Analisi della posizione ciclo cellulare nelle cellule di mammifero

Lo scopo di questa procedura è determinare la proporzione di cellule nelle diverse fasi del ciclo cellulare. Questo viene ottenuto aggiungendo innanzitutto il reagente di marcatura della proliferazione cellulare BRDU a una coltura cellulare vitale, in modo che venga incorporato nel DNA appena sintetizzato; successivamente, il BRDU presente nelle cellule che hanno incorporato il reagente viene marcato, quindi il DNA viene colorato con ioduro di propidio. L'ultimo passaggio consiste nel valutare la proporzione di cellule nelle diverse fasi del ciclo cellulare mediante citometria a flusso.

Alla fine, la distribuzione del ciclo cellulare in una popolazione di cellule sperimentali può essere visualizzata mediante analisi citofluorimetrica di cellule marcate con BRDU. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come l'incorporazione di trizio nella timidina e il conteggio con scintillazione, è che con la marcatura BRD è possibile determinare la proporzione di cellule in ciascuna fase del ciclo cellulare. La dimostrazione visiva di questo concetto è fondamentale, poiché l'analisi citofluorimetrica risulta difficile da spiegare senza immagini a corredo che mostrino i diversi parametri da regolare.

La procedura sarà dimostrata da due studenti laureati del mio laboratorio, Matt Chii e io, Miri. Aggiungere BRDU in una diluizione 1:1000 alle colture cellulari sperimentali, incubare per un'ora, raccogliere le cellule, aspirare il mezzo di coltura e quindi lavare accuratamente le cellule due volte con PBS per rimuovere ogni traccia di mezzo. In questo passaggio, utilizzando PBS supplementato con tre millimoli di EDTA, risciacquare rapidamente le colture una volta in più, quindi aspirare completamente la soluzione P-B-S-E-D-T-A per staccare le cellule.

Aggiungere circa 0,5 millilitri di P-B-S-E-D-T-A in ogni piastra di coltura da sei centimetri e incubare le piastre a 22 gradi Celsius per circa cinque minuti. Successivamente, trasferire le colture cellulari da ciascuna piastra in provette coniche individuali da 15 millilitri. Centrifugare ora le cellule a 500 ×g per cinque minuti a temperatura ambiente, quindi rimuovere il sopranatante e risospendere le cellule in 100 microlitri di PBS.

Infine, fissare le cellule aggiungendo cinque millilitri di etanolo al 95% in modo goccia a goccia mentre si vortecchia, centrifugando le cellule a 500 ×g per cinque minuti a temperatura ambiente. Rimuovere nuovamente l'etanolo e risospendere il pellet in un millilitro di HCl 2 N contenente 0,5% di Triton X-100, aggiungendo la soluzione alle cellule in modo goccia a goccia mentre si vortecchia; quindi incubare le cellule a temperatura ambiente per 30 minuti. Dopo aver nuovamente formato il pellet, aspirare il sopranatante S, avendo particolare cura poiché in questo passaggio le cellule formano un pellet molto fragile.

Quindi risospendere delicatamente il pellet in un millilitro di borato di sodio 0,1 molare e incubare nuovamente le cellule. Adesso centrifugare nuovamente le cellule e questa volta incubarle in 0,5 millilitri di soluzione anticorpale contenente anticorpi monoclonali anti-BRDU di topo diluiti 1:50. Dopo aver nuovamente centrifugato le cellule, risospendere il pellet in 50 microlitri di soluzione anticorpale contenente anticorpi secondari coniugati anti-US ZI di coniglio, diluiti 1:25.

Quindi, incubare le cellule al buio per 30 minuti a temperatura ambiente. Dopo la centrifugazione finale, incubare le cellule in 0,5 millilitri di soluzione di ioduro di propidio e RNA al buio a 37 gradi Celsius per 30 minuti. Infine, far passare la soluzione cellulare digerita attraverso un filtro cellulare per rimuovere gli aggregati.

