Name: Derivazione di precursori gliali limitati dalla E13 topi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-06-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 56 s
Description: Scopri la derivazione di precursori gliali da midollo spinale fetale di topi E13 per studiare la linea oligodendrocitaria. Questo metodo consente la coltura e conservazione a lungo termine delle cellule GRP per trapianti e ricerca.

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Desideriamo ringraziare il Dr. Gary Devin per la sua intuizione e feedback su l&#39;impiego di cellule in vetroresina.

Introduzione In questo protocollo si mostra come estrarre, selezionare e piastra gliali ristrette precursore (GRP), le cellule dal midollo spinale di feti di topo E13. Queste cellule sono i primi precursori all'interno delle linee cellulari oligodendrocitario e astrociti e sono definite dalla loro espressione di A2B5. Nel medio GRP integrato con FGF-2, i A2B5 GRPs + inizierà esprimere primi oligodendrocitario lignaggio marcatori PDGFαR e NG2 1,2. Queste cellule della linea oligodendrociti passano attraverso una serie di distinte fasi fenotipici, ognuno caratterizzato da cambiamenti morfologici, nonché l'espressione di marcatori a specifici stadi di sviluppo. Queste cellule precursori sono attualmente in fase di studio come una fonte potenziale di approcci terapeutici basati su celle a disordini della materia bianca del sistema nervoso centrale, inclusa la sclerosi multipla, leucodistrofie e leucomalacia periventricolare (PVL) 3,4,5,6 6,7,8,9. Queste cellule precursori gliali sono state utilizzate anche in studi condotti su altri modelli della materia bianca malattie come le lesioni del midollo spinale e la sclerosi laterale amiotrofica 10,11,12,13. Il nostro laboratorio ha sviluppato un precoce postnatale ipossia-ischemia modello di topo con i quali stiamo valutando l'efficacia di queste cellule derivate dal midollo spinale GRP come un approccio restauro in PVL, la principale causa di paralisi cerebrale 14,15,16. Vi è anche un cervello roditore derivato modello OPC che è stato ampiamente utilizzato per studiare lesioni materia bianca poiché le cellule GRP hanno la tendenza a differenziarsi nel percorso astrocitica 17. Il fenotipo OPC è già entrato nel percorso degli oligodendrociti lignaggio, un fenomeno che sembra irreversible. Tuttavia, siamo interessati a valutare la risposta di un più ampio spettro di cellule progenitrici degli oligodendrociti tra GRP e forse anche la NEP derivati ​​a E10.5. Per questo motivo abbiamo adottato il modello di midollo spinale derivato GRP per il nostro lavoro. Oltre all'uso di GRPs per la sostituzione delle cellule, la derivazione di queste cellule di tipo selvatico e modelli di roditori transgenici di malattie della sostanza bianca consente ulteriori studi in differenziazione gliale in condizioni normali e di malattia in un ambiente in vitro. Pubblicazioni precedenti mostrano segni di vulnerabilità selettiva delle cellule precursori oligodendrocitario di derivazione per vari fattori di stress esterni, come eccitotossicità del glutammato maturazione dipendente, stress ossidativo, e di selezionare i fattori implicati nella neuroinfiammazione 18,19. I nostri studi si sono concentrati sulla comprensione dei meccanismi cellulari e molecolari alla base dello sviluppo di queste lesioni della sostanza bianca, valutare la sensibilità di cellule inlo spettro degli oligodendrociti lignaggio di insultare così come l'analisi putativi approcci terapeutici. Materiale Tutte le procedure che coinvolgono animali sono conformi alle politiche e il PHS IACUC JHU. Tutte le operazioni devono essere eseguite in una cappa a flusso laminare per mantenere condizioni asettiche. Comunemente dissezioni vengono eseguite in una cappa a flusso orizzontale ed in vitro di lavoro in una cappa a flusso verticale. Tutti i mezzi utilizzati freddo durante dissezioni. I topi utilizzati nel nostro studio sono un tipo selvaggio CD-1 e un ceppo transgenico GFP in uno sfondo C57/BL6. Un CD-1 diga del mouse si ottiene in genere da 10 feti + che sono sufficienti per seme 1-2 T25 fiaschi. In genere, due dighe sono sacrificati in un momento e midollo spinale del feto in pool e placcato in 1 T25 pallone per diga. Una volta che le cellule sono state derivate possono essere espansi e caratterizzati in vitro per studi successivi. 