Contenuto di screening ad alto contenuto di Malattie Neurodegenerative

L'obiettivo generale del seguente esperimento è utilizzare saggi ad alto contenuto informativo in modelli cellulari di malattia per quantificare i percorsi metabolici coinvolti nelle malattie neurodegenerative. A tal fine, un modello cellulare del fenotipo della malattia viene inserito nel sistema automatizzato di coltura cellulare, e le cellule vengono incubate fino al raggiungimento del numero cellulare richiesto. Le cellule vengono quindi suddivise, contate e distribuite in piastre a 96 pozzetti contenenti lentivirus che esprimono diverse SH RNA.

Dopo sei giorni di differenziazione cellulare, le cellule vengono raccolte dal sistema per la colorazione immunoistochimica e l'analisi mediante imaging ad alto contenuto. Infine, le immagini vengono analizzate utilizzando una serie di algoritmi di analisi per quantificare caratteristiche relative alla salute cellulare, alla crescita neuritica e alla funzione mitocondriale.

I risultati vengono inoltre analizzati mediante un test a due vie in Novas per identificare effetti di interazione significativi. Questo metodo può accelerare la risposta a domande fondamentali riguardo alla funzione dei geni associati alle malattie e ai percorsi in cui essi operano complessivamente. Ciò porterà quindi a una migliore comprensione dei meccanismi patogenetici coinvolti nelle malattie neurodegenerative.

Per iniziare il processo di coltura cellulare, preparare il sistema automatizzato di coltura cellulare per l'inserimento delle piastre per coltura cellulare. Caricare nel sistema materiali monouso come punte per pipetta, piastre per coltura cellulare e piastre per saggio. Assicurarsi inoltre manualmente che nel sistema siano presenti quantità sufficienti di mezzo di coltura cellulare, PBS e tripsina.

Piastre da seme due omni con due volte 10 alla sesta cellule per piastra della linea cellulare di neuroblastoma SH-SY5Y. Mantenere le cellule in mezzo ottimale con 10% di siero fetale bovino (FBS) posizionando le piastre sullo scaffale di ingresso del robot per colture cellulari. Utilizzando l'interfaccia utente grafica (GUI), selezionare il protocollo di coltura cellulare aderente A e regolare i file di parametri specifici per la linea cellulare aderente in modo che la soglia di confluenza sia impostata al 70%.

Tempo totale di piastramento: due minuti. Istruire il sistema a preparare nuove piastre omni tray con una concentrazione cellulare di due volte 10 alla sesta cellule per piastra. Istruire il sistema a preparare quattro piastre saggio per ogni piastra omni tray, con un totale di 5.000 cellule per pozzetto, e incubare le cellule a 37 gradi Celsius e 5%CO2.

I seguenti passaggi sono previsti in questo protocollo di coltura cellulare per l'adesione. Le piastre vengono incubate e sottoposte a imaging fino al raggiungimento delle cellule della soglia di confluenza predefinita. Se le cellule non raggiungono la soglia di confluenza entro cinque letture, le piastre vengono rimosse dal sistema.

Raggiunta la soglia di confluenza definita dall'utente, le cellule vengono lavate, trattate con tripsina e contate. Un numero predeterminato di cellule viene aggiunto a nuove piastre omni trait e, se il numero di cellule è sufficiente, un numero specifico di piastre per saggi viene trasportato sul deck e un numero definito di cellule viene dispensato in ciascun pozzetto. Infine, le piastre per saggi possono essere immediatamente analizzate mediante il microscopio integrato oppure estratte dal sistema per ulteriori lavorazioni, avviando così la procedura di produzione del virus.

Inoculare il mezzo LB contenente ampicillina con stock glicerolo batterici contenenti i vettori HRNA e far crescere durante la notte; il giorno seguente, centrifugare le cellule ed eliminare il sopernatante. Estrarre i plasmidi utilizzando il sistema di purificazione plasmidica Wizard Magnus. Il DNA plasmidico finale contenente E EIT viene raccolto in piastre a 96 pozzetti. Il lentivirus S-H-R-N-A viene prodotto utilizzando il consorzio RNAi, una produzione lentivirale in piastre a 96 pozzetti; tutti gli esperimenti devono essere condotti in un laboratorio di sicurezza di livello ML2 o BSL2 e tutti i reagenti e i materiali monouso impiegati devono essere decontaminati con cloro al 30% dopo l'uso.

