Name: Analisi della posizione ciclo cellulare nelle cellule di mammifero (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-01-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 19 s
Description: Impara a determinare la posizione del ciclo cellulare nelle cellule di mammifero mediante citometria a flusso con marcatura BRDU e ioduro di propidio. Questo protocollo consente di quantificare accuratamente le cellule nelle fasi G1, S e G2/M.

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Gli autori desiderano ringraziare il Canadian Institutes of Health Research (CIHR) e la Canadian Cancer Society per il finanziamento ricerca sul ciclo cellulare nel loro laboratorio. MJC è un destinatario di un MD / PhD borsa di studio della CIHR. MJC e MA sono membri del programma di formazione CaRTT.

1. Etichettatura e di fissaggio delle cellule <ol><li> Aggiungere 1 ml di reagente Etichettatura proliferazione cellulare (BrdU) per ml di mezzo di coltura cellulare (1-1000 diluizione) 1 ora prima della raccolta. Il periodo di etichettatura potrebbe essere necessario allungare di cellule in crescita più lenta. </li><li> Alle cellule raccolto, terreno di coltura aspirare e lavare accuratamente con tampone fosfato (PBS). Ripetere l'operazione per rimuovere completamente le tracce di terreno. </li><li> Lavare rapidamente le culture per la terza volta con PBS contenente 3mM EDTA ed aspirare accuratamente. </li><li> Aggiungere un piccolo volume di PBS contenente 3mM EDTA per ogni piatto, 0,5 ml per un piatto di 6 centimetri è l'ideale. Incubare a 22 ° C per circa 5 minuti per staccare le cellule. Trasferire in un tubo da 15 ml. </li><li> Cellule centrifugare a 500 xg per 5 minuti per far sedimentare, rimuovere il surnatante, e risospendere completamente in 100 ml di PBS. </li><li> Fissare le cellule con l'aggiunta di 5 mL di EtOH 95%, goccia a goccia, mentre vortex. A questo punto, le cellule possono essere conservati a 4 ° C per almeno unmese. </li></ol> 2. Denaturazione e colorazione di BrdU e del DNA <ol><li> Centrifugare le cellule a 500 xg per 5 minuti alle cellule precipitato ed eliminare l'95% EtOH. Risospendere in 1 ml di HCl 2N e 0,5% Tx-100 con l'aggiunta in modo goccia a goccia mentre vortex. Incubare a temperatura ambiente per 30 minuti. </li><li> Centrifugare come prima nella sezione 2.1 e aspirare il surnatante con cura poiché le cellule formano un pellet molto sciolto in questa fase. Delicatamente risospendere in 1 ml di 0.1M NaB 4 O 7 (pH 8,5) e incubate per almeno 30 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Cellule pellet come sopra nella sezione 2.1 e risospendere in 0,5 mL di soluzione di anticorpi (PBS contenente BSA 1% e 0,2% di Tween-20) con il mouse anticorpi anti-BrdU diluito 1 a 50. Incubare a temperatura ambiente per 30 minuti. </li><li> Celle a pellet di nuovo e risospendere in 50 mL di soluzione contenente anticorpi di coniglio anti-topo anticorpi secondari coniugati con FITC diluito 1 a 25. Incubare per 30 minutida banco e proteggere dalla luce. </li><li> Centrifugare le cellule un'ultima volta e risospendere in 0,5 ml di ioduro di propidio e RNasi soluzione (PI-RNAse soluzione PBS con BSA 1%, 10 mg / mL di ioduro di propidio, 0,25 mg / ml RNasi A) e incubare al buio a 37 ° C per 30 minuti. In alternativa l'RNA può essere digerito notte a 4 ° C al buio. </li><li> Passare la soluzione attraverso un colino per eliminare aggregati di cellule e raccogliere singole cellule in un apposito tubo per l'assorbimento del campione sul citofluorimetro. Anche in questo caso, i campioni devono essere protetti dall'esposizione diretta alla luce. </li></ol> 3. Analisi mediante citometria di flusso <ol><li> Le cellule devono essere analizzati con un citometro a flusso standard che è in grado di discriminare doppiette (due celle che passano attraverso la cella di flusso come uno) con capacità di rilevamento appropriati per FITC e ioduro di propidio. Singole cellule possono essere rilevati in questa applicazione citometria a flusso di gating per gli eventi sulla base di scatter in avanti e laterale pop dispersionementari, e utilizzando le proprietà di colorazione del DNA con ioduro di propidio. L'aspetto di un complotto doppietto punto discriminante varia tra citofluorimetri e si basa sulle proprietà colorazione ioduro di propidio, vedere il locale impianto di citometria a flusso per un consiglio su come impostare un discriminatore doppietto nella vostra analisi. In generale, in una popolazione di cellule proliferanti in modo asincrono, le singole celle sono di solito i due picchi più abbondanti (2N e 4N DNA) nella trama doppietto discriminante e un cancello dovrebbe essere disegnato intorno a loro. In questo modo selezionare gli eventi singola cella che vengono utilizzati per tutte le successive analisi di seguito. </li><li> Il primo campione da analizzare deve essere una cultura in modo asincrono proliferanti che funge da controllo positivo per la colorazione e citofluorimetro set-up. Regolare la sensibilità di fotomoltiplicatori per la colorazione ioduro di propidio in modo tale che i picchi 2N e 4N dalle cellule singoletto sono centrate a 200 e 400 (unità arbitrarie) sul asse X. Spesso si macchia una s abbondanteupply di queste cellule per garantire che tutti i parametri della citometria a flusso sono state opportunamente adeguata senza usare questo esempio. Questo controllo positivo è utile anche per i nuovi utenti a familiarizzare con il funzionamento della citometria a flusso. </li><li> Regolare la sensibilità del tubo fotomoltiplicatore per la rilevazione FITC tale che le popolazioni G1 e G2 / M sono al di sopra di fondo. Cellule BrdU positive dovrebbero essere circa 10 volte più luminoso e l'asse Y dovrebbe essere visualizzato come una scala logaritmica. A volte è utile inserire un controllo negativo per la colorazione BrdU (sostituendo l'anti-BrdU con anticorpi non