Di campo elettrico controllato migrazione diretta di cellule progenitrici neurali in ambienti 2D e 3D

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di registrare l'effetto dei campi elettrici applicati sulla migrazione delle cellule progenitrici neurali in colture 2D e modelli 3D ex vivo. Ciò si ottiene isolando ed espandendo prima le cellule progenitrici neurali dei neuroni in vitro. Il secondo passo consiste nel preparare una sospensione a singola cellula di cellule progenitrici neurali.

Successivamente, per la preparazione della coltura 2D, le cellule progenitrici neurali vengono piastrate in camere elettrotattiche progettate su misura. In alternativa, per la preparazione del modello 3D ex vivo, le cellule progenitrici neurali vengono etichettate con ganci 3, 3, 3, 4, 2 e iniettate in un modello organotipico a fette di midollo spinale. Infine, un campo elettrico viene applicato alle elettrocamere e viene eseguita una registrazione time-lapse per mostrare che le cellule progenitrici migrano verso il catodo del campo elettrico sia in ambienti 2D che 3D.

Il vantaggio principale di questa tecnica è che fornisce un nuovo metodo per il monitoraggio in tempo reale della migrazione indotta dal campo elettrico di singole cellule dopo il trapianto in un modello organotipico 3D, molto simile all'ambiente naturale. Questo metodo non solo può fornire l'inserimento nella tecnica elettronica, la migrazione delle cellule neuro entali trapiantate nella fetta del midollo spinale, ma può anche essere applicato ad altri sistemi che come fetta di cervello modellano piccoli. Per iniziare questa procedura, preparare strisce di vetro da 22 per 11 millimetri dividendo l'autoclave da 22 per 22 millimetri.

Il coperchio di spessore numero uno scivola a metà usando una penna diamantata. Successivamente, creare un pozzetto di vetro autoportante di dimensioni interne, 22 per 10 millimetri incollando verticalmente quattro strisce di 22 per 11 millimetri insieme a grasso siliconico ad alto vuoto, lasciare che il pozzo si asciughi completamente e si indurisca durante la notte. Il giorno successivo, attacca 2 strisce di vetro da 22 per 11 millimetri parallele tra loro, lasciando uno spazio di 10 millimetri alla base di un piatto di coltura da 100 millimetri usando grasso al silicone.

Quindi sigillare la regione tra queste strisce attaccando un vetrino coprioggetto da 22 x 22 millimetri con grasso al silicone. Posizionare bene il vetro sui vetrini di copertura in modo che le pareti interne creino uno spazio ristretto per la semina delle cellule. Impermeabilizzare tutte le fughe con grasso siliconico.

Rivestire questa regione confinata in sequenza con poli-delicina, seguita da laminina come descritto nel manoscritto allegato. In questa procedura, ottenere i cervelli da E 14 a E 16 topi e metterli in un terreno basale freddo D-M-E-M-F 12. Quindi, rimuovere le meningi al microscopio anatomico.

Successivamente, trasferisci i cervelli in una capsula di Petri da 35 millimetri. Usa la pinza sottile per dissociare il cervello in frammenti di tessuto. Quindi trasferirli in una centrifuga per provette da 15 millilitri.

I campioni a 800 giri/min per tre minuti per rimuovere i detriti D. Successivamente, A-D-M-E-M-F 12 contenente BFDF e DGF ai campioni. Tritrato li mangiava con una pipetta da un millilitro.

Quindi ottenere la sospensione a cella singola con un filtro a celle. Placcare le cellule nei matracci a una temperatura compresa tra 20.000 e 50.000 cellule per millilitro. Quindi eseguire un cambio completo del terreno ogni tre giorni, che comporta la centrifugazione delle celle a 1.300 giri/min per cinque minuti.

Scartare il resus supinato, sospendere il PT in terreno fresco e rimettere le cellule nel pallone ogni sei giorni dopo almeno cinque. Trasferire le NEUROSFERE in una centrifuga in provette da 15 millilitri a 1.500 giri/min per cinque minuti. Scartare il supinato.

Risospendere il pellet in viaggi in EDTA per produrre una sospensione a cella singola. Prima di eseguire una conta cellulare, preparare un millilitro di sospensione contenente 10.000 cellule. Quindi, rimuovere bene la laminina dal bicchiere e lasciarlo asciugare completamente.

Sostituirlo con un millilitro di sospensione cellulare. Dopodiché, metti il piatto nell'incubatrice a 37 gradi Celsius per un minimo di quattro ore per consentire gli attacchi. Una volta che le cellule sono sufficientemente cofluenti, rimuovere il terreno dalla camera.

Rimuovere con cautela il vetro. Bene, quindi formare un tetto sopra le celle attaccando con cura un vetrino di vetro per autoclave da 22 per 22 millimetri tra 2 strisce da 22 per 11 millimetri con grasso al silicone. Ricordarsi di coprire le celle con alcune gocce di terreno per evitare che si secchino.

Quindi formare un serbatoio di mezzo isolato a ciascuna estremità della camera creando due barriere di grasso in silicone a tenuta stagna che corrono da un'estremità all'altra del piatto. Riempire la camera con terreno fresco, assicurando un flusso da un serbatoio di fluido all'altro. Successivamente, rimettere la capsula nell'incubatrice per 12 ore per consentire il recupero delle cellule.