La procedura per la produzione di lentivirus non verrà dimostrata in questo video, ma richiede quattro giorni e consiste nei seguenti passaggi. Innanzitutto, le cellule impacchettanti vengono seminate al giorno zero nel pomeriggio successivo. Al primo giorno, le cellule impacchettanti vengono trasfettate con tre plasmidi di lentivirus 18 ore dopo la trasfezione.

Al secondo giorno, il mezzo viene sostituito con un mezzo fresco ad alto contenuto di BSA o di siero. Dopo 24 ore dal cambio del mezzo. Al terzo giorno, il virus viene raccolto e il mezzo viene nuovamente sostituito con un mezzo fresco ad alto contenuto di BSA o di siero.

Infine, 24 ore dopo il primo prelievo del virus, al quarto giorno, il virus viene prelevato nuovamente e le cellule di confezionamento vengono scartate per calcolare la molteplicità di infezione o MOI del lentivirus. Trasduci le cellule SHSY5Y con diluizioni seriali del virus e incuba le cellule a 37 gradi Celsius. A 72 ore dalla trasduzione, visualizza l'espressione di GFP al microscopio e determina la percentuale di cellule positive a GFP. Piazza il lentivirus SHRNA su piastre per saggi con un MOI di tre. Dopo aver seminato il lentivirus SHRNA sulle piastre per saggi, carica le piastre nel sistema automatizzato di coltura cellulare per la trasduzione lentivirale.

Dopo 24 ore, il mezzo sui piatti del saggio verrà sostituito con mezzo ottimale contenente 0,5% di FBS e 0,1 micromolare di acido retinoico. Per avviare il processo di differenziazione, proseguire l'incubazione dei piatti del saggio nel mezzo di differenziazione per cinque giorni; per garantire un silenziamento massimo dell'espressione del gene bersaglio al giorno cinque, aggiungere H2O a metà dei piatti del saggio per 24 ore al fine di stimolare la traslocazione della proteina DJ1 ai mitocondri al giorno sei. Aggiungere MIT tracker alle cellule a una concentrazione finale di 200 nanomolari per pozzetto e incubare a 37 gradi Celsius per 30 minuti.

A questo punto, le piastre possono essere trasportate verso lo strumento ad alta risoluzione o imager HC per l'acquisizione delle immagini. In alternativa, le piastre possono essere estratte dal sistema per ulteriori lavorazioni, come la colorazione immunoistochimica. Per l'imaging ad alta risoluzione, verranno acquisite complessivamente 30 campi per pozzetto utilizzando l'obiettivo 20x: DJ uno visualizzato con il set filtro fitzy, le mitocondri con il set filtro trixy, la beta tre tubulina con il set filtro S cinque e i nuclei con il set filtro UV.

Questo è un esempio di immagini composite di cellule acquisite mediante imaging ad alto contenuto. Nella figura, tre cellule non trattate sono mostrate nel pannello A e cellule trattate con H2O2 sono mostrate nel pannello B. DJ1 è marcato in verde, le mitocondri in rosso e i nuclei in blu. Per determinare il coefficiente medio di sovrapposizione tra DJ1 e i mitocondri, analizzare le immagini utilizzando l'applicazione bio per la codistribuzione.

Definire le regioni di interesse. ROI come segue: ROIA nucleo figura quattro A ed E e ROIB mitocondri, figura quattro B e F; escludere ROIA da ROIB. Per garantire l'analisi esclusiva del citoplasma, definire i mitocondri come regione bersaglio uno e DJ uno come regione bersaglio due, figura quattro C e G. Analizzare le immagini utilizzando l'applicazione bio di analisi compartimentale com per determinare l'intensità media del segnale di MIT tracker all'interno dei mitocondri.

Figura quattro B e F per tracciare le lunghezze medie dei neuriti mediante la colorazione per beta tre tubulina. Analizzare le immagini utilizzando l'applicazione bio per il profilo neuronale, figura quattro D e H, con le piastre per immagini successive sull'Opera LX. Lettore confocale automatizzato.