1. Preparazione di Media e fiaschi <ul type="disc"><li> GRPterreno viene utilizzato come mezzo dissezione: DMEM / F12 1:1 (Invitrogen) + B27 (50x; Invitrogen) N2 (100x; Invitrogen) Supplementi e sieroalbumina bovina (BSA, 0,5% w / v). </li><li> Dissociazione media: come mezzo di dissezione. </li><li> Terreno di coltura: media magazzino GRP + FGF-2 (10-20 ng / ml; Invitrogen) ed eparina (1 mg / ml, Sigma). </li><li> PLL / laminina rivestite 75 cm 2 o 25 cm 2 palloni (T75 e T25). </li><li> Fiaschette per coltura tissutale (75 cm 2, Falcon) sono state rivestite con 15-20μg/ml Poly-L-lisina (PLL, Sigma) in H 2 O distillata, incubate a 37 ° C per 1 ora poi aspirato. Palloni vengono lavati con 1X PBS poi rivestita con 15-20 ug / ml di laminina (Sigma) in PBS a 37 ° C per 1 ora, poi aspirato e PBS fresco o supporti aggiunto finché le cellule sono pronte per essere placcato. Dopo rivestimento, flaconi non dovrebbe mai essere lasciata asciugare, ma può essere mantenuta in PBS o mezzi a 4 ° C per brevi periodi prima dell'uso. </li></ul> 2. Strumenti e Other Materiale <ul type="disc"><li> Piastre di Petri: 4 per diga: 3 piastre di Petri per la dissezione (75 mm), un piatto di 20 mm per la raccolta dei cavi raccolte spinale. </li><li> Forbici di grandi dimensioni (43 mm forbici operativi, Roboz) e pinze dei tessuti dell'addome per l'apertura della diga di s. </li><li> Forbice piccola per sezionare l'utero e la rimozione dei feti (15 mm Forbici Micro dissezione, Roboz). </li><li> Micro forbici a molla dissezione (6 mm) di sezionare il midollo spinale dei feti. </li><li> Micro Pinza dissezione angolate per l'ancoraggio del corpo diga e fetale durante l'intervento chirurgico e in seguito la rimozione del midollo spinale, una volta esposta. </li><li> 40 o 70 filtro cellule micrometro per la rimozione di detriti cellulari prima della placcatura. </li><li> Tripsina 0,05% preriscaldata a 37 ° C. </li><li> 10 mg / ml DNAse 1 (Sigma), preparato come un archivio di 100x (1 g / ml). </li><li> Bio-hazard sacco per cadaveri animali. </li><li> 15 e 50 ml provette per centrifuga per l'elaborazione estratto midollo spinale. </li></ul> 3. Determinazione Timed Pregnancy Dighe del mouse in stato di gravidanza o sono ordinati da fonti commerciali che specificano la consegna il giorno embrionale E12 o E13 dello sviluppo fetale o di gravidanza, riscontrata in-house. In breve, due femmine sono messi insieme con un maschio nel tardo pomeriggio e lasciato tutta la notte insieme. Il giorno successivo le femmine sono osservate per la presenza della spina muco vaginale posizione. Il tappo di muco è solo un'indicazione che si sia verificato così l'accoppiamento animali vengano successivamente pesati quotidianamente per monitorare la frequenza di aumento di peso. Il giorno si osserva il tappo di muco è definito come giorno uno embrionale (E1). 4. Tissue Derivazione <ol><li> Lavorare sotto una cappa a flusso orizzontale per mantenere condizioni di asetticità. </li><li> Spruzzare il cofano e la zona di lavoro con etanolo 70%. </li><li> Strumenti in autoclave o spray liberamente con il 70% di etanolo. </li><li> Preparare gli strumenti, i media, e microscopio per l'uso. </li><li> Versare 20 ml di mezzo di dissezione a freddo in sterile di Petrish. </li><li> Anestetizzare animale con cloralio idrato (500 mg / kg) somministrato per via intraperitoneale (IP) seguita da dislocazione cervicale o decapitazione. </li><li> Spruzzare la zona addominale della diga con il 70-90% di etanolo (disinfezione) </li><li> Aprire addome con forbice grande e pinze. <ol type="a"><li> In CD1 e C57/BL6 ceppi: Di ​​solito da 8 a 14 feti sarà all'interno dell'utero. Il numero dei feti è sforzo dipendente. </li></ol></li><li> Estrarre l'utero del mouse compresi i cuccioli e mettere in fresco mezzo di dissezione a freddo in un piatto pulito Petri per lavare il sangue e frammenti di tessuto dal feto. </li><li> Estrarre ogni feto dalla tromba uterina e separarli dalla placenta e il sacco embrionale con le forbici di piccole dimensioni. Trasferire i feti estratti in media dissezione fresca in un nuovo piatto Petri. <ol type="a"><li> Mezzo di dissezione deve essere a bassa temperatura per abbassare l'attività metabolica e preservare la vitalità di cellule derivate. </li><li> Lavorare da ora in poi con due pinze emicro dissezione primaverili-forbici. </li></ol></li><li> Lavorare sotto il microscopio di dissezione, tagliare la pelle lungo il midollo spinale con le forbici chirurgiche e micro pelle a buccia di nuovo per esporre il midollo spinale. </li><li> Transetto il midollo spinale con le forbici