Name: Immunocolorazione di Dissected Cuore Zebrafish embrionali (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-01-10T12:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 23 s
Description: Impara l'immunocolorazione di cuori embrionali di zebrafish dissezionati per ottenere immagini ad alta risoluzione delle strutture cellulari. Questo metodo riduce i tempi di elaborazione rispetto alle tecniche tradizionali.

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Ringraziamo Beninio Jomok per il suo aiuto in zebrafish allevamento. Questo lavoro è finanziato dal NIH HL81753.

1. Preparazione di diapositive e da camera umidificata <ol><li> La camera umidificata può essere fatto da una scatola, come una scatola di punta svuotato. Avvolgere sia la camera e la copertura con fogli di alluminio per proteggere i campioni dalla luce. </li><li> All'interno della camera, mettere un mucchio di tovaglioli di carta bagnata per mantenere l'umidità all'interno della camera, che impedirà i campioni cuore si asciughi. Impostare un micropiastre piccolo sulla sommità del tovagliolo di carta come una rastrelliera per le diapositive. </li><li> Disegnare sia le linee o cerchi sulla superficie di un vetrino da microscopio utilizzando la penna immEdge per fare i pozzi per i campioni del cuore con una dimensione di circa 5x5 mm. Lasciate asciugare le diapositive. </li><li> Mettere i vetrini in camera umidificata e aggiungere 50ul formaldeide fresca 4% in ogni pozzetto. </li></ol> 2. La dissezione del cuore embrionale <ol><li> Anestetizzare l'embrione di pesce in acqua uovo E3 7 contenente 0,4% tricaine per circa 1 minuto fino a quando il movimento del corpo smettere di pesce ma hanno ancora cuore normalebattere. </li><li> Mettere un vetrino da microscopio concavo sul palco di un microscopio di dissezione. Trasferire gli embrioni al pozzo concavo. </li><li> Regolare la combinazione luce del microscopio da dissezione per rivelare chiaramente il cuore. A seconda delle preferenze personali, potrebbe essere uno dei due campi scuri o DIC-come condizione di luce polarizzata. </li><li> Pulire due siringhe da insulina con il 75% di etanolo, quindi asciugare. </li><li> Regolare il microscopio a dissezione maggiore ingrandimento e mettere a fuoco sul cuore. Fisicamente fissare un embrione con l'inserimento di una punta ago nel tuorlo-somite confine vicino alla testa. Inserire un altro primo ago per la regione del cuore e tirare fuori il cuore in fretta. Se il cuore non è totalmente separata dalla embrione, tagliare il tessuto rimanente collegato tra il cuore e il tuorlo. </li><li> Regolare il microscopio a basso ingrandimento e mettere a fuoco sul cuore separati. Utilizzare un pipetteman 10μl e impostarlo al volume 1ml. Applicare la punta del pipetteman per disegnare una o toccare ilcuore del campione, in modo che il cuore isolato sarà all'interno o attaccato alla superficie della punta. </li><li> Immergere la punta della pipetta nella soluzione di formaldeide al 4% sui vetrini preparati e premere il pistone pipetta per rilasciare il cuore nella soluzione. La tensione di superficie dell'acqua aiuta anche a liberare il cuore dalla punta della pipetta alla soluzione. Mettere meno di 3 cuori in ogni pozzetto. </li></ol> 3. Immunocolorazione <ol><li> Chiudere la camera e metterlo su un agitatore con un movimento dolce dondolio. Fissare il campione di cuore per 20 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Asciugare l'acqua sulla parte posteriore delle diapositive e mettere le diapositive sul palco di un microscopio per dissezione tampone scambio. </li><li> Intingere nell'acqua la punta di un pipetteman 10μl