Quindi trasferire le cellule singole in un tubo appropriato per il caricamento del campione nel citofluorimetro per popolazioni cellulari che proliferano in modo asincrono, come quella mostrata. In questo esempio, posizionare una finestra (gate) attorno ai due picchi più abbondanti nel grafico di discriminazione dei doppietti per selezionare gli eventi di cellule singole per tutte le analisi successive. Successivamente, analizzare un campione di coltura che prolifera in modo asincrono, da utilizzare come controllo positivo per la colorazione e l'impostazione dei parametri del citofluorimetro.

Regolare la sensibilità del tubo fotomoltiplicatore per la colorazione con ioduro di propidio in modo che i picchi corrispondenti alle cellule con contenuto N e 4N siano centrati rispettivamente sui valori arbitrari di 200 e 400 sull'asse x. Successivamente, regolare la sensibilità del tubo fotomoltiplicatore per il rilevamento di FXI in modo che le cellule negative per FXI siano al di sopra dei livelli di fondo. Le cellule positive per BRDU dovrebbero essere circa 10 volte più luminose e l'asse x deve essere visualizzato in scala logaritmica.

Gli eventi singoli catturati dal citometro a flusso formano un arco a forma di ferro di cavallo che parte dalla fase G1 in basso a sinistra, passa attraverso la fase S e ritorna in basso a destra per la fase G2/M. Come mostrato in questa figura rappresentativa, raccogliere da 5.000 a 10.000 eventi cellulari singoli per ottenere l'intervallo desiderato di contenuto di DNA. Dopo aver misurato il contenuto di ioduro di propidio e di BrdU, assegnare le cellule alle fasi G1, S o G2/M tracciando delle porte intorno alle due popolazioni negative per BrdU, centrate rispettivamente su 200 per la fase G1 e su 400 per la fase G2/M. Includere tutti gli eventi al di sopra di queste due aree in una singola porta per la misurazione della fase S; la percentuale di cellule in ciascuna porta rappresenterà il numero relativo di cellule nelle fasi G1 e G2/M, come dimostrato in questo grafico a barre relativo alla precedente figura di scatterplot.

Dopo la colorazione per un marcatore cellulare di interesse, in questo esempio CD20, centrifugare le cellule a 500 ×g per 10 minuti a 22 °C, quindi risospendere il pellet in cinque millilitri di PBS integrato con 1% di BSA. Dopo aver nuovamente pelletizzato le cellule a 500 ×g per cinque minuti a temperatura ambiente, utilizzare 0,5 millilitri della soluzione di ioduro di propidio e RNA per reidratare le cellule. Quindi colorare e digerire le cellule come appena mostrato, selezionare i picchi cellulari singoli diploidi e tetraploidi, quindi regolare la sensibilità del fotomoltiplicatore per la rilevazione di FXI in modo che le cellule non colorate siano al di sopra dei livelli di fondo.

In linea ideale, le cellule CD 20 FXI positive devono essere colorate da 10 a 100 volte più intensamente rispetto allo sfondo. Ancora una volta, l'asse x deve essere visualizzato su scala logaritmica. Infine, selezionare le cellule CD 20 positive che risultano 10 volte più luminose rispetto ai livelli di fondo e con una colorazione al propidio ioduro compresa tra 200 e 400, da mostrare in un istogramma di propidio ioduro contro il numero di cellule, come illustrato in questo esempio di figura; raccogliere almeno 1000 eventi CD 20 positivi per ogni campione per limitare la variabilità in questo grafico.

Viene mostrata l'analisi tridimensionale mediante citometria a flusso delle cellule colorate con ioduro di propidio e BRDU. Si noti che le cellule con contenuto di DNA 2n e 4n sono centrate rispettivamente sui valori 200 e 400 della scala dell'asse X. L'intensità della colorazione per lo ioduro di propidio e l'intensità della colorazione per BRDU vengono misurate su una scala logaritmica.