microchirurgia a circa C1 e all'inizio della coda. </li><li> Togliere il midollo spinale con le pinze smussate, verificare le ossa e la cartilagine sono stati rimossi e il trasferimento al 3 ° capsula di Petri di dissezione media. </li><li> Per evitare la crescita eccessiva del tessuto meningea in colture cellulari successive tenta di rimuovere il più delle meningi il più possibile dal midollo spinale. A causa delle nascenti nervi periferici sporgenti questo è più difficile rimuovere il tessuto meningeo estratto dal cervello. </li><li> Una volta meningi sono stati rimossi, trasferire midollo spinale al piatto mm 20 Petri </li><li> Pulire dal fondo spruzzando la superficie con etanolo al 70-90%. </li><li> Le seguenti operazioni per la dissociazione dovrebbe essere fatto in fretta per mantenereuno alta vitalità del tessuto derivata midollo spinale. </li></ol> 5. Istituzione Cultura <ol><li> Tripsina deve essere pre-riscaldato per almeno 30 min a 37 ° CH 2 O-bagno. Una aliquota appropriata dovrebbe essere rimosso dal magazzino per ridurre l'esposizione delle scorte alle fluttuazioni di temperatura. </li><li> Trasferire le corde raccolte spinale ad un tubo da centrifuga da 50 ml contenente 10 ml preriscaldata tripsina (0,05%; qualità Biologicals) e 100 pl DNAsi (10 mg / ml) e triturare brevemente. </li><li> Incubare a 37 ° CH 2 O-bagno per 10 minuti. </li><li> Triturare e incubare per altri 10 minuti. </li><li> Aggiungere 5 ml GRP medio (definito sopra) e centrifugare per 5 min a 1000 RPM. </li><li> Aspirare il surnatante e risospendere pellet con 10 ml di terreno GRP e aggiungere DNAse-1 (10 mg / ml, Sigma). </li><li> Incubare a 37 ° CH 2 O-bagno per 10 minuti. </li><li> Centrifugare 5 min a 1000 RPM e aspirare il surnatante. </li><li> Risospendere il pellet con fresh medie GRP poi detriti filtro con un 40-70 micron filtro cell. </li><li> Piastra il PLL / laminina rivestita 25 centimetri (2 fiasche T25) e incubare a 37 ° C, 95% di umidità e 5% CO 2. </li><li> 100 media% cambia il giorno successivo. </li><li> A questo punto, GRP hanno attaccato e ha iniziato estendere i processi. </li></ol> 6. Immunopanning della popolazione GRP <ol><li> Tessuto del midollo spinale Piastra in PLL / laminina rivestite fiaschi fino a pallone è 85-90% confluenti o circa una settimana. </li><li> Cellule Harvest raschiando pallone con un poliziotto in gomma o con il 0,05% tripsina, triturare accuratamente ma delicatamente, centrifugare a 1000 rpm per 5 min e accuratamente risospendere pellet con 3 ml di terreno GRP. </li><li> Trasferire 1 ml ciascuna a 3 T25 palloni o 3 ml a 1 T75 pallone di aggiungere volumi adeguati di mezzo per coprire completamente le cellule e permettono di raggiungere palloni 80-90% di confluenza. </li><li> Variazione media ogni altro giorno, prima, se di media consuma in fretta. </li><li> Coat batteriologica Pepiatti tri (75 mm) notte a 4 ° C con un anticorpo anti-topo IgM (Southern Biotech), 10 pg / ml in PBS. </li><li> Aspirare il tampone in eccesso e lavare i piatti Petri 3x con PBS. </li><li> Aggiungere anticorpo A2B5 (Millipore) ad una concentrazione di 5 pg / ml diluito in PBS e incubare per 1 ora a temperatura ambiente (RT). </li><li> Lavare le piastre ancora una volta con PBS 3x poi aggiungere 8 ml di mezzo di GRP contro l'essiccamento della piastra. </li><li> Trasferire 5 ml di terreno GRP da piastre di Petri e cellule GRP raccolto raschiando palloni con un poliziotto in gomma per staccare tutte le cellule </li><li> Triturare sospensione cellulare brevemente per rompere grumi e trasferire 5 ml di sospensione cellulare per le A2B5 rivestite piatti batteriologici Petri. </li><li> Incubare 1 ora a temperatura ambiente senza agitazione. </li><li> Dopo 1 ora supporti aspirato e piatti lavaggio 8x con PBS. </li><li> Raschiare delicatamente le cellule con un poliziotto in gomma in 2 ml GRP supporti poi il trasferimento a PLL / laminina piastre rivestite o fiaschi con un volume adeguato di mezzo di GRP. </li> 7. Congelamento e conservazione di cellule derivate <ol><li> Le cellule sono raccolte da un 85-90% confluenti T25 o T75 pallone con 2 ml di tripsina 0,05%. </li><li> La tripsina viene diluito e inattivato con mezzo 8ml archivio di GRP e centrifugate a 1000 rpm per 5 min. </li><li> Pellets da T25 beute vengono risospese in 1 ml di mezzo congelamento GRP, (media archivio di GRP integrato con 10% (v / v) di DMSO e facoltativamente, FBS 20%). I granuli più grandi palloni da T75 sono diluiti due