specifici IgG al punto 2.3) per distinguere chiaramente le cellule colorate positivamente. </li><li> Regolare la compensazione tra ioduro di propidio e FITC tale che i singoli eventi acquisiti dal modulo citofluorimetro un arco a forma di ferro di cavallo da G1 in basso a sinistra fino alla fase S e giù in basso a destra per G2 / M. Si prega di consultare il seguente riferimento per una più approfondita displayscussione dei principi e l'uso di citometria a flusso e riferimenti lì per applicazioni specifiche 2. </li></ol> 4. Analisi dei dati <ol><li> 5 000 a 10 000 eventi singola cella con la gamma di contenuto desiderato DNA devono essere raccolti per ogni campione al fine di avere fiducia che la popolazione di cellule in coltura sono stati completamente campionati. </li><li> Una volta che le cellule sono stati misurati per ioduro di propidio e contenuti BrdU cui hanno bisogno per essere assegnati alle fasi G1, S o G2 / M. Fare tracciando cancelli intorno alle due popolazioni BrdU negativa centrata a 200 e 400 (G1 e G2 / M, rispettivamente). Tutto ciò che sopra queste caselle devono essere inclusi in una sola porta che misura fase S (Fig. 1A). La percentuale di cellule in ogni porta rappresenta il numero relativo di cellule in G1, S e G2 / M (Fig. 1B). </li></ol> 5. Protocollo alternativo per l'analisi del ciclo cellulare in una popolazione mista di cellule <ol><li> Questo protocollo alternativo èpiù utile quando la trasfezione di vettori di espressione di routine si traduce in una bassa percentuale di cellule che esprimono il prodotto del gene di interesse, o quando il trattamento della droga per selezionare una popolazione pura di cellule non è praticabile. Ciò si traduce in una percentuale relativamente piccola di cellule di interesse contaminazione con una grande popolazione di cellule untransduced. In questo caso, co-trasfezione plasmidi che esprimono il gene o shRNA di interesse lungo con un plasmide che esprime un marker per la rilevazione di cellule transfettate mediante citometria di flusso, come una membrana ancorata GFP 3 o uno straniero marcatore di superficie delle cellule, come CD19 4 o CD20 5. </li><li> Ai fini di questo protocollo useremo CD20 colorazione a titolo di esempio, tuttavia, la colorazione di CD19 è sostanzialmente identica. Nel caso di transfezione con CD20, non c'è bisogno di etichettare BrdU, semplicemente celle immagazzinano come descritto nei passaggi 1,2-1,5 sopra e colorare con l'aggiunta di 20 l FITC coniugato anti-CD20 anticorpi alle cellule su ice per 20 minuti al buio. Fissare le cellule, come descritto in 1,6 passo. Le cellule possono ancora essere conservati per almeno un mese a 4 ° C al buio. Per il rilevamento di GFP, omettere la colorazione degli anticorpi da questo passaggio e fissare e conservare le cellule come descritto. </li><li> Reidratare le cellule di rivestimento nella centrifuga a 500 xg per 5 minuti e risospendere in 5 ml di PBS contenente l'1% BSA. </li><li> Re-agglomerare le cellule a 500 xg per 5 minuti e risospendere le cellule in 0,5 ml di soluzione di ioduro di propidio e RNase come descritto sopra nella sezione 2.5. </li><li> Continua a seguire le istruzioni di preparazione delle cellule in 2,6 e analisi le istruzioni ai punti 3.1 e 3.2. </li><li> Regolare la sensibilità del tubo fotomoltiplicatore per la rilevazione FITC tale che le cellule non colorate sono al di sopra di fondo. Idealmente, le cellule CD20-positive FITC sarà 10X a 100X più intensamente colorato di sfondo e l'asse Y di questa trama dovrebbe essere visualizzato come una scala logaritmica (fig. 2A). CD20 cellule positive che sono 10 volte più luminosa rispetto backgtondo (e con colorazione ioduro di propidio tra 200 e 400) dovrebbero essere selezionati per la visualizzazione in un ioduro di propidio contro la conta delle cellule istogramma come mostrato in fig. 2C. Per le linee di cellule che esprimono i marcatori che sono prontamente colorati vivacemente (es. 10X a 100X sopra di fondo) la CD20 positivo, cut-off dovrebbe essere fissato a sfondo 10X. Inclusione delle cellule colorazione più deboli aumenta la variabilità in questi esperimenti, presumibilmente perché il gene di interesse è anche debolmente espresso in queste cellule. Per le linee di cellule che solo resa debolmente macchiato CD20 positivi (cioè meno di sfondo 10X), la determinazione di un largo taglio dovrebbe essere effettuato con un controllo negativo costituito da CD20 macchiato, le cellule untransfected. </li><li> Almeno 1000 CD20 eventi positivi devono essere raccolti per ogni campione. Esperimenti con meno di 1000 eventi produrranno elevata variabilità. I pacchetti software come ModFit LT (Verity Software), AV Multi Cycle (Phoenix Sistemi di flusso) e di flusso Jo (Albero Star) utilizzare stime matematiche delle popolazioni G1, S e G2 / M che contribuiscono alla forma della curva di istogrammi come quello mostrato in fig. 2B e C. </li></ol> 6. Rappresentante dei risultati: Forniamo tre esempi di analisi sperimentale del ciclo cellulare utilizzando il nostro approccio. Il primo utilizza l'espressione retrovirali del dipendente p27Kip1 inibitore della chinasi ciclina in fibroblasti embrionali di topo. Ventiquattro ore dopo la selezione dei farmaci per l'infezione virale era completa, le cellule sono state impulso etichettati con BrdU per un'ora. In questo esperimento espressione ectopica dell'inibitore è usato per arrestare la proliferazione delle cellule (Fig. 3A e B). Come mostrato in fig. 3B poco BrdU eventi positivi sono evidenti nella fase S porta in risposta a p27. Allo stesso modo, la percentuale di cellule in fase S per cellule che esprimono p27 è piuttosto basso come diagramed in fig. 3C. Questo tipo di analisi è stato molto efficace nel caratterizzare i difetti controllo del ciclo cellulare nelle cellule derivate da ceppi diversi di gene mirati topi 6, 7, 8. Nel secondo esperimento, non