Dinamica dopamina presinaptica in fettine di cervello striatale con Fast-scan Voltammetria ciclica

L'obiettivo generale di questa procedura è illustrare un protocollo generale per la telemetria a V ciclica a scansione rapida slice. Ciò si ottiene preparando prima il tessuto cerebrale per il taglio coronale. Quindi gli elettrodi vengono posizionati sulla regione discreta del cervello di interesse.

Il passo successivo consiste nell'erogare la tensione come forma d'onda triangolare attraverso l'elettrodo per rilevare la dopamina. Infine, un agente farmacologico di interesse viene applicato alla fetta di cervello e si osserva il suo effetto sulla dinamica presinaptica della dopamina. In definitiva, questo protocollo mostra cambiamenti nella dinamica della dopamina presinaptica, come il rilascio stimolato di dopamina e i tassi di assorbimento della dopamina attraverso la telemetria a scansione rapida del volume ciclico.

Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulla dinamica presinaptica della dopamina, può anche essere applicato ad altri sistemi, inclusi animali e neurotrasmettitori, come ratti e moscerini della frutta, e serotonina e noradrenalina, dimostrando rispettabilmente che la procedura sarà Francis Mena, MEA Khalid ed Erin oo, gli studenti laureati del mio laboratorio Per iniziare questa procedura, secondo il manoscritto allegato, preparare tre tipi di soluzioni artificiali di liquido cerebrospinale, saccarosio, soluzione A-C-S-F-A-C-S-F per le registrazioni metriche Volta e soluzione A CSF modificata per la calibrazione degli elettrodi. Quindi, trasferisci 10 millilitri di saccarosio A CSF in un piccolo becher e mettilo in un secchiello per il ghiaccio. Quindi posizionare l'adesivo istantaneo Loctite in un secchiello per il ghiaccio.

Successivamente, prepara una lama di rasoio e gli strumenti necessari per la dissezione, come pinze, spatola e forbici strofinandoli con un tampone imbevuto di alcol. Quindi sacrifica un topo per decapitazione e rimuovi rapidamente il suo cervello. Metti il cervello in un bicchiere di saccarosio ghiacciato, A CSF per circa 10 minuti.

Nel frattempo, preparare il VIBRAM per l'affettatura. Mettere del ghiaccio tritato nel bagno del campione. Quindi posizionare la camera del campione nel Vibram e fissarla saldamente.

Aggiungere altro ghiaccio intorno alla camera del campione per riempire gli spazi vuoti e assicurarsi che il ghiaccio non penetri nella camera. Successivamente, posizionare una lama di rasoio pulita nel portalama. Quindi riempire la camera del campione con saccarosio A CSF ghiacciato.

Successivamente, versare un po' di saccarosio A freddo CSF su un pezzo di carta assorbente su una capsula di Petri capovolta. Trasferisci il cervello di topo appena sezionato su di esso con un paio di pinze. Quindi rimuovere il cervelletto tagliando lungo l'asse laterale mediale con una lama di rasoio.

In questo modo si crea una base piatta che può essere fissata al tavolino vibram. Quindi, aggiungere una goccia di adesivo Loctite sul tavolino del campione. Attacca immediatamente l'estremità piatta del cervello preparato sul tavolino e mantienilo il più verticale possibile.

Quindi posizionare lo stadio nella camera del campione e serrare la vite. Assicurarsi che il cervello sia completamente immerso nel saccarosio A CSF nella camera. Successivamente, regola il tavolino con il controllo in modo che la lama del rasoio sia allineata con la parte superiore del cervello.

I parametri ottimali per il vibratore si ottengono impostando la frequenza e la velocità su un valore basso. Quindi, impostare lo spessore della fetta su 400 micrometri. Le prime fette di solito non contengono lo striato.

Ripetete l'affettatura fino ad ottenere le fette contenenti lo striato. Una volta raggiunta la regione stri AAL, con un pennello sollevare la fetta con un pennello e metterla in un bicchiere a temperatura ambiente ossigenata. Un liquido cerebrospinale.