volte. </li><li> Sospensioni cellulari di 1,5 x 10 - 3 10,11,12,13 cellule vengono trasferiti in fiale criogeniche (Nalgene) e conservato durante la notte in un contenitore criogenico (Nalgene) contenente isopropanolo a -80 ° C a congelare lentamente durante la notte. </li><li> A seguito di celle di congelamento durante la notte vengono trasferite alle caselle freezer e conservati da 6 mesi a 1 anno a -80 ° C o più a lungo termine in N (l). Cellule scongelate sono tipicamente 60-80% realizzabile in funzione soprattutto della qualità del PLL / laminina rivestimento. </li></ol> 8. Risultati rappresentativi CO 2 non è utilizzato per anestetizzare l'animale a causa dei possibili effetti a valle sulla vitalità dei feti e, infine, le cellule derivate. Inoltre, sarà molto difficile da rimuovere completamente le meningi dal midollo spinale durante la procedura di derivazione, ma la combinazione di mezzo GRP e immunopanning eliminerà queste cellule in rapida crescita. Allo stesso modo, il midollo spinale è tutto raccolto, nonostante una maggiore concentrazione ventrale della popolazione GRP a causa della sua origine nel midollo spinale ventrale e la migrazione dorsalmente 20. Tuttavia il mezzo di GRP seleziona per il fenotipo GRP e che la popolazione è massimizzato A2B5 immunopanning. Dopo la placcatura del midollo spinale, le colture in vitro sono incubate per due passaggi o circa una settimana. Dopo 2 giorni di coltura, le cellule di morfologie differenti possono essere osservati in fiaschette per coltura dei tessuti indicanti il ​​eterogeneità della popolazione ma il mezzo GRP seleziona per il fenotipo GRP. Queste cellule sono una combinazione di A2B5 + GRP, E-NCAM + precursori neuronali ristrette (PNR) e nestina + e A2B5-neuroepiteliale cellule e possibilmente fibronectina + meningee cellule. Inoltre, i fenotipi più mature possono essere presenti che esprimono i marcatori tra cui doublecortin e Tuj1 per lineage neuronale, GFAP per gli astrociti e PDGFaR e GALC per lignaggio oligo Al fine di massimizzare altamente GRP popolazione arricchito dal pool eterogeneo di partenza (Figura 1A), le cellule possono essere a doppio immunopanned per selezionare ed eliminare le e-NCAM + cellule seguite da selezione per la A2B5 + popolazione GRP, una volta la densità delle cellule è aumentata a circa il 85-90% di confluenza in fiasche T75. Queste cellule GRP mantenere la loro capacità di diventare astrociti, pur essendo in un mezzo che seleziona per il fenotipo degli oligodendrociti in modo conseguente A2B5 immunopanning può essere necessario per mantenere una popolazione altamente arricchito GRP. Immunopanning generendimenti alleato fino al 95% A2B5 + cellule, ma per la resa ancora maggiore A2B5 perline magnetiche coniugate (Miltenyi Biotec Inc.) può essere usato per fornire una resa fino al 97%. Vigilanza nelle culture GRP le funzioni di manutenzione come ad esempio le normali modifiche multimediali ridurrà al minimo la proliferazione di non-GRP tipi di cellule. Anche in assenza di BMP-4 astrociti possono ancora essere trovati e mezzi impoverito in particolare sembra indurre la differenziazione di un fenotipo astrociti. Sebbene l'integratore B27 contiene tri-iodotironina ormone (T3), vi è stata osservata alcuna tendenza a differenziarsi in oligodendrociti nella popolazione GRP, solo quando livelli più elevati di T3 vengono aggiunti al mezzo di questo fenomeno si verifica. Tuttavia, un T3 libero B27 integratore può essere sostituito se c'è una preoccupazione per la contaminazione da oligodendrociti maturi (figura 1B). Queste cellule GRP possono essere facilmente identificati dalla loro morfologia di soma con 2 o 3 processi brevi ma a schermo per altri tipi di cellule che possono essere presenti, immunocytochemistry può essere eseguita per i precedentemente citati marcatori comuni tipo di sviluppo e delle cellule specifiche. Ci sarà comunemente una piccola popolazione persistente di A2B5 le cellule che sono neuroepiteliale (NEP) e capace di diventare uno GRP o PNR. Fortunatamente, le cellule sono mantenute più a lungo nel terreno GRP più è probabile che il mezzo viene selezionato per il fenotipo GRP. <img alt="Figura 1." src="/files/ftp_upload/3462/3462fig1.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 1."> Figura 1. A) placcati in cellule del midollo spinale di morfologia eterogenei sono stati osservati dopo 2 giorni di coltura. B) Immunopanning GRP massimizza una popolazione altamente arricchito dal pool eterogeneo di partenza. </ol>

