Dinamica dopamina presinaptica in fettine di cervello striatale con Fast-scan Voltammetria ciclica

L'obiettivo generale di questa procedura è illustrare un protocollo generale per la telemetria con scansione ciclica rapida su sezioni. Questo viene realizzato preparando innanzitutto il tessuto cerebrale per il taglio coronale. Successivamente, gli elettrodi vengono posizionati sulla regione cerebrale d'interesse discreta.

Il passo successivo consiste nell'applicare una tensione sotto forma di onda triangolare attraverso l'elettrodo per rilevare la dopamina. Infine, un agente farmacologico di interesse viene applicato alla sezione cerebrale e ne viene osservato l'effetto sulla dinamica dopaminergica presinaptica. In definitiva, questo protocollo mostra variazioni nella dinamica dopaminergica presinaptica, come il rilascio di dopamina indotto e le velocità di captazione della dopamina mediante voltammetria ciclica ad alta velocità.

Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulle dinamiche della dopamina presinaptica, può essere applicato anche ad altri sistemi, inclusi animali e neurotrasmettitori, come ratti e moscerini della frutta, e serotonina e noradrenalina. A dimostrare la procedura saranno Francis Mena, MEA Khalid ed Erin oo, studenti laureati del mio laboratorio. Per iniziare questa procedura, in base al manoscritto allegato, preparare tre tipi di soluzioni di fluido cerebrospinale artificiale: soluzione di saccarosio A-C-S-F-A-C-S-F per registrazioni voltammetriche e una soluzione modificata di A CSF per la calibrazione dell'elettrodo. Successivamente, trasferire 10 millilitri di A CSF con saccarosio in un piccolo becher e collocarlo in un secchio con ghiaccio. Quindi, mettere l'adesivo istantaneo Loctite in un secchio con ghiaccio.

Successivamente, preparare una lametta e gli strumenti necessari per la dissezione, come pinzette, spatole e forbici, pulendoli con un pad alcolico. Quindi sacrificare un topo per decapitazione ed estrarre rapidamente il cervello. Posizionare il cervello in un becher contenente saccarosio ghiacciato, una soluzione CSF, per circa 10 minuti.

Nel frattempo, preparare il VIBRAM per il taglio. Mettere del ghiaccio tritato nel bagno del campione. Quindi posizionare la camera del campione nel Vibram e fissarla saldamente.

Aggiungere altro ghiaccio attorno alla camera del campione per riempire gli spazi vuoti, facendo attenzione che nessun ghiaccio entri nella camera. Successivamente, inserire una lametta pulita nel portalametta. Quindi riempire la camera del campione con soluzione crioprotettiva di saccarosio fredda di ghiaccio.

Successivamente, versare un po' di soluzione di saccarosio A CSF fredda su un pezzo di carta da filtro posizionato su una piastra di Petri capovolta. Trasferire il cervello di topo appena dissezionato su di essa utilizzando una pinzetta. Quindi rimuovere il cervelletto tagliando lungo l'asse mediale laterale con una lametta da rasoio.

Questo crea una base piatta che può essere fissata al supporto vibram. Successivamente, aggiungere una goccia dell'adesivo Loctite sul supporto del campione. Fissare immediatamente l'estremità piatta del cervello preparato sul supporto, mantenendolo il più possibile in posizione verticale.

Quindi posizionare la piastra nella camera del campione e stringere la vite. Assicurarsi che il cervello sia completamente immerso nella soluzione di saccarosio A CSF presente nella camera. Successivamente, regolare la piastra mediante il controllo in modo che la lama del rasoio sia allineata con la parte superiore del cervello.

I parametri ottimali per il vibratomo si ottengono impostando la frequenza e la velocità su bassa. Successivamente, impostare lo spessore delle sezioni a 400 micrometri. Le prime sezioni di solito non contengono il corpo striato.

Ripetere il taglio fino a ottenere le sezioni contenenti lo striato. Una volta raggiunta la regione AAL dello striato, utilizzare un pennello per sollevare la sezione e posizionarla in un becher contenente soluzione salina artificiale (CSF) ossigenata a temperatura ambiente.

