Rilevamento di ipossia microregionale nella corteccia cerebrale di topo Imaging a due fotoni di fluorescenza endogena NADH

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di visualizzare direttamente l'ipossia tissutale microregionale nella corteccia del topo in vivo. Ciò si ottiene preparando prima una finestra cranica aperta del cranio in un topo anestetizzato. Successivamente, il colorante fluorescente viene iniettato per via endovenosa per marcare i vasi sanguigni cerebrali.

Infine, viene eseguito in concomitanza con l'imaging fotonico della fluorescenza intrinseca del NADH e della microvascolarizzazione corticale marcata in fluorescenza. In definitiva, si possono ottenere risultati che mostrano l'ipossia funzionale nelle micro regioni del parenchima cerebrale attraverso la visualizzazione della presenza della forma ridotta di nicotinamide, adenina dinucleotide. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come gli elettrodi in stile Clark è che offre un'elevata risoluzione speciale sull'ampio campo visivo ed è anche meno invasiva.

Questo metodo può essere condotto su un sistema standard applicato a due foto con due canali fluorescenti. Ciao, sono Steve Hurst, professore e presidente di microbiologia e immunologia presso l'Università di Rochester, a dimostrare che la procedura oggi sarà il figlio di Anita del Laboratorio Kishka, così come Oxana Paulka, un assistente professore di ricerca del mio laboratorio, il Dr.Kishka, che ha aperto la strada alla tecnica di imaging NADH, non può essere qui oggi perché si è recentemente trasferito in Germania. Dopo aver preparato il sito chirurgico con gli strumenti necessari che sono stati sterilizzati in autoclave o disinfettati con etanolo al 70% e il topo è stato anestetizzato con il 5% di fluoro, posizionarlo su un termoforo e applicare una maschera facciale per erogare dall'1,3 all'1,5% di fluoro nell'aria.

Controllare il livello di anestesia eseguendo un pizzico di coda. Successivamente, inserire una sonda rettale e misurare continuamente la temperatura corporea dell'animale durante tutta la procedura. Applicare il gel lacrimale artificiale sugli occhi del topo per evitare che si secchino.

Quindi rimuovere i peli dalla testa ed entrambe le cosce applicare il depilatore sulla coscia per due minuti per rimuovere i peli rimanenti, la coscia verrà utilizzata per l'ossimetria. Infine, disinfettare il cuoio capelluto utilizzando una soluzione di iodio povidone al 10% e etanolo al 70%. Per realizzare una finestra cranica a partire da cinque millimetri si coccola al cranio con le forbici.

Fai un'incisione nel cuoio capelluto e avanza di un centimetro. Spostare la pelle ai lati per esporre il cranio Per rimuovere le membrane sulla parte superiore del cranio. Applicare una soluzione di cloruro ferrico al 10%.

Asciugare la soluzione in eccesso e raschiare via le membrane con un angolo di 45 gradi. Numero cinque, pinzette Utilizzando un microscopio da dissezione, identificare l'area di interesse. Applicare un sottile strato di colla rapida attorno ai bordi della finestra della piastra di testa.

Posizionare la piastra di testa in modo tale che l'area di interesse sia esposta nella finestra e applicare una leggera pressione sulla piastra di testa. Applicare una piccola quantità di cemento dentale per polimerizzare rapidamente la colla. Tenere premuto per 10 secondi mentre la colla si polimerizza.

Applicare una piccola quantità di colla rapida sui bordi della finestra per sigillare la piastra della testa e il cranio. Quindi avvitare la piastra della testa al supporto dell'animale sotto il cannocchiale di dissezione. Utilizzando il set di due punte micro torque a 6, 000 giri/min e la punta IRF 0 0 5

Rimuovi tutta la colla in eccesso dal cranio e dalla piastra della testa. Quindi imposta il trapano a mille giri al minuto e inizia a perforare il teschio facendo un cerchio all'interno della finestra della piastra di testa con un diametro di circa cinque millimetri. Usa movimenti leggeri e ampi come se stessi disegnando con una matita molto morbida.

Interrompere la perforazione ogni 20-30 secondi e utilizzare aria compressa per rimuovere la polvere ossea. Man mano che la perforazione procede, si forma una tana attorno al cranio intatto al centro. Fai attenzione a non infilare il cranio sottile, ma ad assicurarti che questa tana sia di spessore uniforme.

Inoltre, fai molta attenzione ai vasi sanguigni di grandi dimensioni. Non dovrebbero essere compromessi e, se possibile, nemmeno toccati Con un polo di una pinzetta, sollevare l'osso al centro della finestra e applicare una goccia di liquido cerebrospinale artificiale sulla finestra. Usando l'angolo di una salvietta Kim, rimuovere delicatamente il liquido cerebrospinale artificiale utilizzando un angolo di 45 gradi.

Numero cinque, pinzette. Individua una regione di dura dura danneggiata lungo il bordo della finestra e sollevala per rimuoverla. Se si verifica un'emorragia, applicare una goccia di liquido cerebrospinale artificiale e attendere due o tre minuti affinché l'emorragia minore si fermi.

Successivamente, preparare 10 millilitri di aero a basso punto di fusione allo 0,07% disciolto nel liquido cerebrospinale artificiale. Porta l'aerodinamica sciolta alla temperatura corporea. Elimina il liquido cerebrospinale artificiale in eccesso dalla superficie del cervello.