Tipicamente, si possono ottenere da tre a quattro fette contenenti il complesso tesale in cui sono inclusi il putamen caudato e il nucleo accumbens. Lasciare acclimatare le fette in A CSF gorgogliando con 95%O2 5%CO2 a temperatura ambiente per almeno un'ora prima di procedere con l'esperimento. Per iniziare questa procedura, collegare il tubo alla camera di registrazione dell'immersione.

Quindi pompare il liquido cerebrospinale ossigenato a temperatura ambiente alla velocità di un millilitro al minuto. Impostare il regolatore di temperatura su 32 gradi Celsius dopo che A CSF ha riempito il portafette personalizzato. Rimuovere eventuali bolle d'aria sotto la rete utilizzando una siringa ad ago.

Creare una pressione negativa nel tubo di deflusso con una siringa per avviare il flusso per controllare il trabocco del tampone. Posiziona una salvietta Kim sul bordo del porta fette per fungere da stoppino. Quindi trasferire una fetta nel portafette nella camera di registrazione, che viene continuamente perfusa con A CSF ossigenato a temperatura ambiente.

Immergere l'elettrodo di riferimento in cloruro d'argento e argento nel supporto per fette e collegarlo allo stadio principale con una clip a coccodrillo. Collegare il micro elettrodo in fibra di carbonio al micromanipolatore e collegarlo allo stadio della testa con una clip a coccodrillo. Quindi, abbassare l'elettrodo stimolante il tungsteno e il microelettrodo in fibra di carbonio sulla superficie della fetta di cervello sal.

L'elettrodo stimolante verrà utilizzato per erogare un singolo impulso o più impulsi di stimolazioni elettriche alla fetta per evocare il rilascio del neurotrasmettitore per misurare la dopamina evocata elettricamente utilizzando la telemetria vol ciclica a scansione rapida o FSCV, applicare la tensione in una forma d'onda triangolare all'elettrodo. Mantenere il potenziale del microelettrodo in fibra di carbonio a 0,4 volt negativi. Rampa fino a un limite positivo di 1,2 volt.

Quindi riportarlo a 0,4 volt negativi a una velocità di scansione di 400 volt al secondo. Stimolare la fetta ogni cinque minuti ed effettuare la misurazione vol metrica della dopamina FLX risultante per 15 secondi ogni volta dopo almeno tre. Registrazioni stabili di rilascio di dopamina stimolate elettricamente definite come meno del 10% di differenza tra le altezze di picco.

Passare alla perfusione della fetta con un liquido cerebrospinale contenente un agente farmacologico di interesse a una velocità di flusso di un millilitro al minuto per 30 minuti per ottenere un effetto massimo simile alla registrazione di base. La dopamina stimolata elettricamente viene rilasciata ogni cinque minuti durante la perfusione farmacologica. La Figura A è un esempio della misurazione del rilascio di dopamina evocata elettricamente utilizzando FSCV, a seguito di stimolazione a singolo impulso nel putamen caudato.

La Figura B mostra un grafico tridimensionale a pseudo colori che combina le informazioni provenienti sia dalle tracce di corrente rispetto a quelle temporali che dal volt ciclico di Graham. Allo stesso modo, le figure A e C mostrano il rilascio di dopamina evocato da un singolo impulso di stimolazione elettrica rispettivamente nel nucleo accumbens e nel guscio, e i grafici tridimensionali pseudo colori per il nucleo accumbens e il guscio sono indicati rispettivamente nella figura B e D. Qui sono mostrate le tracce rappresentative dopo che la fetta è stata trattata con un agente farmacologico per 30 minuti, seguita da stimolazioni a singolo impulso per evocare il rilascio di dopamina nel putamen caudato.

Gli agenti utilizzati negli esperimenti sono chinolo, metanfetamina e fattore neurotrofico derivato dal cervello. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come preparare fette di cervello coronale di topo per ottenere e misurare la dinamica della dopamina presinaptica utilizzando la telemetria veloce e probabilmente volontà.