Imaging intravitale del Timo mouse utilizzando 2-Photon Microscopy

La microscopia a due fotoni consente l'acquisizione di immagini in zone profonde all'interno degli organi. L'eccitazione delle proteine fluorescenti nella microscopia a due fotoni si verifica quando due fotoni di energia approssimativamente uguale interagiscono con la molecola, producendo un'eccitazione equivalente all'assorbimento di un singolo fotone dotato del doppio dell'energia. Pertanto, in un microscopio a due fotoni si utilizzano laser a infrarossi, che permettono l'acquisizione di immagini in tessuti spessi, minimizzando lo sbiancamento da luce e i danni fotoindotti.

Inoltre, poiché l'eccitazione è limitata al piano focale, non si verifica fluorescenza fuori fuoco. Unitamente a nuovi strumenti stereotassici e procedure chirurgiche, questa tecnica diventa un metodo potente per documentare i comportamenti cellulari in animali vivi. In questo articolo, la microscopia a due fotoni è stata utilizzata per acquisire immagini intravitali del timo.

In questo organo avviene la maturazione dei linfociti T e pertanto questa tecnica può essere utile negli studi che coinvolgono lo sviluppo dei timociti. Ora iniziamo i protocolli. Per prima cosa, preparare gli animali irradiando animali nudi di otto settimane con 900 rads. Dopo l'irradiazione, riposizionare gli animali nella gabbia fino al trapianto del midollo osseo.

Per preparare la sospensione di midollo osseo, dopo l'eutanasia con anidride carbonica dei topi donatori e la rimozione delle zampe posteriori, rimuovere la pelle e la muscolatura dalle ossa e conservarle in PBS. Trasferire le ossa in una nuova piastra di Petri contenente PBS. Tagliare le estremità delle ossa.

Riempire una siringa con PBS ed eseguire il lavaggio delle ossa utilizzando un ago da 25 gauge. In alternativa, trasferire le ossa in un mortaio e frantumarle con un pestello, quindi omogeneizzare il midollo osseo mediante pipettaggio vigoroso e centrifugare la sospensione per cinque minuti a 400 G.Resus.

Sospendere le cellule in PBS e iniettare per via endovenosa nel topo irradiato. Nei primi giorni successivi al trasferimento si verifica un certo grado di atrofia del midollo osseo. Poiché i topi non ricostituiti con 10 pl iniziano a morire 10 giorni dopo l'irradiazione.

Tuttavia, attendiamo da sei a otto settimane per considerare i nostri animali completamente ricostruiti. Per proseguire il preparativo degli animali, da quattro a sei settimane dopo il trapianto di midollo osseo verrà eseguito il trapianto di timo embrionale per permettere l'osservazione dei timociti in vivo.

Prima di tutto, dopo aver eutanasizzato con anidride carbonica le femmine gravide al giorno 15 e aver prelevato gli embrioni, rimuovere il timo di ciascun embrione e collocarli in una piastra con PBS freddo fino all'uso. Anestetizzare gli animali riceventi con chetamina e xilazina e mantenerli sopra un tappetino riscaldante. Quando l'animale è profondamente anestetizzato, lavare la zona con etanolo. Tagliare la cute, tagliare la membrana peritoneale, localizzare ed esporre il rene.

Dopo aver esposto il rene, praticare un piccolo taglio nella capsula renale e creare una tasca al di sotto. All'interno di questa tasca si inseriscono i timi embrionali. Infine, rimettere il rene nella sua posizione originale e richiudere la cavità peritoneale e la cute.

Con i punti, l'animale deve ricevere analgesici ed essere posizionato su un tappetino riscaldante fino a quando non inizia a riprendersi dall'anestesia. Il rapporto tra cellule CD4 positive e cellule CD8 positive può essere monitorato settimanalmente mediante analisi del campione ematico. Gli animali con un rapporto pari a circa 1,521 hanno accettato il timo.

