Contenuto di screening ad alto contenuto di Malattie Neurodegenerative

L'obiettivo generale del seguente esperimento è quello di utilizzare saggi ad alto contenuto in modelli di malattia cellulare per quantificare i percorsi influenzati nelle malattie neurodegenerative. Per raggiungere questo obiettivo, un modello cellulare del fenotipo della malattia viene inserito nel sistema di coltura cellulare automatizzato e le cellule vengono incubate fino a raggiungere il numero di cellule richiesto. Le cellule vengono quindi divise, contate e dispensate in piastre a 96 pozzetti contenenti lentivirus che esprimono vari RNA SH.

Dopo sei giorni di differenziazione cellulare, le cellule vengono emesse dal sistema per la colorazione immunologica e l'imaging ad alto contenuto. Infine, le immagini vengono analizzate utilizzando una varietà di algoritmi di analisi per quantificare le caratteristiche relative alla salute delle cellule. Crescita neuronale e funzione mitocondriale.

I risultati vengono anche analizzati a due vie in Novas per identificare effetti di interazione significativi. Questo metodo può accelerare la risposta a domande chiave sulla funzione dei geni correlati alla malattia e sui percorsi all'interno dei quali funzionano in generale. Questo porterà poi a una migliore comprensione dei meccanismi patogenetici coinvolti nelle malattie neurodegenerative.

Per iniziare il processo di coltura cellulare, preparare il sistema di coltura cellulare automatizzato per l'inserimento delle piastre di coltura cellulare. Caricare nel sistema materiali di consumo come puntali per pipette, piastre per colture cellulari e piastre per saggi. Assicurarsi inoltre che nel sistema sia presente manualmente una quantità sufficiente di terreno di coltura cellulare, PBS e tripsina.

Seminare due piastre omni tray con due volte 10 alle sei cellule per piastra della linea cellulare di neuroblastoma SH SY five Y. Mantenere le cellule in terreni ottimali con il 10% di siero fetale bovino FBS Posizionare le piastre sullo scaffale di input nel robot di coltura cellulare. Utilizzando l'interfaccia utente grafica o l'interfaccia grafica, selezionare il protocollo di coltura cellulare aderente A e regolare i file di parametri specifici di una linea cellulare aderente in modo che la soglia di confluenza sia impostata al 70%.

Tempo di totale di sterilizzazione a due minuti. Istruire il sistema a preparare nuove piastre omni tray con un numero di celle di seduta pari a due volte 10 per la sesta cella per piastra. Istruire il sistema a preparare le piastre di analisi per piastra omni tray con un totale di 5.000 cellule per pozzetto, incubare le cellule a 37 gradi Celsius e 5% di CO2.

I seguenti passaggi sono coinvolti in questo protocollo di coltura cellulare di aderenza. Le piastre vengono incubate e sottoposte a imaging fino a quando le cellule non raggiungono la soglia di confluenza predefinita. Se le celle non raggiungono la soglia di confluenza entro cinque letture, le piastre vengono rimosse dal sistema.

Al raggiungimento della soglia di confluenza definita dall'utente, le celle vengono lavate, triplizzate, inizzate e contate. Un numero predefinito di cellule viene aggiunto alle nuove piastre omni trait e, se il numero di cellule è sufficiente, un numero specificato di piastre di saggio viene trasportato al ponte e un numero definito di cellule dispensato in ciascun pozzetto. Infine, le piastre di analisi possono essere visualizzate direttamente utilizzando il microscopio integrato o emesse dal sistema per un'ulteriore elaborazione per iniziare la procedura di produzione del virus.

Inoculare il terreno LB contenente ampicillina con scorte di glicerolo batterico contenenti i vettori HRNA che crescono durante la notte del giorno successivo, centrifugare le cellule e rimuovere i plasmidi dell'estratto surnatante utilizzando il sistema di purificazione del plasmide cellulare Magnus. L'E EIT finale contenente DNA plasmatico viene raccolto in piastre a 96 pozzetti. Il lentivirus S-H-R-N-A è prodotto utilizzando il consorzio RNAi, una produzione lentivirale in piastre a 96 pozzetti, tutti gli esperimenti devono essere condotti in un laboratorio di sicurezza ML due o BSL due LA e tutti i reagenti e i materiali di consumo utilizzati devono essere decontaminati con il 30% di cloro dopo l'uso.