in una zona vuota di ogni bene e tenere la punta per quanto possibile dai campioni del cuore. Prendere precauzioni per evitare il cuore allegando alla punta, dato che il cuore può muovere con il flusso dell'acqua quando la soluzione viene disegnato in punta. Cambiarela localizzazione punta, se necessario. </li><li> Smaltire la soluzione su un tessuto ed evitare la produzione di eventuali bolle nella punta perché il campione cuore si perde facilmente in presenza di bolle d'aria. Mantenere i campioni cuore parzialmente a secco per un breve periodo può aiutare i cuori rimanere attaccati alle diapositive. </li><li> Aggiungere 50μl PBST per coprire il cuore del campione e incubare nella camera umidificata in un movimento a dondolo lento per 5 minuti. Ripetere il risciacquo una volta. Dopo questo passo, il cuore dei campioni possono essere conservati nella camera umidificata fino a 1 settimana a 4 ° C. </li><li> Blocca il campione di cuore con siero di pecora 10% in PBST per 1 ora a temperatura ambiente. </li><li> Incubare il campione cuore con anticorpi primari, come la diluizione 1:200 di β-catenina anticorpo e la diluizione di 1:200 MEF2 anticorpo specifico, nel 10% di siero ovino / PBST per 1 ora a temperatura ambiente. </li><li> Lavare il campione cuore con PBST tre volte (5 min.) A temperatura ambiente. </li><li> Incubare il campione con secondarioanticorpi, come ad esempio 1:1000 diluizione di Alexa-tagged anti-mouse e / o anticorpi anti-coniglio, in PBST per 0,5 ore. </li><li> Lavare i campioni cuore con PBST tre volte (5 min.) A temperatura ambiente. </li></ol> 4. Imaging <ol><li> Rimuovere PBST e aggiungere 10 microlitri di montaggio media in ciascun pozzetto. Rock the camera per diversi minuti fino alla soluzione diviene limpida. </li><li> Rimuovere la maggior parte del mezzo di montaggio e coprire tutti i pozzi in una diapositiva con un bicchiere di copertura microscopio (24x50). </li><li> Pesce cuore immagine utilizzando Zeiss Axioplan 2 microscopio dotato di ApoTome (Carl Zeiss). </li></ol> 5. Rappresentante Risultati Un esempio di un'immagine che rivela membrana e nuclei di tutti i cardiomiociti zebrafish è mostrato in fig. 1. anticorpi mef2c e β-catenina sono stati utilizzati insieme per colorare i campioni cuore sezionato da 52 embrioni di pesce zebra HPF. Mentre le macchie di anticorpi mef2c i nuclei di cardiomiociti, β-cateninaanticorpi rivela il confine di ogni 8-10 cellule. Regolando la fase del microscopio composto, le immagini dei campioni del cuore può essere regolata per lo stesso orientamento, che permetterà l'osservazione di curvatura esterno e curvatura interno nel cuore 11. Il numero totale dei cardiomiociti, le dimensioni delle cellule cardiomiociti, e la circolarità può essere misurata. Un altro esempio che rivela la struttura del sarcomero di un cuore embrionale è mostrato in fig. 2. Abbiamo eseguito immunostaining con F59, un anticorpo miosina, in un cuore sezionato embrionale. La rete miofibrilla in un cuore tutto embrionale può essere chiaramente rivelato a basso ingrandimento, mentre la band striato di filamenti spessi può essere rivelato a più alto ingrandimento (Fig. 2) 6. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3510/3510fig1.jpg"> Figura 1. Immunocolorazione di MEF2 (rosso) e β-catenina (verde) per mostrare i nuclei e outlines di cardiomiociti in un ventricolo zebrafish. Barra di scala = 10μm <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3510/3510fig2.jpg"> Figura 2. Immnostaining della miosina per mostrare il filamento spesso in un ventricolo zebrafish sia a basso ingrandimento (A) o ad alto ingrandimento (B). Barra di scala = 10μm

