasi in casa. Questo protocollo genera rapidamente dati scalo side-by-side funzionali per migliaia di geni ed è facilmente modificabile per indirizzare qualsiasi gene di interesse.

High-throughput screening funzionale utilizzando una casalinga Dual-glow Luciferase Assay

Descriviamo un alto rendimento, multiplex, e il dosaggio mirato liquido cerebrospinale proteomica (CSF) sviluppata con un potenziale per la traduzione clinica. Il test può quantificare potenziali marcatori e fattori di rischio per la neurodegenerazione, come le varianti apolipoproteina E (E2, E3 e E4), e misurarne l'espressione allelica.

A High Throughput, Multiplexer e mirata Proteomica CSF test per quantificare neurodegenerative Biomarkers e apolipoproteina E Isoforme Stato

Qui descritto è un approccio scenico di screening comportamentale che può essere utilizzato per la ricerca di composti che presentano l'efficacia in vivo sui comportamenti motori cognitivi e funzionali nei modelli di topi transgenici di β-amiloidosi e tauopatia. Questi metodi sono ottimizzati per schermare composti per attività in attività di memoria a breve termine e di lavoro.

Valutazione di alternanza spontanea, riconoscimento novello di oggetti e attacco degli arti nei modelli di topo transgenico Modelli di neuropathologia di Amiloide-β e Tau

Descriviamo un metodo per quantificare l'aggregazione delle proteine misfolded. I nostri dettagli di protocollo lentivirali indotto generazione linea cellulare stabile, imaging confocale automatizzata e l'analisi di immagine di aggregati proteici. Come un'applicazione illustrativa, abbiamo studiato l'effetto di piccole molecole nel promuovere l'aggregazione di SOD1 nel tempo - e dose-dipendente.

Sviluppo di analisi per la quantificazione alto contenuto di formazione aggregata di Sod1 mutante della proteina in cellule viventi

Questa metodologia produce alberi delle decisioni che prendono di mira gruppi di popolazione più inclini a soffrire di lievi disturbi cognitivi e sono utili per uno screening selettivo della malattia conveniente.

Un approccio di Machine Learning alla progettazione di uno screening selettivo efficiente di un lieve danno cognitivo

Vi presentiamo un protocollo utilizzando un approccio genetico in avanti allo screening per i mutanti che mostrano neurodegenerazione in Drosophila melanogaster. Incorpora un saggio di arrampicata, analisi istologica, mappatura genica e sequenziamento del DNA per identificare in ultima analisi nuovi geni legati al processo di neuroprotezione.

In Vivo Avanti Schermo Genetico per Identificare Nuovi Geni Neuroprotettivi in Drosophila melanogaster

Descriviamo la produzione di colture miste di astrociti e cellule precursori di oligodendrociti derivate da cellule staminali neurali fetali o adulte che si differenziano in oligodendrociti maturi e la modellazione in vitro di stimoli nocivi. L'accoppiamento con una tecnica di screening ad alto contenuto basata su cellule costruisce un sistema di screening dei farmaci affidabile e robusto.

Selezione ad alto contenuto di differenziazione e analisi della maturazione di colture cellulari precursori di oligodendrociti derivati da cellule staminali neurali fetali e adulte

I fibroblasti di pazienti portatori di mutazioni nel Parkinson geni che causano malattie rappresentano un facile...

L&#39;uso di fibroblasti umani primari per il monitoraggio fenotipi mitocondriali nel campo della malattia di Parkinson

Scopri come utilizzare saggi ad alto contenuto per analizzare vie cellulari nelle malattie neurodegenerative. Questo metodo combina coltura automatizzata e imaging per studiare geni coinvolti nella patogenesi.

Contenuto di screening ad alto contenuto di Malattie Neurodegenerative

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