Le percentuali delle popolazioni di cellule T nel timo trapiantato sono simili alle percentuali riscontrate nel timo endogeno degli animali di controllo. L'imaging intravitale del timo trapiantato richiederà un nuovo intervento chirurgico sugli animali e l'utilizzo del nostro dispositivo di fissaggio per animali. In primo luogo, iniettare ketamina, xilazina e anestetici.

Una volta che l'animale è incosciente, posizionarlo sopra un tappetino riscaldante per via endovenosa. Iniettare Rodin b isothiocyanate dextran per permettere l'osservazione futura del flusso sanguigno nel tessuto. Aprire la cute e la cavità peritoneale per esporre il rene contenente il timo trapiantato, in modo da impedire al rene di ritornare alla sua posizione originale.

Chiudere il lato laterale dell'incisione cutanea con punti di sutura. Trasferire l'animale sul tappetino riscaldante posizionato sopra la piattaforma del supporto per animali. Pinzare entrambi i lati del rene.

Utilizzando una pinza fatta di carta d'alluminio. Chiudere il supporto per l'animale e posizionare il riscaldatore superiore. Avvicinare la sonda il più possibile al tessuto.

Aggiungere dell'agarosio a basso punto di fusione sopra il campione. Coprire completamente il campione con il riscaldatore superiore. Monitorare l'anestesia e somministrare ulteriori dosi di anestetico ogni 40 minuti.

Al termine dell'intervento chirurgico, l'intero sistema viene trasferito sul microscopio a due fotoni per l'acquisizione successiva delle immagini. Nel nostro caso, abbiamo utilizzato un microscopio a due fotoni Prairie Ultima dotato di un laser a titanio-saffio, quattro PMT superiori e un obiettivo ad immersione in acqua 20x. Accendere innanzitutto il laser e il microscopio.

Quindi aggiungere i mirror RIC e i set di filtri in base alle lunghezze d'onda desiderate. Posizionare l'animale sul microscopio. Collegare tutti i riscaldatori alle rispettive unità di controllo.

Aggiungere acqua sopra l'apertura del riscaldatore superiore e abbassare con attenzione l'obiettivo nell'acqua. Mettere a fuoco sui vasi sanguigni o sulle regioni GFPT utilizzando il controllore esterno XY e Z. Individuare rapidamente la regione di interesse.

Regolare il guadagno sui PMT per ottimizzare la separazione dei colori e ridurre al minimo il laser necessario per ottenere un segnale sufficiente rispetto al fondo. Una volta individuata l'area di interesse, avviare l'acquisizione di immagini in time-lapse acquisendo immagini sequenziali di un volume di tessuto di profondità di 50 micrometri nel nostro setup di base. L'acquisizione di ciascun volume richiede 30 secondi.

Pertanto, si raggiunge un'acquisizione dell'immagine di 30 minuti dopo 60 ripetizioni sequenziali di questo volume. Questo video mostra cellule positive per GFP all'interno del timo. Osservare il movimento cellulare e il flusso sanguigno all'interno dei vasi.

Tuttavia, se la preparazione non è adeguata, in questo caso la temperatura dell'organo è bassa. Le cellule smettono di muoversi anche se il flusso sanguigno prosegue. Il metodo qui descritto consente l'osservazione in vivo dei timociti.

Questi metodi dovrebbero essere molto utili per qualsiasi immunologo interessato a osservare la distribuzione e le interazioni dei timociti durante lo sviluppo dei linfociti T; nonostante siano abbastanza semplici, è necessario prestare attenzione a pochi passaggi per evitare artefatti sperimentali. Ad esempio, bisogna fare attenzione a non danneggiare alcun vaso sanguigno, poiché ciò ridurrebbe l'ossigenazione all'interno del tessuto. Inoltre, la temperatura deve essere mantenuta costantemente a 37 gradi Celsius.

Infine, i risultati qui ottenuti dovrebbero essere molto utili per convalidare qualsiasi altro risultato ottenuto mediante tecniche ex vivo.