La procedura per la produzione di lentivirus non sarà dimostrata in questo video, ma richiede quattro giorni e consiste nei seguenti passaggi. Innanzitutto, le celle di imballaggio vengono seminate il giorno zero del pomeriggio successivo. Il primo giorno, le cellule di confezionamento vengono trasfettate con tre plasmidi di lentivirus 18 ore dopo la trasfezione.

Il secondo giorno, il terreno viene sostituito con un nuovo acido ad alto contenuto di BSA o ad alto contenuto di siero. 24 ore dopo il cambio del terreno. Il terzo giorno, il virus viene raccolto e il terreno viene nuovamente sostituito con un nuovo terreno ad alto contenuto di BSA o ad alto contenuto di siero.

Infine, 24 ore dopo il primo prelievo del virus, il quarto giorno, il virus viene nuovamente raccolto e le cellule di imballaggio vengono scartate per calcolare la molteplicità dell'infezione o MOI del lentivirus trasduco, SHSY cinque cellule Y con diluizioni seriali del virus incubano le cellule a 37 gradi Celsius, 72 ore dopo la trasduzione. Visualizzare l'espressione della GFP al microscopio e determinare la percentuale di cellule GFP positive per la piastra S-H-R-N-A lentivirus su piastre di saggio con un MOI di tre. Dopo aver placcato il lentivirus SH RNA sulle piastre del saggio, caricare le piastre nel sistema di coltura cellulare automatizzato per la trasduzione lentivirale.

Dopo 24 ore, il terreno sulle piastre di analisi verrà sostituito in modo ottimale contenente lo 0,5% di FBS e lo 0,1 di acido retinoico micromolare. Per iniziare il processo di differenziazione, continuare l'incubazione delle piastre di saggio nei mezzi di differenziazione per cinque giorni per garantire il massimo abbattimento dell'espressione genica bersaglio il quinto giorno, aggiungere H2O da due a metà delle piastre di saggio per 24 ore per stimolare la traslocazione della proteina DJ one nei mitocondri il sesto giorno. Aggiungere il tracker MIT alle cellule a una concentrazione finale di 200 nano molari per pozzetto e incubare a 37 gradi Celsius per 30 minuti.

Successivamente, le lastre possono essere trasportate all'imager ad alto contenuto o HC per l'imaging. In alternativa, le piastre possono essere esportate dal sistema per ulteriori elaborazioni, come la colorazione immunologica. Per l'imaging ad alto contenuto, un totale di 30 campi per pozzetto saranno ripresi utilizzando l'obiettivo 20 x visualizzato DJ uno con il set di filtri fitzy mitocondri con il set di filtri trixy beta tre tubulina con il set di filtri S five e nuclei con il set di filtri UV.

Questo è un esempio di immagini composite di cellule acquisite mediante imaging ad alto contenuto. Figura tre cellule non trattate sono mostrate nel pannello A e le cellule trattate con H2O due sono mostrate nel pannello B.DJ una è etichettata in verde, i mitocondri in rosso e i nuclei in blu. Per determinare il coefficiente medio di sovrapposizione tra DJ one e i mitocondri, analizzare le immagini utilizzando l'applicazione bio di colocalizzazione.

Definire le regioni di interesse. ROI come segue, nucleo ROIA figura quattro A ed E e mitocondri ROIB, figura quattro B e F escludono ROIA da ROIB. Per garantire l'analisi del solo citoplasma, definire i mitocondri come regione bersaglio uno e DJ uno come regione bersaglio due, figura quattro C e G.Analizzare le immagini utilizzando l'applicazione bio di analisi compartimentale per determinare l'intensità media del segnale del tracker MIT all'interno dei mitocondri.

Figura quattro B e F per tracciare le lunghezze medie dei neuriti dalla colorazione della tubulina beta tre. Analizzare le immagini utilizzando l'applicazione bio di profilazione neuronale figura quattro D e H successive lastre di immagine utilizzando l'opera lx. Lettore confocale automatizzato.