Nella fase successiva, preparare un coperchio per coprire il piatto praticando due fori, uno posizionato su ciascun serbatoio della camera di migrazione. Quindi sostituire il terreno nella camera con un terreno coltivato contenente tampone hippie da 25 millimetri. Successivamente, trasferire la parabola al sistema di imaging a temperatura controllata.

Impostare i parametri sperimentali per il time lapse e la registrazione multiposizione. Allineare la camera in modo che il catodo e l'anodo si trovino rispettivamente a sinistra e a destra per garantire che il vettore del campo elettrico funzioni orizzontalmente come visualizzato al microscopio e registrato nel sistema di imaging. Quindi, riempi due bicchieri.

Con la soluzione di Steinberg. Collegare un becher separato a ciascun serbatoio del terreno utilizzando i ponti di vetro pre-preparati riempiti con soluzione di agar Steinberg al 2%. Quindi posizionare gli elettrodi d'argento collegati a un alimentatore CC nella soluzione Steinberg.

In ogni bicchiere, impostare la manopola della tensione sull'alimentatore su zero e accenderla. Misurare la tensione attraverso la camera elettrotattica con un misuratore di tensione mentre si alza il quadrante della tensione. Quindi regolare la tensione in base ai requisiti sperimentali.

Successivamente, avvia la registrazione time-lapse. Eseguire una sostituzione del fluido e regolare nuovamente la tensione secondo necessità. Ogni ora, farmaci freschi e medi o agenti chimici possono essere aggiunti ai serbatoi, se necessario.

Utilizzando ulteriori fori praticati nel coperchio del piatto di coltura, uno situato su ciascun serbatoio del terreno. In questa fase, sezionare il midollo spinale lombare di topi di due settimane. Quindi tagliare il midollo spinale in sezioni spesse 500 micron con un tritatessuti machel wane al microscopio anatomico.

Separare le fette e selezionare quelle con struttura del midollo spinale assiale sagittale intatta. Successivamente, impiattare le fette in una piastra Petri da 100 millimetri contenente 30 microlitri di gel MA. Posizionali il più vicino possibile al centro.

Conservali in un incubatore al 5% di anidride carbonica a 37 gradi Celsius per almeno 30 minuti. Affinché le proteine del matri gel si autoassemblino, per produrre un film sottile che copra la superficie delle fette del midollo spinale, è molto importante che il matri gel sia stato assemblato completamente. Incubare la capsula di Petri a 37 gradi Celsius per altri 30 minuti, se necessario, quindi aggiungere da quattro a sei millilitri di terreno D-M-E-M-F 12 contenente 25 millimolari di tampone heis e dal 15 al 20% di siero fetale di vitello.

Molto delicatamente per evitare che il fluido fluisca direttamente sulle fette, fate in modo che le fette non siano completamente immerse nel mezzo, lasciando la superficie delle melanzane ben esposta all'aria. Cambia il mezzo due volte alla settimana. Ora incubare la sospensione delle cellule progenitrici neurali nel terreno con cinque uncini micromolari.

3, 3, 3, 4, 2 per 30 minuti. Al microscopio, utilizzare un tubo di vetro capillare per microiniettare due microlitri di sospensione nella fetta del midollo spinale. Lentamente assicurarsi che il tubo di vetro capillare passi attraverso il matrigel e raggiunga l'interno della fetta del midollo spinale.

Tenere il tubo di vetro all'interno della fetta del midollo spinale per almeno 30 secondi per evitare la sospensione cellulare. Passa sopra, quindi posiziona la capsula di Petri contenente la fetta del midollo spinale nell'incubatrice a 37 gradi Celsius con 5 centesimi di anidride carbonica per una notte. Il giorno successivo, costruire una camera elettrotattica attorno alla fetta del midollo spinale contenente ganci 3 3 3 4 2 cellule di neurogenesi marcate prima di applicare un campo elettrico di 500 millivolt per millimetro.

Qui le cellule progenitrici neurali mostrano una migrazione altamente diretta verso il catodo quando esposte ai campi elettrici, le linee rosse e le frecce blu rappresentano rispettivamente le traiettorie e la direzione del movimento cellulare. Ed ecco il grafico dei percorsi di migrazione mostrati. Ecco le cellule progenitrici neurali marcate con uncini 3, 3, 3, 4, 2.

Sono stati trapiantati nella fetta organotipica del midollo spinale al punto di partenza del trattamento con campo elettrico. Dopo che le cellule progenitrici neurali sono migrate direzionalmente verso il catodo per 2,5 ore, la polarità del campo elettrico è stata invertita. L'alterazione della polarità del campo elettrico ha innescato una brusca inversione di axxis verso il nuovo catodo.

Ecco un'immagine delle cellule progenitrici neurali trapiantate all'interno della fetta del midollo spinale. Alla fine della registrazione time-lapse e viene mostrata una ricostruzione 3D delle cellule progenitrici neurali trapiantate all'interno della fetta del midollo spinale. Messa padroneggiata.

Questa tecnica può essere eseguita in due settimane se viene eseguita correttamente dopo il suo sviluppo. Questa tecnica apre ora la strada ai ricercatori nel campo della biologia cellulare per esplorare la migrazione delle cellule progeniche neurali nei sistemi di coltura 2D e 3D in risposta e applicarla al campo elettrico.