Annotazione della funzione impianto Gene via Genomics combinati, la metabolomica e Informatica

L'obiettivo generale del seguente esperimento è scoprire e caratterizzare nuove funzioni geniche utilizzando l'annotazione genica tramite analisi combinata del profilo dei metaboliti e dell'analisi di co-espressione. Questo risultato si ottiene considerando il disegno sperimentale con un focus su particolari vie metaboliche e specie vegetali. Come secondo passaggio, si utilizzano approcci analitici per ricostruire l'intera via metabolica sulla base delle strutture chimiche dei composti rilevati.

Successivamente, la struttura del percorso predetto viene integrata con l'analisi di co-espressione al fine di restringere i geni candidati, che presumibilmente indicano i geni chiave del metabolismo. In definitiva, i risultati si ottengono eseguendo un numero minimo di esperimenti con un uso efficiente di diverse risorse biologiche al fine di caratterizzare l'identificazione funzionale dei geni. Abbiamo avuto per la prima volta l'idea di questo metodo quando abbiamo riscontrato una correlazione molto elevata tra i geni cistici Abosi OID nel database di co-espressione denominato ate.

Abbiamo ritenuto che questa strategia rappresenti uno dei modi più rapidi per individuare le funzioni di nuovi geni grazie all'utilizzo di dati disponibili pubblicamente in banche dati e all'efficace impiego delle risorse biologiche. Per iniziare l'estrazione, raccogliere i materiali vegetali e congelarli immediatamente in azoto liquido. Una volta ottenuta una polvere congelata, utilizzare un mulino mescolatore per suddividere il materiale vegetale congelato in aliquote da due millilitri in provette EOR, quindi aggiungere una sfera metallica in ciascuna provetta.

Aggiungere 250 microlitri di tampone di estrazione per ogni 50 milligrammi di campione. Il tampone di estrazione contiene lo standard interno per la normalizzazione. Successivamente, omogeneizzare la polvere congelata con il mulino mescolatore per due minuti.

A una frequenza di 25, centrifugare il campione a 12.000 giri/min per 10 minuti. Trasferire quindi il soprannatante in un filtro centrifugo. Dopo aver eseguito un secondo ciclo di centrifugazione, trasferire il soprannatante in un nuovo tubo einor.

Successivamente, configurare la HPLC verificando innanzitutto che la temperatura del fornetto della colonna sia di 35 gradi Celsius e quella del vassoio del campione sia di 10 gradi Celsius. Impostare le condizioni di spettrometria di massa e verificare lo stato del vuoto e del capillare riscaldante. Eseguire una calibrazione del rapporto massa/carica del rivelatore MS mediante iniezione per infusione della miscela di soluzione di calibrazione.

Utilizzare l'applicazione automatica di calibrazione nel software. Successivamente trasferire 50 microlitri degli estratti in un vial di vetro. Per la HPLC, eseguire almeno cinque iniezioni del buffer di estrazione prima di procedere all'analisi del primo campione, come descritto nella procedura scritta.

Dopo aver configurato uno strumento di analisi mediante spettrometria di massa, selezionare i dati da elaborare. Preparare una tabella dei picchi rilevati di interesse in conformità alla classe di composti indicata nel protocollo scritto. Identificare i picchi mediante co-eluizione con composti standard, annotare i picchi rilevati utilizzando l'analisi Ms.MS, la letteratura scientifica, indagini e la ricerca in banche dati di metaboliti in questo passaggio.

La previsione del percorso metabolico dovrebbe basarsi sulle strutture chimiche, collegando la funzione enzimatica al percorso metabolico. Pertanto, questi passaggi devono essere eseguiti mediante un'accurata identificazione dei composti rilevati. Database di percorsi metabolici generali, come il database KEGG e PlantCyc, sono molto efficaci per la previsione del percorso metabolico di interesse.