trasformato cellule epiteliali mammarie (MCF10A) sono stati trattati con la citochina crescita inibitori, beta fattore di crescita trasformante uno (TGF-β1) per 24 ore. Le cellule sono state etichettate con BrdU per quattro ore immediatamente prima della raccolta. Come mostrato in fig. 4 sull'etichettatura BrdU nelle cellule in fase S è notevolmente diminuita del TGF-β1 segnalazione, la specificità del nostro colorazione è anche convalidato con un controllo IgG negativo (Fig. 4C). La quantificazione delle diverse fasi del ciclo cellulare conferma che TGF-β1 in primo luogo inibisce la proliferazione nella fase G1 del ciclo cellulare, portando a un accumulo in questa fase. Nel nostro ultimo esempio, pRB carente SaOS-2 cellule sono transfettate con un vettore CMV-CD20 espressione e sia CMV-RB o CMV-β-Gal come controllo. Tre giorni dopo la transfezione le cellule sono state raccolte, macchiato, e fissa. Analisi di citometria a flusso di queste cellules è mostrato in fig. 5. Questo dimostra la distribuzione del ciclo cellulare delle cellule di controllo negativo transfettate (Fig. 5A) in confronto con la seguente distribuzione 72 ore di espressione pRB (Fig. 5B). A seguito di curve fitting da un software Cicli multipli, un confronto diretto della proporzione delle fasi del ciclo cellulare è mostrato in fig. 5C. Questo rivela l'accumulo di cellule in G1 seguente espressione pRB e l'impoverimento relativo di cellule dalle fasi S e G2 / M. Abbiamo usato variazioni su questo test per sondare i meccanismi di arresto G1 ampiamente 9, 10, 11, 12, 13. Questi esempi dimostrano come controllo del ciclo cellulare può essere misurata in risposta a una varietà di stimoli o di manipolazioni delle cellule. Questo approccio può quindi essere adattato a molte applicazioni che richiedono la misura della posizione del ciclo cellulare negli esperimenti di tipo culturale. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3491/3491fig1.jpg"> Figura 1. Quantitzione delle fasi del ciclo cellulare mediante ioduro di propidio combinato e colorazione BrdU (PI-BrdU). (A) Questo pannello mostra tre citometria a flusso dimensionale di ioduro di propidio e cellule colorate BrdU. Si noti che le cellule con contenuto di DNA 2N e 4N sono centrate sui 200 e 400 segni sulla asse X scala per intensità della colorazione ioduro di propidio. Intensità di colorazione BrdU viene misurata su una scala logaritmica per l'asse Y. Si noti la posizione delle porte utilizzate per quantificare le cellule nelle fasi G1, S e G2 / M del ciclo cellulare. (B) la percentuale relativa di cellule in ciascuna delle porte G1, S e G2 / M di A sono riportati su questo grafico. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3491/3491fig2.jpg"> Figura 2. Quantificazione delle fasi del ciclo cellulare nelle cellule selezionate con ioduro di propidio e la superficie delle cellule CD20 marcatore. (A) Questo pannello mostra ioduro di propidio e CD20 colorazione per una miscela di cellule, alcune delle quali ectopica esprimere CD20 e pRB. Si noti che le cellule con2N e 4N del DNA (le popolazioni più abbondanti) sono centrate sui 200 e 400 segni sulla asse X. La posizione del + CD20 cancello seleziona le celle che sono macchiati di almeno 10 volte più luminosa di fondo. (B) Un grafico di conta delle cellule contro colorazione ioduro di propidio è indicato per le cellule CD20 negativi in ​​un pannello che si moltiplicano in modo asincrono. (C) Un grafico simile a quello mostrato per le cellule CD20 positive dal pannello di A che sono state indotte ad arrestare con l'espressione pRB e contengono cellule con contenuto di DNA soprattutto 2N. Questo dimostra che un arrestato sotto-popolazione può essere distinto da altre cellule in questa cultura utilizzando questa tecnica di colorazione. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3491/3491fig3.jpg"> Figura 3. Inibizione della proliferazione cellulare da p27Kip1. (A) PI-BrdU analisi è utilizzato per misurare le fasi del ciclo cellulare in una popolazione in modo asincrono proliferazione di cellule che sono state trasdotte con un vuoto vecto pBABE retroviralir. (B) Una simile analisi di cellule trasdotte con pBABE-p27. Si noti l'assenza di cellule nella fase S e la maggiore intensità degli eventi in G1 e G2 / M cancelli. (C) La determinazione quantitativa di cellule nelle varie fasi del ciclo cellulare in modo asincrono proliferazione di controllo e cellule che esprimono p27. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/3491/3491fig4.jpg"> Figura 4. Inibizione della proliferazione cellulare da TGF-β1 (A) PI-BrdU analisi di cellule proliferanti in modo asincrono MCF10A. (B) Analisi delle cellule trattate con 100 pM di TGF-β1 per 24 ore. Notare l'accumulo di cellule principalmente nella fase G1 del ciclo cellulare. (C) Validazione di colorazione BrdU sostituendo il anti-BrdU con un anticorpo primario non specifico controllo IgG nelle cellule proliferanti in modo asincrono. (D) quantificazione grafica delle fasi rispettivi ciclo cellulare da A e B. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/3491/3491fig5.jpg"> Figura 5. Inibizione della proliferazione cellulare da pRB. (A) rispetto al conteggio delle cellule colorazione ioduro di propidio di CD20 e ß-gal cellule transfettate viene mostrato. Si tratta di un controllo importante come la trasfezione può parzialmente sincronizzare le cellule, rendendo la popolazione untransfected (CD20 - cellule) come un controllo inadeguato per la trasfezione sub-popolazione. Cellule trasfettate devono essere comparati con le altre cellule analogamente transfettate. (B) conta cellulare contro grafico ioduro di propidio di CD20 e pRB transfettate cellule. Si noti la presenza quasi esclusiva di un picco 2N. (C) Rappresentazione grafica di proporzioni ciclo cellulare fase determinata da A e B con metodi curva di raccordo nel software Cicli multipli.

