Derivazione di precursori gliali limitati dalla E13 topi

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di derivare precursori gliali limitati o cellule GRP dal midollo spinale fetale. Ciò si ottiene estraendo il midollo spinale dai feti E 13 e trasferendoli su piastre di coltura con terreni selettivi in vetroresina. Successivamente, l'immuno panning viene utilizzato per arricchire la popolazione di GRP ed eliminare il lignaggio non GRP.

Le celle in PRFV purificate possono essere congelate e conservate a lungo termine. Le cellule GRP purificate possono essere scongelate e utilizzate per esperimenti futuri, come mostrare la migrazione delle cellule GRP trapiantate attraverso un singolo passaggio a cellula larga. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale in quanto le fasi chirurgiche possono essere difficili da imparare, soprattutto per l'occhio inesperto.

A manifestare oggi sono Roche De Silva e Joel Marx. Chi sono gli studenti del nostro laboratorio Ottenere madri di topo gravide il giorno embrionale E 12 o E 13 dello sviluppo fetale da una fonte commerciale o preparato internamente. Uno è definito dalla presenza di un tappo di muco localizzato per via vaginale.

Il giorno dopo una femmina di salvataggio viene ospitata con un maschio dopo aver disinfettato tutti gli strumenti e il cappuccio di coltura dei tessuti. Preparare una capsula di Petri pulita con 20 millilitri di terreno di dissezione freddo. Successivamente, preparare il topo con un'iniezione anestetizzante di idrato di cloralio.

Una volta che il topo non riesce a mostrare un riflesso del dolore da un pizzico di dito del piede, ad esempio, sopprimerlo tramite lussazione cervicale o decapitazione, preferiamo non usare la CO2 per anestetizzare l'animale a causa del possibile effetto a valle sulla vitalità dei feti e, in ultima analisi, delle cellule derivate. Dopo aver disinfettato la zona addominale, aprire l'addome utilizzando grandi forbici e pinze per rimuovere l'utero. A seconda del ceppo, l'utero conterrà da otto a 14 feti.

Mettere l'utero in dissezione fredda fresca, mezzo in una capsula di Petri pulita per isolare i feti. Per prima cosa, lava via il sangue e i tessuti in eccesso. Quindi estrarre ogni feto dal corno uterino e separarlo dal sacco embrionale e dalla placenta.

Usando piccole forbici, trasferisci i feti in un piatto di dissezione fresca e fresca. Medio. Il terreno freddo abbasserà l'attività metabolica e preserverà la vitalità delle cellule derivate sotto un microscopio da dissezione. Usa una pinza e delle forbici a molla per tagliare la pelle lungo il midollo spinale, staccarla ed esporre il midollo spinale.

Sezionare il midollo spinale intorno a C uno e all'inizio della coda. Quindi rimuovere con cura il midollo spinale con tutto il suo trasferimento osseo e cartilagineo e raccogliere ogni midollo spinale preparato in un unico piatto. Con un terreno di dissezione fresco, raccogliamo l'intero midollo spinale, anche se si trova una popolazione maggiore di cellule GRP.

Alla fine, tuttavia, il terreno GRP seleziona per il fenotipo GRP e quella popolazione è ulteriormente massimizzata da H due B cinque immuno Per prevenire la crescita eccessiva del tessuto meningeo. Nelle colture cellulari successive, rimuovere il più possibile le meningi dal midollo spinale a causa dei nervi periferici rinascenti e sporgenti. Questo è più difficile che rimuovere il tessuto meningeo dal cervello estratto.

Una volta rimossa la maggior parte possibile delle meningi, trasferire il midollo spinale in una capsula di Petri da 20 millimetri e procedere con la dissociazione. Le cellule in preparazione. Preriscaldare un'aliquota di tripsina per almeno mezz'ora in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius.

I seguenti passaggi devono essere eseguiti rapidamente per migliorare la vitalità del tessuto del midollo spinale derivato. Trasferire il midollo spinale in una provetta da centrifuga da 50 millilitri contenente tripsina e DNA. Quindi tritrare brevemente la miscela con un pipettatore.