Visualizza i mitocondri con il laser a 561 nanometri e i nuclei con l'immagine di eccitazione UV. Un totale di 30 campi per pozzetto utilizzando la lente dell'obiettivo 60x con immersione in acqua. Infine, analizza le immagini utilizzando l'algoritmo spot edge ridge o SER texture features.

Il filtro cresta SER trasmette l'intensità in pixel formando motivi simili a creste. Più i mitocondri sono frammentati, più alto è il punteggio della cresta SER. In questo video, sono stati utilizzati saggi ad alto contenuto o HC per identificare modulatori per la proteina DJ one A la cui perdita causa parkinsonismo autosomico recessivo.

Questo primo risultato rappresentativo illustra un'interazione epistatica con DJ one. Il grafico a barre a sinistra mostra le unità di fluorescenza normalizzate e le immagini a destra mostrano. SHSY cinque cellule Y marcate in rosso con mito tracker per la quantificazione della vitalità cellulare.

È stato osservato che il knockdown di DJ one nelle cellule esposte alla tossina ha comportato una maggiore perdita di vitalità cellulare rispetto alle cellule infettate da lentivirus strapazzato. Il knockdown del gene bersaglio A ha avuto un effetto simile a quello osservato nelle cellule con un knockdown DJ one. Tuttavia, il knockdown sia di DJ 1 che del gene bersaglio A ha provocato una perdita significativamente maggiore di vitalità cellulare rispetto alla perdita di entrambi i geni da soli, il che suggerisce un'interazione epistatica tra DJ uno e il gene bersaglio A.

Il grafico a barre mostra il coefficiente di sovrapposizione normalizzato tra DJ uno e i mitocondri, che riflette la traslocazione di DJ uno dal citoplasma ai mitocondri. I pannelli da A a D sono immagini di cinque cellule Y SHSY etichettate in verde per DJ uno, rosso per i mitocondri e blu per i nuclei. Quando le cellule sono esposte a una tossina DJ, una trasloca dal citoplasma ai mitocondri, che è quantificata da un coefficiente di sovrapposizione più elevato tra DJ uno e i mitocondri.

Nelle cellule in cui il gene bersaglio B è stato silenziato meno DJ uno trasloca nei mitocondri quando le cellule sono esposte alla tossina, questo suggerisce che il gene bersaglio B è coinvolto nel trasporto di DJ uno ai mitocondri. Un esempio di un gene coinvolto nella crescita neuronale è mostrato qui. Le lunghezze normalizzate dei neuriti sono mostrate nel grafico a barre e le cellule utilizzate per la quantificazione delle lunghezze dei neuriti sono mostrate nelle immagini con la tubulina beta tre in verde e i nuclei in blu.

Il knockdown del gene bersaglio C nelle cellule SHSY five Y wild type determina un aumento significativo della lunghezza dei neuriti rispetto alle cellule infettate da lentivirus che esprimono SH RNA criptato. Questo effetto si perde nelle cellule incubate con tossina. Infine, questi risultati mostrano un esempio di un gene coinvolto nella morfologia mitocondriale.

Nel grafico sono mostrati i valori medi di segmentazione della cresta SER mitocondriale per le cinque cellule Y SHSY infettate con HRNA strapazzato o il gene D che ha come bersaglio A-S-H-R-N-A. L'immagine A e l'immagine C sono immagini composite di cinque cellule Y SHSY infettate rispettivamente con HRNA criptato o A-H-R-N-A che hanno come bersaglio il gene D. I mitocondri sono colorati in rosso mentre i nuclei sono colorati in blu.

Le immagini B e D sono visualizzazioni della quantificazione della cresta SER come osservato qui. L'infezione di cinque cellule Y SHSY wild type con HRNA che ha come bersaglio il gene D determina un aumento del valore di segmentazione della cresta SER mitocondriale rispetto alle cellule infettate da lentivirus strapazzato. Questo approccio può aprire la strada ai ricercatori nel campo della neurodegenerazione per esplorare e annotare i percorsi coinvolti nella patogenesi della malattia in modo tempestivo.

Ciò porterà quindi a migliori obiettivi per lo sviluppo terapeutico.