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<li>Dick, F. A., Sailhamer, E., Dyson, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutagenesis+of+the+pRB+pocket+reveals+that+cell+cycle+arrest+functions+are+separable+from+binding+to+viral+oncoproteins%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Mutagenesis of the pRB pocket reveals that cell cycle arrest functions are separable from binding to viral oncoproteins.</a> Mol. Cell. Biol. 20, 3715-3715 (2000).</li>
<li>Dick, F. A., Dyson, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three+regions+of+the+pRB+pocket+domain+affect+its+inactivation+by+human+papillomavirus+E7+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Three regions of the pRB pocket domain affect its inactivation by human papillomavirus E7 proteins.</a> J. Virol. 76, 6224-6224 (2002).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Nella nostra esperienza, il successo di queste tecniche dipende da alcuni controlli chiave e le condizioni sperimentali. Uno è stabilire un controllo in modo asincrono proliferano per l&#39;impiego in questi esperimenti. Questo controllo ha tre scopi importanti. In primo luogo, fa sì che le condizioni di coltura utilizzate per tutti i campioni sperimentali sono sufficienti a sostenere la proliferazione continua in assenza di trattamento. Questo esempio serve anche lo scopo di un controllo positivo per la metodologia di colorazione per garantire che BrdU o cellule CD20 positivo può essere rilevato quando sono presenti. Infine, questo esempio è usato per calibrare il citofluorimetro. Questo campione di controllo può essere utilizzato per regolare l&#39;intensità colorante propidio ioduro per rilevare le cellule 2N e 4N a 200 e 400 rispettivamente. Inoltre, la sensibilità di rilevazione di BrdU o CD20 può essere regolata in modo che i segnali negativi e positivi sono concentrate, come mostrato nelle Figure 1A e 2A. Quando tutti i campioni hanno una concentrazione simile di cellule in PI-RSoluzione Nase, poi alcuni aggiustamenti al citometro sono necessari come campioni successivi vengono eseguiti. Questo è importante per ragioni mostrato in fig. 4B e 5B dove l&#39;accumulo G1 forte essenzialmente crea un unico picco G1 che potrebbe essere erroneamente interpretato come G2 / M. Gli esperimenti di rappresentanza anche fare altri punti importanti. Prima di tutto, dimostrano che l&#39;assorbimento BrdU ed etichettatura può variare tra i tipi di cellule. Per questo motivo è importante determinare empiricamente la lunghezza di impulso e condizioni colorazione necessari per individuare adeguatamente le cellule in fase S. In generale, i tipi di cellule che doppio nella cultura in 24 ore o meno possono essere etichettati con BrdU nel giro di un&#39;ora. Tipi di cellule in crescita più lenta può richiedere impulsi più lunghi e alterazioni delle condizioni di colorazione anticorpale e la durata. Cellule MCF10A sono un ottimo esempio in tal senso come lo erano etichettati con BrdU per quattro ore e colorati con il doppio della concentrazione standard di anticorpi per quattro volte più a lungo. Gli investigatoridevono stare attenti a non superare 6 ore di BrdU etichettatura anche con cellule molto lenta crescita come questo può portare ad includere erroneamente di G2 / M cellule nella fase S popolazione. In secondo luogo, nel confrontare gli effetti di p27Kip1 espressione con quelle di TGF-β1, è chiaro che p27 può indurre un accumulo sia in G1 o G2 / M, mentre le fasi di TGF-β1 segnalazione induce un arresto G1. Mezzi tradizionali di rilevazione proliferazione come 3 H-timidina e il conteggio a scintillazione non sono in grado di distinguere queste possibilità. Nel nostro protocollo alternativo dimostriamo l&#39;individuazione di una sotto-popolazione di cellule in una popolazione più ampia untransfected. E &#39;importante determinare empiricamente il giornalista più adatto per la rilevazione di cellule transfettate. Nella nostra esperienza alcuni tipi di cellule sia della superficie cellulare esprimere marcatori male, o non può propriamente loro traffico verso la membrana plasmatica, con conseguente impossibilità di rilevare le cellule transfettate. Likewise, non tutte le cellule tollerare la forma legata membrana di GFP. Selezione del reporter più appropriato dovrebbe essere presa da valutare l&#39;efficienza di transfezione del giornalista così come l&#39;intensità relativa di espressione rispetto ai controlli untransfected. Idealmente, espressione eterologa di queste molecole sarà ben tollerato e questo è indicativo che i marcatori hanno poco o nessun effetto sulla distribuzione del ciclo cellulare. Una limitazione di questi tipi di approcci citometria a flusso è che sono solo in grado di stabilire abbondanze relative delle fasi del ciclo cellulare rispetto a un altro. Per questo motivo è ambiguo se espressione di p27 in Figura 3 induce veramente un arresto in G1 e G2 / M, o se si rallenta la progressione solo attraverso queste fasi relative alla fase-S. Queste possibilità possono essere indagato ulteriormente trattando un campione parallelo di cellule con un inibitore mitotico come nocodazole, o G1 / S come inibitore afidicolina. Dal momento che questi farmaci creare una Dominaarresto nt in M-fase o all&#39;inizio fase S, rispettivamente, le cellule proliferano lentamente si accumula al punto di arresto indotto da farmaci. Per esempio le cellule in G1 arrestato a causa di espressione pRB resterà in G1 nonostante il trattamento nocodazole mentre le cellule di controllo si accumulano nella fase M-13. Presi insieme, questi approcci sperimentali offrono una metodologia flessibile che può essere applicata a una vasta gamma di domande del ciclo cellulare dei mammiferi la ricerca. Si può facilmente rilevare alterazioni nella progressione del ciclo cellulare e quantificare le differenze rispetto ai controlli.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome del reagente / apparecchiatura </th><th> Azienda </th><th> Numero di catalogo </th><th> Commenti (opzionale) </th></tr><tr><td> La proliferazione delle cellule reagente Etichettatura </td><td> GE Amersham </td><td> RPN201 </td><td></td></tr><tr><td> Anticorpi anti-BrdU </td><td> BD Biosciences </td><td> 347580 </td><td></td></tr><tr><td> Anticorpi anti-topo coniugato con FITC </td><td> Vector Labs </td><td> FI-2000 </td><td></td></tr><tr><td> Cellula Strain filtri </td><td> BD Falcon </td><td> 352235 </td><td></td></tr><tr><td> Anticorpi anti-CD20 </td><td> BD Biosciences </td><td> 347673 </td><td></td></tr><tr><td> Cycle Software Multi </td><td> Phoenix Flow Systems </td><td> N / A </td><td></td></tr></tbody></table>