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</ol>

Questo studio è stato finanziato dal National Institute of Health [NICHD P30HD024061 (AWP), NINDS K08NS063956 (AF), e R01NS028208 (MVJ)] e la Fondazione Child Neurology. Il contenuto di questo rapporto sono di esclusiva responsabilità degli autori e non necessariamente rappresentano le opinioni ufficiali del National Institute of Health, DHHS. Gli autori non hanno conflitti di interesse rilevanti per questo studio.

<p class="jove_content"&gt; Malattie del sistema nervoso centrale sostanza bianca comprende un gran numero di eziologie, tra le cause genetiche, infiammatorie, ischemica e tossici<sup&gt; 19,21,22,23,24</sup&gt;. Mentre la sclerosi multipla e vasculopatie sono la principale causa di malattia della materia bianca negli adulti, leucomalacia periventricolare associata alla prematurità è la causa più comune di lesioni della sostanza bianca nella popolazione infantile. Al fine di delineare ulteriormente i meccanismi della malattia ulteriore studio di lignaggio ofoligodendrocytic cellule, che sono fortemente colpite dalla insulto perinatale, è necessaria. GRPs sono state isolate dal midollo spinale e roditore embrionale dimostrato di essere tripotential in natura, dando origine a oligodendrociti e due distinte popolazioni astrociti, ma non differenziano in neuroni<sup&gt; 2,25,26</sup&gt;. Allo stesso modo, le cellule precursori degli oligodendrociti (OPC) derivati ​​da topi nervo ottico e alla fine il cervello embrionale o postnatale precoce ratti hanno dimostrato di maturare in oligodendrociti funzionanti nelle condizioni di appropriati mezzi<sup&gt; 27,28</sup&gt;. Inoltre, fetale o adulto derivato OPC umano sono stati ulteriormente manipolato in oligodendrociti fenotipi più maturi<sup&gt; 29,30</sup&gt;.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; Celle in vetroresina sono stati isolati sia dal midollo spinale dei ratti e E12 E13.5-13.5 nei topi. Nelle differenze di ratto sono state riportate tra le cellule GRP-dorsali e ventrali derivato nella loro risposta a condizioni che promuovono la generazione di oligodendrociti o astrociti con ventrale derivati ​​GRPs che presenta una maggiore propensione a differenziarsi in i fenotipi più maturi<sup&gt; 25,26,28</sup&gt;. Questo può essere dovuto alla migrazione di ventrale dorsale delle cellule GRP nascenti, che potrebbero essere meno sensibile ai segnali di differenziazione. Immunopanning consente la sottopopolazione che esprime A2B5 essere isolato e raccolte per la manutenzione in coltura.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; Le nostre culture del mouse in PRFV sono derivati ​​dal totale tessuto del midollo spinale che produce un eterogenea, della popolazione studiata di cellule da cui vengono selezionate le cellule in vetroresina con mezzi chimici (media) e le tecniche di base di anticorpi. Mentre i nostri studi hanno utilizzato i derivati ​​del midollo spinale di topo le cellule in vetroresina, è stato segnalato più recentemente la derivazione di cellule progenitrici derivate cervello di topo oligodendrociti, che sono anche in grado di svilupparsi in oligodendrociti maturi<sup&gt; 31</sup&gt;. Qui le cellule derivate sono inizialmente coltivate come oligospheres che l&#39;utilizzo del mezzo adeguato cultura sono manipolati in un PDGFαR arricchito +, la popolazione OPC<sup&gt; 31</sup&gt;. I nostri studi si sono concentrati sugli effetti del nostro modello di insulto ipossico-ischemico sulle cellule nello spettro lignaggio degli oligodendrociti da A2B5 + e PDGFαR in PRFV precursori della proteina basica della mielina (MBP + esprimere) oligodendrociti maturi. Infatti il ​​nostro<em&gt; In vitro</emCaratterizzazione&gt; ha dimostrato che queste cellule immature in vetroresina mature in cellule MBP che esprimono sia in monocolture o in co-colture con i neuroni corticali. Queste cellule possono essere manipolati in cultura in percorsi di differenziazione specifici per lo studio dei meccanismi coinvolti nella perinatale lesioni della sostanza bianca. Ci sono diversi modelli murini di malattie della sostanza bianca che coinvolgono le cellule del lignaggio degli oligodendrociti e la disponibilità di questa popolazione permette un&#39;indagine approfondita dei meccanismi che causano pregiudizio, come pure per esplorare l&#39;utilità delle possibili opzioni di terapia cellulare.</p

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome del reattivo </th><th> Azienda </th><th> Numero di catalogo </th></tr><tr><td> DMEM / F12 01:01 </td><td> Invitrogen </td><td> 11320033 </td></tr><tr><td> B27 </td><td> Invitrogen </td><td> 17504044 </td></tr><tr><td> N2 </td><td> Invitrogen </td><td> 17502048 </td></tr><tr><td> rH-FGF-base </td><td> Invitrogen </td><td> PHG0026 </td></tr><tr><td> Tripsina (0,05%) EDTA </td><td> Qualità biologica, Inc. </td><td> 118-087-721 </td></tr><tr><td> POLY-L-lisina HBr </td><td> Sigma </td><td> P1274-25mg </td></tr><tr><td> Laminina </td><td> Sigma </td><td> L2020-1MG </td></tr><tr><td> DNasi 1 </td><td> Sigma </td><td> DN25 </td></tr></tbody></table>