Versare l'aero nella finestra e coprirla con uno scivolo di vetro. Quindi premere delicatamente il vetro per entrare in contatto tra il vetro e la piastra di testa e attendere da 10 a 20 secondi fino a quando l'aerodinamica non è solida. Usando una pinzetta e carta velina morbida, rimuovi l'aerodinamica in eccesso dal coperchio di vetro.

Metti una piccola quantità di colla rapida attorno al vetro per incollarlo alla piastra di testa. Quindi applicare una piccola quantità di cemento dentale per solidificare la colla da iniettare nella vena femorale. Capovolgere parzialmente l'animale per esporre l'interno della coscia sinistra.

Usa del nastro adesivo per fissare l'animale. In questa posizione, applicare uno scrub antisettico e quindi una quantità di etanolo al cento per cento sulla pelle. Successivamente, praticare un'incisione lungo la coscia mediale dal ginocchio alla sintesi pubica.

Se necessario, separare i tessuti molli mediante dissezione smussata. Riempi una siringa da un millilitro con 130 microlitri di rosso del Texas. Attacca un nuovo ago calibro 30 e piegalo con cura con un angolo di 30 gradi, mantenendo lo smusso verso l'alto.

Riempire l'ago con Texas Red Solution al microscopio da dissezione, inserire l'ago nella vena femorale e iniettare un centinaio di microlitri di Texas Red. Rimuovere l'ago e premere leggermente la vena con una garza per fermare l'emorragia. Chiudere la pelle utilizzando quattro suture per il monitoraggio continuo della saturazione di ossigeno nel sangue.

Posizionare la sonda dell'ossimetro sulla coscia destra da cui sono stati precedentemente rimossi i peli. Per iniziare l'imaging, trasferire il topo preparato chirurgicamente sul tavolino del microscopio. Scattare una foto iniziale del sito della finestra cranica utilizzando l'illuminazione in campo chiaro a quattro ingrandimenti x da utilizzare come mappa di riferimento per la registrazione con un ingrandimento maggiore ai fotonici.

Ingrandisci l'area di interesse utilizzando l'ingrandimento 10x. Selezionare un'area di interesse negli strati corticali. Uno o due iniziano a registrare la serie temporale.

Si consiglia di utilizzare in media da tre a cinque fotogrammi per aumentare la qualità dell'immagine. Successivamente, induci l'ipossiemia aggiungendo il 50% di azoto all'aria che l'animale respira. Questo porterà il livello di ossigeno al 10%Verificare l'ipossiemia monitorando i dati dell'ossimetro.

Continuare a registrare le serie temporali attraverso l'ipossiemia per circa 30 secondi e dopo che il normale livello di ossigeno è stato ripristinato. Raccogli dati per il calcolo della distribuzione dell'ossigeno rilevando, misurando e quantificando l'area dell'ipossia e i cilindri di tessuto ossigenato attorno ai vasi sanguigni. Per determinare il raggio del cilindro del tessuto graciante R, misurare la distanza tra il centro del vaso sanguigno e il confine al quale viene rilevata un'elevata fluorescenza di NADH.

Fare riferimento al protocollo scritto per i metodi di trattamento dei dati. Questa figura mostra le immagini geografiche concomitanti del NADH da video registrati durante l'ipossiemia transitoria, la concentrazione di ossigeno inspirato è stata abbassata dal 21% al 10% per un periodo di tre minuti. Questo livello di ipossiemia indotta sperimentalmente è sufficiente per indurre una grave ipossia nella corteccia cerebrale.

L'ipossia ha portato ad un aumento della fluorescenza del NADH mostrata in verde inizialmente nelle aree più lontane dall'afflusso di sangue arterioso. Si noti i confini netti del tessuto NADH, che rappresentano i confini tissutali osservabili della diffusione dell'ossigeno dalla microcircolazione corticale mostrati in rosso. Ecco un'immagine concomitante dei microvasi marcati in fluorescenza della corteccia in rosso e della fluorescenza intrinseca del NADH dalla materia grigia della corteccia in verde, la distribuzione dell'intensità della fluorescenza del NADH è binaria.

Ci sono aree con fluorescenza NADH uniformemente bassa e aree con fluorescenza NADH uniformemente alta. Le linee gialle rappresentano i confini tissutali tra le aree con bassa e alta fluorescenza di NADH. Questi confini tissutali mostrano una relazione spaziale con i microvasi vicini.

Questa relazione è determinata dalla diffusione dell'ossigeno dai microvasi nel tessuto. In alcuni casi, la natura cilindrica o il cilindro tissutale CRO di questi confini tissutali può essere riconosciuta direttamente, come indicato dalle linee blu. Qui, il confine del tessuto è di forma circolare con un vaso sanguigno centrale concentrico Una volta padroneggiato.

Questa tecnica può essere eseguita in 1,5 ore se eseguita correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordarsi di incollare il vetro di copertura alla piastra metallica per evitare il movimento verticale della superficie corticale dovuto all'edema. A seguito di questa procedura, è possibile eseguire ulteriori analisi, come le misurazioni dell'iperemia funzionale, con l'obiettivo di affrontare ulteriori questioni, come la relazione tra ipossia tissutale e accoppiamento cerebrovascolare.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come visualizzare l'ipossia del tessuto microregionale nella corteccia del topo.