Per preparare un elenco di geni con geni ortologhi di Arabidopsis, ID scaricare prima un elenco di ID genici dal database genomico. Aggiungere l'ID genico di Arabidopsis dei geni ortologhi nel caso in cui la pianta bersaglio non sia Arabidopsis. Quindi preparare un elenco dei geni nel percorso di interesse.

Le annotazioni relative ai dati sulle vie metaboliche di Arabidopsis e ai dati sulle famiglie geniche sono disponibili sul sito web TAAR. È possibile successivamente combinare gli elenchi di geni ortologhi di Arabidopsis. Eseguire un'analisi della rete di co-espressione utilizzando l'elenco preparato di identificatori genici per cercare nel database più adatto il percorso predetto.

Verifica della correlazione tra coppie di geni ben noti nel percorso d'interesse. Se il database di co-espressione o il database di espressione genica non sono disponibili, nel piano d'interesse si dovrebbe utilizzare il database di co-espressione di Arabidopsis insieme a un elenco di geni omologhi di Arabidopsis.

Successivamente, costruire la struttura della rete di co-espressione bersaglio, basandosi sulle connessioni dei geni ben noti nel percorso d'interesse. Aggiungere i geni candidati correlati e verificare la loro annotazione genica nelle famiglie previste rispetto alle connessioni di questa rete, al fine di identificare il miglior candidato.

La soglia dei geni per il valore del coefficiente deve essere coordinata in base alla struttura della rete e alla densità dei geni correlati. Creare ora un elenco di geni che possono essere ridotti a quelli specializzati nel percorso target. Utilizzando questo elenco, verificare l'espressione genica relativa alle specificità organiche e alle risposte allo stress dei geni candidati.

Iniziare l'integrazione delle informazioni aggiungendo geni ben caratterizzati, utilizzati come query per l'analisi di co-espressione, al percorso metabolico predetto. Effettuare una ricerca bibliografica per verificare se le parti non caratterizzate di questo percorso sono nuove, inclusi passaggi enzimatici non caratterizzati, proteine di trasporto e fattori di trascrizione. A questo punto, prevedere l'annotazione genica più adatta per questi passaggi mancanti e non caratterizzati.

Combinare i risultati del profilo dei metaboliti e dei geni candidati derivati dall'espressione genica in silico basata sul percorso predetto. Successivamente, posizionare i geni candidati lungo il percorso predetto in base alla funzione genica. Ad esempio, acetiltransferasi per il metabolita acetilato, glicosiltransferasi per il glicoside e P450 per il composto ossidato.

Verificare la coerenza tra specificità tissutali o risposte a stress nell'accumulo di metaboliti e nel livello di espressione genica dei geni candidati. Inoltre, analizzare i collegamenti con altri percorsi metabolici per fornire substrati e geni coinvolti nella risposta a stress. Come passaggio finale, eseguire un esperimento per l'identificazione della funzione genica utilizzando bio-risorse come una libreria di mutanti knock-out e una libreria di cDNA a lunghezza completa. Illustrato.

Di seguito è riportato un esempio di analisi della rete di co-regolazione del percorso degli antociani. Le analisi di co-espressione sono state eseguite utilizzando l'indice di co-espressione PRAM basato sul dataset della versione aggiunta tre con il programma PX, mostrato come nodi rossi; sono stati utilizzati 12 geni enzimatici degli antociani e due fattori trascrizionali per la produzione di antociani al fine di ricercare geni candidati. Una rete di co-espressione composta da 68 geni candidati correlati e 14 geni di interrogazione è stata ricostruita mediante l'interconnessione dell'analisi dell'insieme utilizzando il database prime, ottenendo file di output T net che sono stati rappresentati graficamente mediante il software PX.

I nodi blu indicano i geni candidati che hanno mostrato correlazione con i geni delle antocianine dopo il loro sviluppo. Questa strategia ci fornirà un'ottima indicazione per prevedere nuove funzioni geniche nel metabolismo vegetale.