Sull'asse Y, osservare le posizioni dei gate utilizzati per quantificare le cellule nelle fasi G1 e G2/M del ciclo cellulare. La proporzione relativa delle cellule in ciascuno dei gate G1 e G2/M della figura precedente è mostrata qui. Qui, propidio, ioduro e CD20.

Viene mostrata la colorazione di una miscela di cellule, alcune delle quali esprimono in modo ectopico CD20 e PRB. Si noti che le cellule con 2n e 4n DNA, le popolazioni più abbondanti, sono centrate rispettivamente sui valori 200 e 400 dell'asse x. La posizione delle cellule positive per CD20 selezionate corrisponde a quelle colorate almeno 10 volte più intensamente rispetto al fondo.

Questo istogramma rappresenta il numero di cellule in funzione della colorazione con ioduro di propidio per le cellule CD20 negative provenienti dal precedente diagramma a dispersione che proliferano in modo asincrono; in questo istogramma sono mostrate anche le cellule CD20 positive del precedente diagramma a dispersione CD20 che sono state indotte all'arresto mediante espressione di pRRB e che contengono cellule con un contenuto di DNA principalmente diploide. Questi dati dimostrano che una sottopopolazione arrestata può essere distinta dalle altre cellule in coltura mediante questa tecnica di colorazione. Nelle prossime tre figure, sono mostrati i dati dell'analisi citometrica in flusso dell'espressione retrovirale dell'inibitore della chinasi dipendente da ciclina p27KIP1 in fibroblasti embrionali murini.

È stato utilizzato l'analisi con ioduro di propidio e BRDU per misurare le fasi del ciclo cellulare in una popolazione di cellule che proliferano in modo asincrono e che sono state trasdotte con un vettore retrovirale P babe vuoto, come mostrato qui. Sono evidenti pochi eventi positivi al BRDU nella finestra della fase S in risposta a P 27. Si noti inoltre la maggiore intensità degli eventi nelle finestre G uno e G due M.

Allo stesso modo, la percentuale di cellule in fase S per le cellule che esprimono P 27 è piuttosto bassa, come illustrato in questa figura. Questo tipo di analisi si è rivelato molto efficace nel caratterizzare i deficit del controllo del ciclo cellulare in cellule derivate da diverse linee di topi con geni modificati. Nelle prossime due figure, cellule epiteliali della memoria non formate sono state trattate con la citochina inibitoria della crescita TGF beta uno per 24 ore.

Come mostrato in questa prima figura, l'etichettatura con BRDU nelle cellule in fase S è fortemente ridotta dal segnale del TGF beta uno. Si noti l'accumulo di cellule principalmente nella fase G uno del ciclo cellulare, come si può osservare nel pannello centrale. La quantificazione delle diverse fasi del ciclo cellulare conferma che il TGF beta uno inibisce principalmente la proliferazione nella fase G uno del ciclo cellulare, portando a un accumulo in questa fase.

In quest'ultima serie di analisi sperimentali, cellule SAS due carenti di PRB sono state trasfettate con un vettore di espressione CMV CD 20 e con CMV RB oppure con CMV beta GAL come controllo. Questa prima figura mostra la distribuzione del ciclo cellulare delle cellule trasfettate con il controllo negativo rispetto alla loro distribuzione dopo 72 ore di espressione di PRB. Si noti la presenza quasi esclusiva di un picco a due N nel pannello destro; l'analisi delle curve mediante software multi-cycle ha rivelato che le cellule si accumulano principalmente nella fase G uno dopo l'espressione di PRB.

Sebbene le popolazioni nelle fasi s e G due M fossero relativamente ridotte. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere adattata per studiare altri marcatori del ciclo cellulare, come le istoni fosforilate in mph. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come determinare la distribuzione del ciclo cellulare in una popolazione di cellule.

Non dimenticare che l'acido cloridrico concentrato è caustico e il propidio ioduro è un potenziale agente cancerogeno. Possono essere pericolosi in caso di contatto.

Si devono sempre prendere precauzioni durante l'uso di questi prodotti chimici.