analisi della posizione ciclo cellulare nelle cellule di mammifero

Analysis of Cell Cycle Position in Mammalian Cells

La regolazione della proliferazione cellulare è fondamentale per la morfogenesi dei tessuti durante lo sviluppo degli organismi multicellulari. Inoltre, la perdita di controllo della proliferazione cellulare alla base della patologia di malattie come il cancro. Come tale non vi è grande bisogno di essere in grado di studiare la proliferazione cellulare e quantificare la percentuale di cellule in ogni fase del ciclo cellulare. E &#39;inoltre di vitale importanza per identificare le cellule che sono indistintamente replicare il DNA all&#39;interno di una popolazione più ampia. Dal momento che la decisione di una cellula a proliferare è fatto nella fase G1 immediatamente prima di iniziare la sintesi del DNA e progredendo attraverso il resto del ciclo cellulare, la rilevazione della sintesi del DNA in questa fase consente una determinazione univoca dello stato di regolazione della crescita in coltura cellulare esperimenti. Contenuto di DNA nelle cellule può essere facilmente quantificato mediante citometria di flusso di cellule colorate con ioduro di propidio, un colorante fluorescente del DNA intercalanti.Allo stesso modo, la sintesi del DNA attivo può essere quantificato dalle cellule coltura in presenza di timidina radioattiva, la raccolta delle cellule, e misurando l&#39;incorporazione di radioattività in una frazione acido insolubile. Abbiamo una notevole esperienza con l&#39;analisi del ciclo cellulare e raccomandare un approccio diverso. Indaghiamo la proliferazione cellulare utilizzando bromodeossiuridina / fluorodeoxyuridine (abbreviato semplicemente come BrdU) colorazione che rileva l&#39;incorporazione di questi analoghi timina nel DNA sintetizzato di recente. L&#39;etichettatura e la colorazione delle cellule con BrdU, in combinazione con colorazione DNA totale da ioduro di propidio e analisi mediante citometria a flusso 1 offre la misura più accurata delle cellule nelle varie fasi del ciclo cellulare. È il nostro metodo preferito perché unisce la rilevazione della sintesi del DNA attiva, attraverso la colorazione a base di anticorpi BrdU, con contenuto di DNA totale da ioduro di propidio. Questo permette la netta separazione delle cellule in fase precoce G1 da S, o S in ritardo di fase da G2 / M.Inoltre, questo approccio può essere utilizzato per studiare gli effetti di molti stimoli diversi cellulari e agenti farmacologici sulla regolazione della progressione attraverso queste diverse fasi del ciclo cellulare. In questo rapporto vengono descritti i metodi per l&#39;etichettatura e la colorazione di cellule in coltura, così come la loro analisi in citometria a flusso. Abbiamo anche esempi sperimentali di come questo metodo può essere utilizzato per misurare gli effetti dei segnali di inibizione della crescita di citochine come TGF-β1, e gli inibitori di proliferazione, come l&#39;inibitore della chinasi ciclina dipendente, p27Kip1. Abbiamo anche un protocollo alternativo che consente l&#39;analisi della posizione del ciclo cellulare in una sotto-popolazione di cellule all&#39;interno di una cultura più grande 5. In questo caso, dimostriamo come rilevare un arresto del ciclo cellulare nelle cellule transfettate con il gene del retinoblastoma anche se molto più numerosi da parte delle cellule untransfected nella stessa cultura. Questi esempi illustrano i tanti modi che la colorazione del DNA ecitometria a flusso può essere utilizzato e adattato per investigare questioni fondamentali di controllo del ciclo cellulare dei mammiferi.