<ol><li>Shin, J. T., Fishman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+Zebrafish+to+human%3A+modular+medical+models%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Genomics+Hum.+Genet%22%5BJournal%5D)">From Zebrafish to human: modular medical models.</a> Annu. Rev. Genomics Hum. Genet. 3, 311-340 (2002).</li>
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<li>Auman, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+modulation+of+cardiac+form+through+regionally+confined+cell+shape+changes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Functional modulation of cardiac form through regionally confined cell shape changes.</a> PLoS Biol. 5, e53-e53 (2007).</li>
<li>Chen, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Depletion+of+zebrafish+essential+and+regulatory+myosin+light+chains+reduces+cardiac+function+through+distinct+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc.+Res%22%5BJournal%5D)">Depletion of zebrafish essential and regulatory myosin light chains reduces cardiac function through distinct mechanisms.</a> Cardiovasc. Res. 79, 97-108 (2008).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Rispetto ai metodi classici montare tutto immunostaining, il nostro metodo ha i seguenti vantaggi. In primo luogo, molto più forte dei segnali fluorescenti possono essere congruenti a causa di una migliore penetrazione. Nel metodo tutto immunostaining monte, il tessuto cutaneo denso che circonda il cuore ha ridotto significativamente la penetrazione di molti anticorpi, nel fondo di elevata in tutto il corpo. Questo problema è particolarmente grave per gli embrioni di età superiore ai 3 giorni di post-fertilizzazione (DP...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td></tr><tr><td> tricaine </td><td> Organici di ricerca </td><td> 3007T </td></tr><tr><td> Formaldeide </td><td> Polysciences </td><td> 04018 </td></tr><tr><td> Siringa di insulina </td><td> Becton Dickinson </td><td> 329461 </td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> Sigma </td><td> T8532 </td></tr><tr><td> Anti-β-catenina anticorpi </td><td> Sigma </td><td> C7207 </td></tr><tr><td> Anticorpi anti-Mef2c </td><td> Santa Cruz Biotech </td><td> SC313 </td></tr><tr><td> F59 </td><td> Zfin </td><td></td></tr><tr><td> Anti-α-actinina anticorpi </td><td> Sigma </td><td> A7811 </td></tr><tr><td> Anticorpi anti-Ilk </td><td> Segnalazione cellulare </td><td> # 3862 </td></tr><tr><td> Alexa fluor 568 capra anti IgG di coniglio </<html> td&gt; <td> Invitrogen </td><td> A11011 </td></tr><tr><td> Alexa fluor 488 capra anti IgG1 di topo </td><td> Invitrogen </td><td> A21121 </td></tr><tr><td> Mezzo di montaggio per fluorescenza </td><td> Vettore </td><td> H-1200 </td></tr><tr><td> ImmEdge penna </td><td> Vettore </td><td> H-4000 </td></tr><tr><td> Poli-L-lisina vetrini rivestiti </td><td> Microscopia elettronica a scienze </td><td> 63410-01 </td></tr><tr><td> Microscopio copertura in vetro </td><td> Pescatore </td><td> 12-543-D </td></tr><tr><td> Vetrini da microscopio concavo </td><td> Pescatore </td><td> 7-1305-8 </td></tr><tr><td> Dissezione microscopio </td><td> Leica MZ95 </td><td></td></tr><tr><td> Microscopio composto </td><td> Zeiss </td><td> Axioplan2 </td></tr><tr><td> ApoTome </td><td> Zeiss </td><td></td></tr></tbody></table> PBST: 1 x PBS 0,5% Triton-X 100 ENT &quot;&gt; 25X Tricaine: 400 mg Tricaine 97,9 mL DDH 2 O 2,1 ml (1M Tris pH9) Regolare il pH a 7,0