Tipicamente, è possibile ottenere da tre a quattro sezioni contenenti il complesso striato in cui sono inclusi il putamen caudato e il nucleo accumbens. Lasciare che le sezioni si adattino in un liquido CSF saturato con una miscela di 95% O₂ e 5% CO₂ a temperatura ambiente per almeno un'ora prima di procedere con l'esperimento. Per iniziare questa procedura, collegare il tubo alla camera di registrazione per immersione.

Poi pompare il liquido cefalorachidiano A ossigenato a temperatura ambiente al ritmo di un millilitro al minuto. Impostare il controllore di temperatura a 32 gradi Celsius dopo che il liquido cefalorachidiano A ha riempito il supporto per sezioni costruito su misura. Rimuovere eventuali bolle d'aria presenti sotto la maglia utilizzando una siringa con ago.

Crea una pressione negativa nel tubo di efflusso utilizzando una siringa per avviare il flusso e controllare il trabocco del buffer. Posiziona un fazzoletto di carta Kim sul bordo del portacampioni per farlo funzionare da stoppino. Successivamente, trasferisci una sezione al portacampioni nella camera di registrazione, che viene continuamente perfusa con ACSF ossigenata a temperatura ambiente.

Immergere l'elettrodo di riferimento al calomelano d'argento nel portacampioni e collegarlo allo stadio principale mediante una pinza a coccodrillo. Fissare il microelettrodo in fibra di carbonio al micromanipolatore e collegarlo allo stadio principale con una pinza a coccodrillo. Successivamente, abbassare l'elettrodo stimolante al tungsteno e il microelettrodo in fibra di carbonio fino alla superficie della sezione cerebrale sal.

L'elettrodo stimolante verrà utilizzato per somministrare un singolo impulso o impulsi multipli di stimolazione elettrica alla sezione, al fine di indurre il rilascio di neurotrasmettitori e misurare la dopamina evocata elettricamente mediante voltammetria ciclica ad alta velocità di scansione o FSCV, applicando una tensione in forma d'onda triangolare all'elettrodo. Mantenere il potenziale dell'elettrodo microscopico in fibra di carbonio a -0,4 volt. Aumentarlo fino a un limite positivo di 1,2 volt.

Quindi riportarla nuovamente a -0,4 volt a una velocità di scansione di 400 volt al secondo. Stimolare la sezione ogni cinque minuti ed effettuare la misurazione volumetrica del FLX della dopamina risultante per 15 secondi ogni volta, dopo almeno tre stimolazioni. Le registrazioni di rilascio di dopamina stimolato elettricamente stabili sono definite come una differenza inferiore al 10% tra le altezze dei picchi.

Passare alla perfusione della sezione con un liquido CSF contenente l'agente farmacologico di interesse a una portata di un millilitro al minuto per 30 minuti per ottenere un effetto massimale simile alla registrazione di base. Registrare il rilascio elettricamente stimolato di dopamina ogni cinque minuti durante la perfusione farmacologica. La figura A mostra un esempio della misurazione del rilascio di dopamina evocato elettricamente mediante FSCV, successivo a stimolazione con impulso singolo nel corpo striato.

La figura B mostra un grafico tridimensionale a colori pseudocromatici che combina le informazioni provenienti sia dai tracciati della corrente rispetto al tempo sia dalla voltammetria ciclica di Graham. Analogamente, la figura A e la figura C mostrano il rilascio di dopamina indotto da un singolo impulso di stimolazione elettrica rispettivamente nel core e nello shell del nucleo accumbens, e i grafici tridimensionali a colori pseudocromatici relativi al core e allo shell del nucleo accumbens sono indicati rispettivamente nella figura B e nella figura D. Qui sono mostrati i tracciati rappresentativi ottenuti dopo che la sezione era stata trattata con un agente farmacologico per 30 minuti, seguita da stimolazioni a impulso singolo per indurre il rilascio di dopamina nel putamen caudato.

Gli agenti utilizzati negli esperimenti sono la chinolo, la metanfetamina e il fattore neurotrofico derivato dal cervello. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come preparare sezioni coronali cerebrali di topo per ottenere e misurare la dinamica della dopamina presinaptica utilizzando la telemetria rapida e probabilmente attendibile.