Determinare la posizione del ciclo cellulare di una popolazione di cellule, o la comprensione di come i segnali influenzano la proliferazione, può essere facilmente misurato mediante citometria di flusso utilizzando questo protocollo. Riportiamo un semplice approccio sperimentale alla colorazione delle cellule e quantificare la loro posizione nel ciclo cellulare.

Analisi della posizione ciclo cellulare nelle cellule di mammifero

La regolazione della proliferazione cellulare è centrale per la morfogenesi tissutale durante lo sviluppo degli organismi multicellulari. Inoltre, la perdita di controllo di...

Lo scopo di questa procedura è determinare la proporzione di cellule nelle diverse fasi del ciclo cellulare. Questo viene ottenuto aggiungendo innanzitutto il reagente di marcatura della proliferazione cellulare BRDU a una coltura cellulare vitale, in modo che venga incorporato nel DNA appena sintetizzato; successivamente, il BRDU presente nelle cellule che hanno incorporato il reagente viene marcato, quindi il DNA viene colorato con ioduro di propidio. L'ultimo passaggio consiste nel valutare la proporzione di cellule nelle diverse fasi del ciclo cellulare mediante citometria a flusso.Alla fine, la distribuzione del ciclo cellulare in una popolazione di cellule sperimentali può essere visualizzata mediante analisi citofluorimetrica di cellule marcate con BRDU. Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come l'incorporazione di trizio nella timidina e il conteggio con scintillazione, è che con la marcatura BRD è possibile determinare la proporzione di cellule in ciascuna fase del ciclo cellulare. La dimostrazione visiva di questo concetto è fondamentale, poiché l'analisi citofluorimetrica risulta difficile da spiegare senza immagini a corredo che mostrino i diversi parametri da regolare.La procedura sarà dimostrata da due studenti laureati del mio laboratorio, Matt Chii e io, Miri. AGGIUNGERE BRDU in una diluizione di uno a mille alle colture cellulari sperimentali, incubare per un'ora, raccogliere le cellule, aspirare il mezzo di coltura e quindi lavare accuratamente le cellule due volte con PBS per rimuovere ogni traccia di mezzo. In questo passaggio, utilizzando PBS integrato con tre millimoli di EDTA, risciacquare rapidamente le colture una volta in più, quindi aspirare completamente la soluzione P-B-S-E-D-T-A per staccare le cellule.Aggiungere circa 0,5 millilitri di P-B-S-E-D-T-A in ogni piastra di coltura da sei centimetri e incubare le piastre a 22 gradi Celsius per circa cinque minuti. Successivamente, trasferire le colture cellulari da ciascuna piastra in provette coniche individuali da 15 millilitri. Centrifugare ora le cellule a 500 ×g per cinque minuti a temperatura ambiente, quindi rimuovere il sopranatante e risospendere le cellule in 100 microlitri di PBS.Infine, fissare le cellule aggiungendo cinque millilitri di etanolo al 95% goccia a goccia, vortexando e centrifugando le cellule a 500 ×g per cinque minuti a temperatura ambiente. Rimuovere nuovamente l'etanolo e risospendere il pellet in un millilitro di HCl 2 N contenente lo 0,5% di Triton X-100, aggiungendo la soluzione alle cellule in modo goccia a goccia mentre si vortexa; quindi incubare le cellule a temperatura ambiente per 30 minuti. Dopo aver nuovamente formato il pellet, aspirare il sopranatante, avendo particolare cura poiché a questo passaggio le cellule formano un pellet molto fragile.Quindi, risospendere delicatamente il pellet in un millilitro di borato di sodio 0,1 molare e incubare nuovamente le cellule. Adesso, centrifugare nuovamente le cellule e questa volta incubarle in 0,5 millilitri di soluzione anticorpale contenente anticorpi monoclonali anti-BRDU di topo diluiti 1:50. Dopo aver nuovamente centrifugato le cellule, risospendere il pellet in 50 microlitri di soluzione anticorpale contenente anticorpi secondari coniugati anti-US ZI di coniglio, diluiti 1:25.Quindi, incubare le cellule al buio per 30 minuti a temperatura ambiente. Dopo la centrifugazione finale, incubare le cellule in 0,5 millilitri di soluzione di ioduro di propidio e RNA al buio a 37 gradi Celsius per 30 minuti. Infine, far passare la soluzione cellulare digerita attraverso un filtro cellulare per rimuovere gli aggregati.Quindi trasferire le singole cellule in un tubo appropriato per il caricamento del campione nel citofluorimetro per popolazioni cellulari che proliferano in modo asincrono, come quella mostrata. In questo esempio, posizionare una finestra (gate) attorno ai due picchi più abbondanti nel grafico di discriminazione dei doppietti per selezionare gli eventi derivanti da singole cellule per tutte le analisi successive. Successivamente, analizzare un campione di coltura che prolifera in modo asincrono, da utilizzare come controllo positivo per la colorazione e l'impostazione dei parametri del citofluorimetro.Regolare la sensibilità del tubo fotomoltiplicatore per la colorazione con ioduro di propidio in modo che i picchi corrispondenti alle cellule con contenuto N e 4N siano centrati rispettivamente sui valori arbitrari di 200 e 400 sull'asse x. Successivamente, regolare la sensibilità del tubo fotomoltiplicatore per il rilevamento di FXI in modo che le cellule negative per FXI siano al di sopra dei livelli di fondo. Le cellule positive per BRDU dovrebbero essere circa 10 volte più brillanti e l'asse x deve essere visualizzato su scala logaritmica.Gli eventi singoli catturati dal citometro a flusso formano un arco a forma di ferro di cavallo che parte dalla fase G uno in basso a sinistra, prosegue attraverso la fase S e quindi ritorna in basso a destra per la fase G due M. Come mostrato in questa figura rappresentativa, raccogliere da 5.000 a 10.000 eventi cellulari singoli per ottenere l'intervallo desiderato di contenuto di DNA. Dopo aver misurato il contenuto di ioduro di propidio e di BRDU, assegnare le cellule alle fasi G uno, S o G due M tracciando dei gate intorno alle due popolazioni negative per BRDU, centrate rispettivamente a 200 per la fase G uno e a 400 per la fase G due M. Includere tutti gli eventi al di sopra di