immunocolorazione di dissected cuore zebrafish embrionali

Immunostaining of Dissected Zebrafish Embryonic Heart 

Zebrafish embrione diventa un popolare modello vertebrato vivo per lo studio dello sviluppo delle malattie cardiache e cuore umano grazie alla sua vantaggiosa embriologia e genetica 1,2. Circa 100-200 embrioni sono disponibili ogni settimana da una singola coppia di pesci adulti. Gli embrioni che si sviluppano in utero trasparente ex li rendono ideali per la valutazione dei difetti cardiaci 3. L&#39;espressione di un gene può essere manipolato tramite morfolino tecnologia o RNA iniezione 4. Inoltre, in avanti schermi genetici hanno già generato una lista di mutanti che interessano diverse prospettive di cardiogenesis 5. Tutto immunocolorazione mount è una tecnica importante in questo modello animale per rivelare il pattern di espressione della proteina bersaglio di un particolare tessuto 6. Tuttavia, le immagini ad alta risoluzione che possono rivelare le strutture cellulari o subcellulari sono stati difficili, principalmente a causa della Locat fisicoione del cuore e la scarsa penetrazione degli anticorpi. Qui vi presentiamo un metodo per affrontare questi colli di bottiglia da dissezionare il cuore e poi condurre il processo di colorazione sulla superficie di un vetrino da microscopio. Per prevenire la perdita dei campioni piccolo cuore e da facilitare la manipolazione soluzione, abbiamo ristretto il cuore dei campioni all&#39;interno di un cerchio sulla superficie del microscopio diapositive tratte da una penna immEdge. Dopo la colorazione, i segnali di fluorescenza può essere osservata direttamente da un microscopio composto. Il nostro nuovo metodo migliora significativamente la penetrazione per gli anticorpi, perché un cuore da un pesce embrionale costituito solo da pochi strati di cellule. Immagini di alta qualità dal cuore intatto può essere ottenuto in tempi molto ridotti per la processione embrioni di zebrafish anni dal giorno 2 al giorno 6. Il nostro metodo può essere potenzialmente esteso a macchia di altri organi sezionati sia da zebrafish o altri piccoli animali.

Un modo rapido per condurre immunocolorazione cuore embrionale di zebrafish è descritto. Rispetto alla intero approccio immunostaining monte, questo metodo aumenta notevolmente la penetrazione degli anticorpi, che permette di ottenere immagini ad alta risoluzione che mostrano strutture cellulari / subcellulari nel cuore entro un tempo di elaborazione molto più ridotto.

Immunocolorazione di Dissected Cuore Zebrafish embrionali

L'embrione di zebrafish è diventato un popolare modello vertebrato in vivo per lo studio dello sviluppo cardiaco e delle malattie cardiache umane grazie alla sua vantaggiosa embriologia...