derivazione di precursori gliali limitati dalla e13 topi

Derivation of Glial Restricted Precursors from E13 mice

Questo è un protocollo per la derivazione di gliali ristrette precursore (GRP), le cellule dal midollo spinale di feti di topo E13. Queste cellule sono i primi precursori all&#39;interno della linea cellulare oligodendrocitario. Recentemente, queste cellule sono state studiate come fonte potenziale di terapie rigeneranti nelle malattie della sostanza bianca. Leucomalacia periventricolare (PVL) è la principale causa di non-malattia genetica della sostanza bianca durante l&#39;infanzia e colpisce fino al 50% dei neonati estremamente prematuri. I dati suggeriscono una accresciuta sensibilità del cervello in via di sviluppo di ipossia-ischemia, stress ossidativo ed eccitotossicità che colpisce selettivamente nascente della sostanza bianca. Gliali precursori ristrette (GRP), cellule progenitrici degli oligodendrociti (OPC) e gli oligodendrociti immaturi (preOL) sembrano essere i giocatori chiave per lo sviluppo della PVL e sono oggetto di studi continui. Inoltre, studi precedenti hanno identificato un sottogruppo di tessuto del SNC che ha aumentato la sensibilità al glutammato come eccitotossicitànonché uno schema di sviluppo a questa suscettibilità. Il nostro laboratorio sta studiando il ruolo dei progenitori degli oligodendrociti in cellule PVL e l&#39;uso nella fase di sviluppo GRP. Utilizziamo queste cellule derivate vetroresina in diversi paradigmi sperimentali per testare la loro risposta alle sollecitazioni selezionare coerenti con PVL. GRP cellule possono essere manipolate in vitro e in OPCs preOL per esperimenti di trapianto con il mouse i modelli PVL e in modelli in vitro di PVL-come insulti tra ipossia-ischemia. Utilizzando cellule in coltura e in studi in vitro ci sarebbe ridotta variabilità tra esperimenti che facilita l&#39;interpretazione dei dati. Cellule in coltura consente anche per l&#39;arricchimento della popolazione GRP, riducendo al minimo l&#39;impatto della contaminazione di cellule non-GRP fenotipo.

Questo protocollo descrive la derivazione di precursori gliali limitati dal midollo spinale del feto e mantenute in vitro sia per trapianto o per lo studio del lignaggio oligodendrocitario.

Derivazione di precursori gliali limitati dalla E13 topi

Questo è un protocollo per la derivazione di cellule precursori gliali ristrette (GRP) dal midollo spinale di feti di topo E13. Queste cellule sono precursori precoci...