Incubare la miscela per 10 minuti a 37 gradi Celsius tri. Valutarlo nuovamente e poi continuare l'incubazione per altri 10 minuti. Quindi aggiungere cinque millilitri di terreno di vetroresina in centrifuga per cinque minuti.

A 1000 giri/min aspirare il surnatante e risus. Sospendere il pellet in 10 millilitri di terreno GRP con DNA uno. Ora incubare per altri 10 minuti e pellettare le celle a 1000 RPM per cinque minuti.

Aspirare il surnatante e risospendere il pellet. In vetroresina fresca media. Passare le celle attraverso un colino da 40 a 70 micron e piastarle su palloni T 25 rivestiti di laminina PLL.

Incubare le cellule e cambiare il 100% del terreno il giorno successivo e poi a giorni alterni o più spesso se i nutrienti sono pieghettati. A questo punto, i GRP si sono attaccati e hanno iniziato a estendere i processi e possono essere ottimizzati utilizzando l'immuno panning. Continua a far crescere le cellule fino a quando non sono confluenti all'85-90% o non è passato un debole.

Quindi raccogli le cellule usando un poliziotto di gomma o tripsina. Resus risospendere le cellule in terreno fresco ed espanderle in tre matracci da T 25, cambiando il terreno almeno ogni 48 ore Quando i palloni hanno raggiunto la confluenza, raccoglierle come prima in cinque millilitri di terreno di vetroresina. Tri tasso la sospensione cellulare per rompere i grumi e trasferirli ad A due B cinque rivestiti batteriologici.

Le piastre di Petri incubano le cellule sulle piastre A due B per un'ora a temperatura ambiente senza agitare. Quindi aspirare il terreno e lavare le piastre da quattro a otto volte con PBS per mantenere un elevato rigore per il legame non specifico delle cellule alla piastra. Usando un poliziotto di gomma.

Raccogliere le cellule lavate in due millilitri di terreno in vetroresina e quindi trasferire la sospensione in piastre rivestite di lamina PLL o in matracci con terreno in vetroresina. Una volta che le cellule hanno raggiunto l'85-90% di confluenza, raccogliere la tripsina di riflessione, quindi diluire e inattivare la tripsina con otto millilitri di brodo di vetroresina, terreno, e raccogliere le cellule come pellet. Risospendere il volume delle cellule di un matraccio di T 25 in un millilitro di terreno di congelamento del GRP o le cellule di un matraccio di T 75 in due millilitri di terreno di congelamento del GRP.

Se necessario, regolare la concentrazione della sospensione cellulare e trasferire le cellule in fiale criogeniche, congelare lentamente le cellule durante la notte in un contenitore criogenico contenente isopropanolo a meno 80 gradi Celsius il giorno successivo. Trasferire le cellule in una conservazione a lungo termine. Le cellule saranno vitali dal 60 all'80% dopo lo scongelamento da sei mesi a un anno dopo.

La vitalità dipende in gran parte dalla qualità del rivestimento di lamina PLL. Dopo due giorni di coltura, è stato osservato che le cellule del midollo spinale piatte di diversa morfologia si arricchivano al massimo. Le cellule della popolazione GRP sono immuno pan per selezionare per la popolazione A due B cinque.

Se c'è un problema con la contaminazione delle cellule neuroepiteliali, può essere impiegato il doppio panning immunitario per eliminare prima la popolazione NCA positiva seguita dalla selezione A due B cinque. È stato aggiunto un integratore di T tre B 27 libero per ridurre la contaminazione degli oligodendrociti maturi. Le cellule in vetroresina purificate erano identificabili dal loro piccolo soma e da due o tre processi brevi.

Spesso c'era anche una piccola popolazione persistente di cellule A due B cinque negative che erano neuroepiteliali e in grado di diventare GRP o N rp. Fortunatamente, più a lungo le cellule sono state mantenute sul terreno GRP, più è probabile che abbiano adottato il fenotipo GRP. Le tecniche di base di questa procedura possono essere utilizzate per derivare altri tipi di cellule, che possono rispondere a ulteriori domande come quale cellula è più adatta per la terapia di sostituzione cellulare o i neuroni della corteccia possono essere buoni modelli per la mielinizzazione in vitro.