queste due aree in un unico gate per la misurazione della fase S; la percentuale di cellule in ciascun gate rappresenterà il numero relativo di cellule presenti nelle fasi G uno e G due M, come illustrato in questo grafico a barre relativo alla figura precedente del diagramma di dispersione.Dopo la colorazione per un marcatore cellulare di interesse, in questo esempio CD20, centrifugare le cellule a 500 ×g per 10 minuti a 22 °C, quindi risospendere il pellet in cinque millilitri di PBS integrato con 1% BSA. Dopo aver centrifugato nuovamente le cellule a 500 ×g per cinque minuti a temperatura ambiente, utilizzare 0,5 millilitri della soluzione di ioduro di propidio e RNA per reidratare le cellule. Quindi colorare e digerire le cellule come appena mostrato, delimitare i picchi cellulari singoli diploidi e tetraploidi, quindi regolare la sensibilità del tubo fotomoltiplicatore per la rilevazione di FXI in modo che le cellule non colorate siano al di sopra dei livelli di fondo.In linea ideale, le cellule positive per CD 20 FXI dovrebbero presentare una colorazione da 10 a 100 volte più intensa rispetto allo sfondo. Ancora una volta, l'asse x deve essere visualizzato su scala logaritmica. Infine, selezionare le cellule positive per CD 20 che risultano 10 volte più luminose rispetto ai livelli di fondo e che mostrano una colorazione con ioduro di propidio compresa tra 200 e 400, da rappresentare in un istogramma che confronta ioduro di propidio e numero di cellule, come mostrato in questo esempio. Raccogliere almeno 1000 eventi positivi per CD 20 per ciascun campione al fine di limitare la variabilità in questo grafico.Viene mostrata l'analisi tridimensionale mediante citometria a flusso di cellule colorate con ioduro di propidio e BrdU. Si noti che le cellule con contenuto di DNA 2n e 4n sono centrate rispettivamente sui valori 200 e 400 della scala dell'asse X. L'intensità della colorazione con ioduro di propidio e l'intensità della colorazione con BrdU sono misurate su una scala logaritmica.Sull'asse Y, osservare le posizioni dei gate utilizzati per quantificare le cellule nelle fasi G1 e G2/M del ciclo cellulare. Qui vengono mostrate le proporzioni relative delle cellule in ciascuno dei gate G1 e G2/M della figura precedente. In questo caso, propidio ioduro e CD20.Viene mostrata la colorazione di una miscela di cellule, alcune delle quali esprimevano in modo ectopico CD20 e PRB. Si noti che le cellule con 2n e 4n DNA, le popolazioni più abbondanti, sono centrate rispettivamente sui valori 200 e 400 dell'asse x. La posizione delle cellule positive per CD20 selezionate corrisponde a quelle colorate almeno 10 volte più intensamente rispetto al fondo.Questo istogramma rappresenta il numero di cellule in funzione della colorazione con ioduro di propidio per le cellule CD20 negative provenienti dal precedente diagramma a dispersione che si stanno proliferando in modo asincrono; in questo istogramma sono mostrate anche le cellule CD20 positive del precedente diagramma a dispersione CD20 che sono state indotte all'arresto mediante espressione di pRRB e che contengono cellule con principalmente un contenuto di DNA diploide. Questi dati dimostrano che una sottopopolazione arrestata può essere distinta dalle altre cellule nella coltura mediante questa tecnica di colorazione. Nelle prossime tre figure, sono mostrati i dati dell'analisi citometrica in flusso dell'espressione retrovirale dell'inibitore della chinasi dipendente dalla ciclina p27KIP1 in fibroblasti embrionali murini.È stata utilizzata l'analisi con ioduro di propidio e BRDU per misurare le fasi del ciclo cellulare in una popolazione di cellule che proliferano in modo asincrono e che sono state trasdotte con un vettore retrovirale P babe vuoto, come mostrato qui. Sono evidenti pochi eventi positivi per BRDU nella finestra della fase S in risposta a P 27. Si noti inoltre la maggiore intensità degli eventi nelle finestre G uno e G due M.Allo stesso modo, la percentuale di cellule in fase S per le cellule che esprimono P 27 è piuttosto bassa, come illustrato in questa figura. Questo tipo di analisi si è rivelato molto efficace nel caratterizzare i deficit del controllo del ciclo cellulare in cellule derivate da diverse linee di topi con geni modificati. Nelle prossime due figure, cellule epiteliali della memoria non formate sono state trattate con la citochina inibitoria della crescita TGF beta uno per 24 ore.Come mostrato in questa prima figura, l'etichettatura con BRDU nelle cellule in fase S è fortemente ridotta dal segnale di TGF beta uno. Si noti l'accumulo di cellule principalmente nella fase G uno del ciclo cellulare, come si può osservare nel pannello centrale. La quantificazione delle diverse fasi del ciclo cellulare conferma che TGF beta uno inibisce principalmente la proliferazione nella fase G uno del ciclo cellulare, portando a un accumulo in questa fase.In quest'ultima serie di analisi sperimentali, cellule SAS due carenti di PRB sono state trasfettate con un vettore di espressione CMV CD 20 e con CMV RB oppure CMV beta GAL come controllo. Questa prima figura mostra la distribuzione del ciclo cellulare delle cellule trasfettate con il controllo negativo rispetto alla loro distribuzione dopo 72 ore di espressione di PRB. Si noti la presenza quasi esclusiva di un picco a due N nel pannello destro; l'analisi di adattamento della curva mediante software multi-cycle ha rivelato che le cellule si accumulano principalmente nella fase G uno dopo l'espressione di PRB.Sebbene le popolazioni nelle fasi s e G2 M fossero relativamente ridotte. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere adattata per studiare altri marcatori del ciclo cellulare, come le istoni fosforilate in mph. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come determinare la distribuzione del ciclo cellulare in una popolazione di cellule.Non dimenticare che l'acido cloridrico normale è caustico e il propidio. L'ioduro è un potenziale agente cancerogeno. Possono essere pericolosi in caso di contatto.Si devono sempre prendere precauzioni durante l'uso di questi prodotti chimici.