L'obiettivo generale di questa procedura è ottenere precursori gliali limitati o cellule GRP da midolli spinali fetali. Questo viene ottenuto estraendo i midolli spinali da feti al giorno E13 e trasferendoli in piastre di coltura contenenti un mezzo selettivo per GRP. Successivamente, viene utilizzata l'immunopanning per arricchire la popolazione di GRP ed eliminare le linee cellulari non GRP.Le cellule GRP purificate possono essere congelate e conservate a lungo termine. Le cellule GRP purificate possono essere scongelate e utilizzate per esperimenti futuri, come dimostrare la migrazione di cellule GRP trapiantate attraverso un passaggio largo una singola cellula. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale poiché i passaggi chirurgici possono risultare difficili da apprendere, specialmente per un occhio inesperto.Oggi dimostrano Roche De Silva e Joel Marx, studenti del nostro laboratorio. Ottenere femmine di topo gravide al giorno embrionale E 12 o E 13 dello sviluppo fetale da una fonte commerciale o preparate in laboratorio. Il giorno E 1 è definito dalla presenza di un tappo di muco localizzato a livello vaginale.Il giorno successivo, una femmina in estro viene alloggiata con un maschio, avendo prima igienizzato tutti gli strumenti e la cappa a flusso laminare per colture cellulari. Preparare una piastra di Petri pulita con 20 millilitri di mezzo di dissezione freddo. Successivamente, preparare il topo con un'iniezione anestetica di cloralidrato.Una volta che il topo non mostra più un riflesso del dolore a seguito di una compressione delle dita dei piedi, ad esempio, si proceda all'eutanasia mediante dislocazione cervicale o decapitazione. Preferiamo non utilizzare CO2 per anestetizzare l'animale a causa del possibile effetto indiretto sulla vitalità dei feti e, di conseguenza, sulle cellule derivate. Dopo aver disinfettato la zona addominale, aprire l'addome utilizzando forbici grandi e pinze per rimuovere l'utero. A seconda della linea genetica, l'utero conterrà da otto a quattordici feti.Posizionare l'utero in un mezzo di dissezione fresco e freddo all'interno di una piastra di Petri pulita per isolare i feti. Inizialmente, rimuovere il sangue e i tessuti in eccesso. Successivamente, estrarre ciascun feto dal corno uterino e separarlo dalla sacca embrionale e dalla placenta.Utilizzando piccole forbici, trasferire i feti in una piastra contenente mezzo di dissezione fresco e freddo. Il mezzo freddo ridurrà l'attività metabolica e preserverà la vitalità delle cellule derivate. Sotto un microscopio stereoscopico, utilizzare pinzette e forbici a molla per tagliare la pelle lungo il midollo spinale, sollevarla e esporre il midollo spinale.Sezionare il midollo spinale all'incirca a livello di C1 e all'inizio della coda. Quindi rimuovere con attenzione il midollo spinale insieme a tutte le strutture ossee e cartilaginee e raccogliere ciascun midollo spinale preparato in una singola piastra. Utilizzando mezzo di dissezione fresco, si preleva l'intero midollo spinale, anche se è presente una popolazione maggiore di cellule GRP.Tuttavia, alla fine il mezzo GRP seleziona il fenotipo GRP e tale popolazione viene ulteriormente massimizzata dall'immuno H two B five per prevenire la sovracrescita del tessuto meningeo. Nei successivi coltivi cellulari, rimuovere il più possibile le meningi dal midollo spinale a causa dei nervi periferici emergenti sporgenti. Questa operazione è più difficile rispetto alla rimozione del tessuto meningeo dal cervello estratto.Dopo aver rimosso il più possibile le meningi, trasferire i midolli spinali in una piastra di Petri da 20 millimetri e procedere con la dissociazione. Le cellule in preparazione. Preguarire un'aliquote di tripsina per almeno mezz'ora in un bagnomaria a 37 gradi Celsius.I seguenti passaggi devono essere eseguiti rapidamente per migliorare la vitalità del tessuto del midollo spinale ottenuto. Trasferire i midolli spinali in un tubo da centrifuga da 50 millilitri contenente tripsina e DNA. Quindi, triturare brevemente la miscela con una pipetta.Incubare la miscela per 10 minuti a 37 gradi Celsius. Agitare nuovamente e quindi proseguire l'incubazione per altri 10 minuti. Successivamente aggiungere cinque millilitri di mezzo GRP e centrifugare per cinque minuti.A 1000 g aspirare il soprannatante e risospendere. Sospendere il pellet in 10 millilitri di mezzo GRP con DNAs one. Incubare ora per altri 10 minuti e centrifugare le cellule a 1000 g per cinque minuti.Aspirare il soprannatante e risospendere il pellet in un nuovo mezzo GRP. Far passare le cellule attraverso un filtro cellulare da 40 a 70 micron e seminare su flaconi T25 rivestiti con PLL laminina.Incubare le cellule e sostituire il 100% del mezzo il giorno successivo, quindi ogni due giorni o più spesso se i nutrienti sono esauriti. A questo punto, i GRP si sono attaccati e hanno iniziato a estendere i prolungamenti e possono essere ottimizzati mediante panning immunoistochimico. Continuare a coltivare le cellule fino a quando non raggiungono una confluenza dell'85-90% o fino al passaggio di una settimana.Quindi raccogliere le cellule utilizzando un raschietto di gomma o tripsina. Risospendere le cellule in mezzo fresco ed espanderle in tre fiasche T25, cambiando il mezzo almeno ogni 48 ore. Quando le fiasche hanno raggiunto la confluenza, raccoglierle come in precedenza in cinque millilitri di mezzo GRP. Vagliare la sospensione cellulare per rompere gli aggregati e trasferirla in una piastra batteriologica rivestita 2B5.Le piastre di Petri incubano le cellule sulle piastre A due B per un'ora a temperatura ambiente senza agitazione. Quindi aspirare il mezzo e lavare le piastre da quattro a otto volte con PBS per mantenere un'elevata stringenza contro il legame non specifico delle cellule alla piastra. Utilizzando un raschietto di gomma.Raccogliere le cellule lavate in due millilitri di mezzo GRP e quindi trasferire la sospensione in piastre o fiasche rivestite con lamina PLL con mezzo GRP. Una volta che le cellule hanno raggiunto una confluenza dell'85-90%, raccoglierle con tripsina, quindi diluire e inattivare la tripsina con otto millilitri di mezzo GRP stock e raccogliere le cellule come pellet. Risospendere il volume di cellule provenienti da una fiasca T25 in un millilitro di mezzo di congelamento GRP o le cellule provenienti da una fiasca T75 in due millilitri di mezzo di congelamento GRP.Se necessario, regolare la concentrazione della sospensione cellulare e trasferire le cellule in provette criogeniche; congelare lentamente le cellule durante la notte in un contenitore criogenico contenente isopropanolo a meno 80 gradi Celsius. Il giorno seguente, trasferire le cellule in conservazione a lungo termine. Le cellule presenteranno una vitalità del 60-80% dopo il scongelamento, da sei mesi a un anno più tardi.La vitalità dipende in larga misura dalla qualità del rivestimento di laminina PLL. Dopo due giorni di coltura, si è osservato un arricchimento massimo delle cellule del midollo spinale piastrate, che presentavano diverse morfologie. Le cellule della popolazione GRP sono immuno pan per selezionare la popolazione A due B cinque.Se si verifica un problema di contaminazione da cellule dell'epitelio neuroectodermico, si può ricorrere a un'immunopanning doppia per eliminare prima la popolazione positiva per NCA, seguita poi dalla selezione A due B cinque. È stato aggiunto un supplemento B27 privo di T tre per ridurre la contaminazione da oligodendrociti maturi. Le cellule GRP purificate erano identificabili per il loro piccolo soma e per la presenza di due o tre brevi prolungamenti.Spesso era presente anche una piccola popolazione persistente di cellule negative per A due B cinque, di tipo neuroepiteliale, in grado di differenziarsi in GRP o in N rp. Fortunatamente, più a lungo le cellule venivano mantenute nel mezzo GRP, maggiore era la probabilità che assumessero il fenotipo GRP. Le tecniche di base di questa procedura possono essere utilizzate per ottenere altri tipi cellulari, permettendo di rispondere ad ulteriori domande, come quale cellula sia più adatta per la terapia sostitutiva cellulare o se i neuroni derivati dalla corteccia possano costituire buoni modelli per la mielinizzazione in vitro.