Visualizzare i mitocondri con il laser a 561 nanometri e i nuclei con l'immagine ad eccitazione UV. Un totale di 30 campi per pozzetto utilizzando l'obiettivo da 60x con immersione in acqua. Analizzare infine le immagini utilizzando l'algoritmo basato sulle caratteristiche testurali del contorno dei punti o della cresta (SER).

Il filtro a cresta SER trasmette l'intensità in pixel che formano schemi simili a creste. Maggiore è la frammentazione dei mitocondri, più elevato sarà il punteggio del filtro a cresta SER. In questo video, sono stati utilizzati saggi ad alto rendimento o saggi HC per identificare modulatori della proteina DJ1A, la cui perdita causa un parkinsonismo autosomico recessivo.

Questo primo risultato rappresentativo illustra un'interazione epistatica con DJ uno. L'istogramma a sinistra mostra unità di fluorescenza normalizzate e le immagini a destra mostrano cellule SHSY cinque Y marcate in rosso con mito tracker per la quantificazione della vitalità cellulare.

È stato osservato che l'abbattimento di DJ one in cellule esposte alla tossina ha determinato una maggiore perdita di vitalità cellulare rispetto alle cellule infettate con lentivirus scramble. L'abbattimento del gene bersaglio A ha avuto un effetto simile a quello osservato nelle cellule con abbattimento di DJ one. Tuttavia, l'abbattimento sia di DJ one che del gene bersaglio A ha causato una perdita significativamente maggiore di vitalità cellulare rispetto alla perdita di ciascun gene singolarmente, il che suggerisce un'interazione epistatica tra DJ one e il gene bersaglio A. Questo prossimo esempio riguarda un gene che regola la traslocazione di DJ one.

L'istogramma mostra il coefficiente di sovrapposizione normalizzato tra DJ1 e i mitocondri, che riflette la traslocazione di DJ1 dal citoplasma ai mitocondri. I pannelli da A a D sono immagini di cellule SHSY5Y marcate in verde per DJ1, in rosso per i mitocondri e in blu per i nuclei. Quando le cellule sono esposte a una tossina, DJ1 si trasloca dal citoplasma ai mitocondri, fenomeno quantificato da un coefficiente di sovrapposizione più elevato tra DJ1 e i mitocondri.

In cellule in cui il gene bersaglio B è stato silenziato, meno DJ uno si trasloca nei mitocondri quando le cellule sono esposte alla tossina; ciò suggerisce che il gene bersaglio B è coinvolto nel trasporto di DJ uno verso i mitocondri. Qui è mostrato un esempio di un gene coinvolto nella crescita assonica. Le lunghezze normalizzate dei neuriti sono riportate nel grafico a barre, mentre le cellule utilizzate per la quantificazione delle lunghezze dei neuriti sono mostrate nelle immagini con la beta tre tubulina in verde e i nuclei in blu.

L'abbattimento del gene bersaglio C in cellule SHSY5Y di tipo selvaggio determina un aumento significativo della lunghezza dei neuriti rispetto alle cellule infettate con lentivirus che esprime SH RNA mescolato. Questo effetto si perde nelle cellule incubate con la tossina. Infine, questi risultati mostrano un esempio di gene coinvolto nella morfologia mitocondriale.

I valori medi di segmentazione delle creste del RER mitocondiale per cellule SHSY-5Y infettate con HRNA randomizzato o A-S-H-R-N-A che bersaglia il gene D sono mostrati nel grafico. L'immagine A e l'immagine C sono immagini composite di cellule SHSY-5Y infettate rispettivamente con HRNA randomizzato o A-H-R-N-A che bersaglia il gene D. I mitocondri sono colorati in rosso, mentre i nuclei sono colorati in blu.

Le immagini B e D sono visualizzazioni della quantificazione delle creste del RER osservata in questo caso. L'infezione di cellule SHSY5Y di tipo selvaggio con HRNA mirato al gene D determina un aumento del valore di segmentazione delle creste mitocondriali del RER rispetto alle cellule infettate con lentivirus scrambled. Questo approccio può aprire la strada ai ricercatori nel campo della neurodegenerazione per esplorare e annotare tempestivamente i percorsi coinvolti nella patogenesi delle malattie.

Questo porterà quindi a individuare bersagli migliori per lo sviluppo di terapie.