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Biologia

Monitoraggio sottili cambiamenti nella progressione e cinetica di fasi del ciclo cellulare può essere realizzata mediante l'uso di una combinazione di marcatura metabolica di acidi nucleici con BrdU e DNA genomico totale colorazione tramite ioduro di propidio. Questo metodo evita la necessità di sincronizzazione chimica del ciclo cellulare, impedendo l'introduzione di non-specifico danno al DNA, che a sua volta influisce progressione del ciclo cellulare.

Cella di misura Kinetics progressione del ciclo con la marcatura metabolica e citometria a flusso

Metafase di anafase transizione viene attivato attraverso la promozione anafase-complesso (APC / C)-dipendente ubiquitinazione e la successiva distruzione della ciclina B. Qui, abbiamo creato un sistema che, a seguito di pulse-chase etichettatura, permette di monitorare ciclina proteolisi B in popolazioni di cellule intere e facilita la rilevazione di interferenza del checkpoint mitotico.

Studiare proteolisi della ciclina B a livello di singola cellula in popolazioni di cellule intere

miRNA o microRNA sono regolatori chiave della progressione del ciclo cellulare. Questo video descrive un'analisi del ciclo cellulare basata sulla citometria a flusso di cellule tumorali del polmone trasfettate con miRNA, per studiare l'effetto del miRNA sulla regolazione del ciclo cellulare. L'inibizione della proliferazione mediante l'arresto della progressione del ciclo cellulare ha dimostrato di essere un approccio promettente per il trattamento del cancro.

Analisi del ciclo cellulare: un approccio per studiare la regolazione del ciclo cellulare delle cellule tumorali polmonari trasfettate con miRNA

Questo protocollo descrive l'uso di bromodeossiuridina (BrdU) uptake per consentire il monitoraggio temporale di cellule che erano in fase S in un determinato momento. L'aggiunta di coloranti DNA e l'etichettatura degli anticorpi facilita l'analisi dettagliata del destino delle cellule in fase S in tempi successivi.

Monitoraggio temporale del ciclo cellulare progressione citometria a flusso, senza la necessità di sincronizzazione

Riportiamo due protocolli di sincronizzazione delle celle che forniscono un contesto per studiare eventi legati a fasi specifiche del ciclo cellulare. Mostriamo che questo approccio è utile per analizzare la regolazione di geni specifici in un ciclo cellulare non selettivo o su esposizione ad agenti che interessano il ciclo cellulare.

Studiare l&#39;espressione del gene regolamentata mediante ciclo cellulare da due protocolli complementari di sincronizzazione delle cellule

Vi presentiamo un protocollo per la sincronizzazione della timidina doppia delle cellule HeLa seguita da analisi mediante microscopia confocale ad alta risoluzione. Questo metodo è la chiave per ottenere il numero elevato di celle che procedono in modo sincrono dalla fase S alla mitosi, permettendo studi sui ruoli mitotici delle proteine multifunzionali che possiedono anche funzioni di interfase.

Combinazione di sincronizzazione cellulare mitotica e microscopia confocale ad alta risoluzione per studiare il ruolo delle proteine del ciclo cellulare multifunzione durante la mitosi

È descritto un metodo basato su formazione immagine che può essere utilizzato per identificare la fase S e analizzare le dinamiche del ciclo cellulare in c. elegans ermafrodita germinale utilizzando la timidina EdU analogico. Questo metodo non richiede nessun transgeni ed è compatibile con la macchiatura immunofluorescente.

Analisi del ciclo cellulare nella linea germinale di c. elegans con la timidina analogico EdU

Questo protocollo descrive come isolare i cheratinociti cutanei dai modelli murinari, per macchiare con anticorpi con tag metallici e analizzare le cellule colorate per citometria di massa al fine di profilare il modello di espressione delle proteine di interesse nelle diverse fasi del ciclo cellulare.

Isolamento e colorazione dei Keratinociti della pelle del topo per l'analisi specifica del ciclo cellulare dell'espressione proteica cellulare da citometria di massa

Questo protocollo descrive in dettaglio due metodi di arresto del ciclo cellulare di lievito e rilascio opzionale, ed elabora l'uso della microscopia a fluorescenza per studiare i processi dipendenti dal ciclo cellulare in S. cerevisiae.

Manipolazione e analisi dei processi dipendenti dal ciclo cellulare nel lievito in gemmazione

A lungo termine Imaging cellule di mammifero utilizzando Wide-Field Microscopia

Impara a determinare la posizione del ciclo cellulare nelle cellule di mammifero mediante citometria a flusso con marcatura BRDU e ioduro di propidio. Questo protocollo consente di quantificare accuratamente le cellule nelle fasi G1, S e G2/M.

Analisi della posizione ciclo cellulare nelle cellule di mammifero

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