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Questo video descrive il metodo utilizzato per l'isolamento di neuroprecursors dalla corteccia sviluppo embrionale dei topi. Il procedimento per eliminare gli embrioni dall'utero, sezionare il tessuto corticale, e digerire la corteccia cerebrale isolato viene mostrato.

Cultura di cellule precursori staminali neurali del mouse

Il video ha dimostrato il metodo di isolamento e coltura delle cellule dal cervello di un topo neonatale. Ha comportato la dissociazione enzimatica e meccanica del cervello, seguita dalla coltura in terreni di crescita privi di fattore di crescita neuronale per ottenere una popolazione gliale mista.

Ottenimento di una coltura di cellule gliali miste da un cervello di topo neonatale

Il trapianto di cellule staminali / progenitrici neurali (NPC) detiene grandi promesse in neurologia rigenerativa. La consegna sistematica di NPC è trasformato in efficace protocollo, bassa invasività, e terapeuticamente molto efficace per fornire cellule staminali nel cervello e nel midollo spinale di roditori e primati non umani affetti da danni infiammatoria cronica sperimentale del sistema nervoso centrale.

Iniezione sistemica di cellule staminali neurali / progenitrici nei topi con EAE cronica

Questa procedura mostra come indirizzare gli interneuroni nel prosencefalo del topo in via di sviluppo per mezzo dell'elettroporazione in utero. Questa tecnica è stata particolarmente efficace per ottenere l'espressione genica selettiva nei sottotipi di interneuroni destinati agli strati superficiali della corteccia.

Sottotipo-selettivo elettroporazione della corticale interneuroni

Generazione di cellule staminali pluripotenti indotte fornisce prospettive affascinanti per la derivazione di trapianto autologo. Tuttavia, la progressione attraverso uno stato pluripotente e laborioso ri-differenziazione impedisce ancora di traduzione clinica. Qui si descrive la derivazione di fibroblasti umani adulti e la loro conversione diretta in cellule progenitrici neurali indotte e la successiva differenziazione in linee neurali.

Derivazione di adulti fibroblasti umani e la loro conversione diretta in celle espandibile progenitrici neurali

Questo protocollo descrive un metodo per la generazione di corticale Interneurone progenitori e precursori post-mitotici Interneurone da cellule staminali embrionali di topo usando un metodo modificato embryoid corpo-a-monostrato. Questi progenitori/precursori possono essere usati in vitro o fluorescente ordinati e trapiantate nel neocortex neonatale per lo studio della determinazione di destino o usati in applicazioni terapeutiche.

Differenziazione delle cellule staminali embrionali di topo in precursori Interneurone corticale

Qui, descriviamo l'isolamento di cellule glial-enterico dal submucosa intestinale utilizzando le incubazioni EDTA sequenziale per chelare cationi bivalenti e quindi l'incubazione in soluzione di recupero delle cellule non-enzimatici. La sospensione cellulare risultante su poli-D-lisina e laminin di placcatura si traduce in una cultura altamente arricchita delle cellule glial submucosal per l'analisi funzionale.

Isolamento delle cellule Glial enteriche da Submucosa e Lamina Propria del topo adulto

Qui, presentiamo una nuova tecnica microsurgical per l'isolamento delle cellule staminali neurali dall'eminenza E13 del mouse embrione gangliare.

Isolamento e coltura di cellule staminali neurali embrionali del Mouse

Qui presentiamo un protocollo per l'isolamento in vitro di più popolazioni di cellule gliali da un SNC di topo. Questo metodo consente la segregazione delle microglia regionali, delle cellule precursori degli oligodendrociti e degli astrociti per studiare i fenotipi di ciascuno in una varietà di sistemi di coltura.

Dissezione e isolamento della glia murina da più regioni del sistema nervoso centrale

Descriviamo la procedura per la differenziazione in vitro di cellule staminali embrionali di topo in cellule neuronali utilizzando il metodo della goccia sospesa. Inoltre, eseguiamo un'analisi fenotipica completa attraverso RT-qPCR, immunofluorescenza, RNA-seq e citometria a flusso.

Differenziazione e caratterizzazione di progenitori neurali e neuroni da cellule staminali embrionali di topo

Durante lo sviluppo della corteccia cerebrale, i neuroni e le cellule gliali hanno origine nella zona ventricolare che riveste il ventricolo e migrano verso la superficie del cervello. Molti geni sono coinvolti in questo processo. Questo protocollo introduce la tecnica per l'imaging time-lapse di neuroni in migrazione e progenitori gliali.

Imaging time-lapse di neuroni in migrazione e progenitori gliali in fette di cervello embrionale di topo

Scopri la derivazione di precursori gliali da midollo spinale fetale di topi E13 per studiare la linea oligodendrocitaria. Questo metodo consente la coltura e conservazione a lungo termine delle cellule GRP per trapianti e ricerca.

Derivazione di precursori gliali limitati dalla E13 topi

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