L'obiettivo generale di questa procedura è eseguire una colorazione immunoistochimica su cuori di embrioni di pesce zebra isolati, al fine di rivelare strutture cellulari o subcellulari con elevata risoluzione. Questo risultato si ottiene innanzitutto preparando vetrini in una camera umidificata per la colorazione immunoistochimica. Successivamente, il cuore viene isolato da un embrione di pesce zebra anestetizzato e quindi sottoposto a colorazione immunoistochimica con un anticorpo specifico.Quindi, le immagini dei cuori di pesce vengono documentate mediante un microscopio dotato di un aome. Infine, strutture cellulari o subcellulari nel cuore embrionale di zebrafish vengono rivelate utilizzando la microscopia a immunofluorescenza grazie a una penetrazione notevolmente aumentata. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come la colorazione immunoistochimica con montaggio in home, consiste nella possibilità di ottenere immagini di alta qualità del cuore standard di zebrafish. Per preparare una camera umidificata e proteggere i campioni dalla luce, utilizzare della carta d'alluminio per avvolgere la camera e il coperchio di una scatola per puntali vuota.Evitare che i campioni si secchino posizionando una pila di tovaglioli di carta bagnati sul fondo della camera, e collocare una piccola micropiattaforma sopra i tovaglioli di carta come supporto per i vetrini. Utilizzando una penna per immagini, disegnare pozzi sotto forma di cerchi o linee con dimensioni di circa cinque per cinque millimetri sulla superficie di un vetrino per microscopio. Lasciare asciugare i vetrini.Posizionare i vetrini nella camera umidificata e aggiungere 50 microlitri di formaldeide in ogni pozzetto. Per dissezionare il cuore embrionale, anestetizzare l'embrione di pesce nell'acqua per uova E3 contenente lo 0,4% di trica fino a quando il pesce arresta tutti i movimenti corporei, ma mantiene ancora un battito cardiaco normale. Circa un minuto.Trasferire gli embrioni in una cavità. Posizionare una lametta microscopica concava sul portapreparati di un microscopio stereoscopico utilizzando luce polarizzata tipo campo scuro o contrasto di interferenza differenziale (DIC). Regolare la luce del microscopio in modo da rivelare chiaramente il cuore.Successivamente, pulire due siringhe per insulina con etanolo al 75%. Quindi asciugare e aumentare l'ingrandimento del microscopio per mettere a fuoco il cuore. Successivamente, fissare fisicamente un embrione inserendo la punta di un ago nel tuorlo, in modo che il limite dell'acaro sia vicino alla testa.Quindi inserire un altro ago vicino alla regione cardiaca ed estrarre rapidamente il cuore. Se il cuore non è completamente separato dall'embrione, recidere il tessuto residuo che lo collega al tuorlo. Concentrarsi sul cuore utilizzando un ingrandimento minore.Con una pipetta da 10 microlitri regolata su un volume di un microlitro, posizionare la punta della pipetta in modo da aspirare o toccare il campione cardiaco, in modo che il cuore isolato si trovi all'interno o aderisca alla superficie della punta. Immergere la punta della pipetta nella soluzione di formaldeide su vetrini preparati e premere il pistone della pipetta per rilasciare il cuore nella soluzione.Con i cuori fissati in formaldeide sulle lamelle da depressione, chiudere la camera e posizionarla su un agitatore con movimento oscillante delicato per 20 minuti a temperatura ambiente; asciugare l'acqua presente sul retro delle lamelle e posizionare le lamelle sul piano di un microscopio stereoscopico per il cambio del buffer. Utilizzare una pipetta da 10 microlitri per aspirare con attenzione la formaldeide dalla lamella, lasciando indisturbati i cuori. Aggiungere 50 microlitri di PBST per coprire i campioni cardiaci e incubare nella camera umidificata per cinque minuti.Sciacquare nuovamente i cuori in PBST. Successivamente, bloccare il campione cardiaco con siero di pecora al 10% in PBST per un'ora a temperatura ambiente. Quindi incubare i campioni cardiaci con un'anticorpo primario specifico per beta catenina e F in diluizione da uno a 200 in PBST con siero di pecora al 10% per un'ora a temperatura ambiente.Lavare i campioni cardiaci con PBST tre volte per cinque minuti ciascuna a temperatura ambiente. Incubare i campioni con una diluizione 1:1000 di un'etichetta Alexa, di anticorpi secondari anti topo e/o anti coniglio in PBST per 30 minuti. Lavare nuovamente i campioni tre volte con PBST per l'acquisizione delle immagini.Rimuovere il PBST e aggiungere un microlitro di mezzo di montaggio a ciascun pozzetto. Agitare delicatamente la camera per alcuni minuti fino a quando la soluzione diventa limpida. Acquisire l'immagine del cuore del pesce utilizzando un microscopio Zeiss Axio Plan due dotato di un aome. In questa immagine, i nuclei e le membrane cellulari dei cardiomiociti di pesce zebra provenienti da un embrione di pesce zebra a 52 ore dalla fecondazione sono identificati mediante anticorpi diretti contro MEF due C e betaina, rispettivamente.Regolando la piastra del microscopio composto, è possibile orientare le immagini dei campioni cardiaci in modo uniforme, consentendo l'osservazione della curvatura esterna e della curvatura interna del cuore. Successivamente, possono essere misurati il numero totale di cardiomiociti, la dimensione delle cellule cardiomiocitarie e la circularità. Qui, la struttura sarcomerica di un cuore embrionale dissezionato è mostrata utilizzando l'anticorpo anti-miosina F 59. La rete Myo fial in un ventricolo cardiaco embrionale intero è chiaramente visibile a ingrandimento minore, mentre la banda striata dei filamenti spessi è osservabile a ingrandimento maggiore.Dopo aver guardato questo video, dovresti avere una buona comprensione di come eseguire la colorazione immunoistochimica del cuore di zebrafish dissecato, in particolare di come dissezionare il cuore da zebrafish April e di come manipolare il cuore durante il processo di immunostaining.

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