Isolamento e studio della biofisica cuticole di frutta

Questo esperimento utilizza tecniche biofisiche per valutare la capacità di reticolazione del polimero cuticolare del pomodoro, nonché per monitorare la rimozione selettiva delle cere epicuticolari e intracuticolari dalle cuticole dei frutti. L'isolamento della cuticola dall'intero frutto viene ottenuto mediante trattamento enzimatico delle bucce di pomodoro e delle pareti cellulari aderenti. In un secondo passaggio, un'estrazione con ate viene utilizzata per disperdere completamente le cere dalla cuticola del frutto, al fine di ottenere la caratterizzazione molecolare del cutina isolata.

Il poliestere biologico viene analizzato mediante risonanza magnetica nucleare allo stato solido. L'analisi spettrale mediante NMR allo stato solido rivela che nel cutina dei rivestimenti epicuticolari di frutti di pomodoro di tipo selvatico e ingegnerizzati esistono differenze nelle proporzioni relative di gruppi alifatici ossigenati capaci di formare legami incrociati. In alternativa, l'intero frutto viene ricoperto e pelato con gomma arabica per rimuovere le cere epicuticolari, quindi immerso nel cloroformio per eliminare le cere intracuticolari dal rivestimento epicuticolare del frutto.

Successivamente, le cuticole parzialmente dewassate, isolate mediante lo stesso trattamento enzimatico utilizzato per le bucce di pomodoro, vengono analizzate mediante risonanza magnetica nucleare in stato solido e microscopia a forza atomica. In definitiva, la rimozione sequenziale delle cere epicuticolari e intracuticolari risulta evidente dall'osservazione di un picco di cera progressivamente decrescente negli spettri NMR e da alterazioni nel profilo superficiale della cuticola del frutto, osservate mediante contemporanea imaging in AFM. Gli organi aerei delle piante sono protetti da un assemblaggio di poliestere e cera definito cuticola. Verranno presentati protocolli per valutare la rimozione selettiva delle cere interne ed esterne dalle cuticole del frutto del pomodoro, mediante risonanza magnetica nucleare in stato solido e microscopia a forza atomica.

Questi metodi possono essere utilizzati anche per valutare la capacità di reticolazione di materiali cuticolari ingegnerizzati. A dimostrare le procedure saranno tre membri del gruppo Stark: il dott. Ishish Chatterjee, la candidata al dottorato Shantani Sarkar e l'ex studentessa delle scuole superiori Julia Tik. Un ulteriore dimostratore è la dott.ssa Olivia Nisau, ricercatrice post-dottorato nel laboratorio del nostro collega di ingegneria chimica, il dott. Alexander S. Per iniziare l'isolamento enzimatico della buccia del pomodoro, posizionare tre frutti commerciali o coltivati in una ciotola, rimuovere la buccia in ampie sezioni e scartare il tessuto interno del pericarpo.

Quindi lavare le bucce di pomodoro con acqua deionizzata e conservarle sott'acqua in un becher, immergendo completamente la buccia di pomodoro sbucciata in un cocktail enzimatico preparato come descritto nel protocollo scritto. Incubare a 31 gradi Celsius per 24 ore con agitazione continua. Raccogliere le bucce di pomodoro utilizzando un imbuto di Büchner o un colino da cucina e lavarle con acqua deionizzata.

Dopo aver collocato le cuticole in un fornetto a vuoto a temperatura ambiente per un'ora, le cuticole essiccate possono essere conservate in un flacone etichettato e con tappo. Per le successive procedure di dewaxing, riempire un alveolo in vetro centrato o monouso all'incirca a metà con il campione di cuticola di pomodoro, utilizzando pinzette per posizionarlo con cura alla base della colonna di estrazione da utilizzare nell'estrazione solida. Proseguire con l'allestimento dell'apparato Soxhlet utilizzando metanolo come solvente, come descritto nel protocollo scritto.

Monitorare il processo per un'ora, regolando la tensione del variac in modo che nel serbatoio si accumuli circa una goccia al secondo e che il sifonamento avvenga all'interno dei calzini dell'apparato. Quando il cilindro è pieno, dopo un'estrazione di 12 ore, lasciare raffreddare l'apparato, quindi abbassare il mantello riscaldante ed estrarre l'estrattore e il serbatoio come un'unica unità per smaltire il solvente a seguito dell'estrazione. Inclinare la colonna per consentire il sifonamento nel flacone sottostante.

Utilizzare pinzette per sollevare il cilindro estrattivo appena sotto il collo della colonna di estrazione. Svuotare il solvente in eccesso e posizionare il cilindro su una superficie pulita. Scollegare il pallone e versare lo scarto in un contenitore per solventi etichettato.

Ripetere la procedura di estrazione con solventi successivi di polarità progressivamente decrescente, come cloroformio e taxano, per 12 ore ciascuno. Una volta che il campione di cuticola di pomodoro è secco, misurare la massa e conservarlo a temperatura ambiente in un barattolo con tappo a vite sigillato con paraffina. Per preparare il campione per la NMR, inserire quattro-sei milligrammi di cuticole di pomodoro completamente prive di cera, chiamate cutina, in un rotore in zirconia da 1,6 millimetri per Fast MAS, utilizzando lo strumento per il caricamento fornito dal produttore.

Dopo aver installato il cappuccio superiore, verniciarne metà con un pennarello a inchiostro nero per consentire la misurazione della velocità di rotazione. L'allestimento iniziale dell'esperimento di NMR in stato solido è un processo tecnicamente complesso e deve essere eseguito sotto la supervisione di personale esperto. Iniziare regolando l'omogeneità del campo magnetico e ottimizzando i parametri sperimentali utilizzando un composto modello, come descritto nel protocollo scritto. Inserire il rotore carico e confezionato nella sonda, quindi posizionare la sonda all'interno del magnete.

Aumentare gradualmente la velocità di rotazione fino a 10 kilohertz per verificare un buon impacchettamento del campione e la capacità del rotore di ruotare in modo stabile con una variazione inferiore a 20 hertz. Regolare iterativamente i condensatori di accordo e sintonia della sonda per ottenere una riflessione minima della potenza sia alle frequenze NMR del protone che del carbonio 13. Impostare la temperatura sperimentale a 25 gradi Celsius.

Avviare l'esperimento CPMA pre-ottimizzato corrispondente alla condizione di accoppiamento protoni-carbonio di Hartman-Hahn determinata alla frequenza di rotazione di 10 chilohertz. Dopo aver acquisito 4.096 transitori, condizionare lo spettro con un allargamento esponenziale della linea compreso tra 50 e 100 hertz ed eseguire una trasformata di Fourier per generare uno spettro NMR dell'intensità del segnale in funzione dello schermo chimico espresso in parti per milione. Riferire gli spostamenti chimici del carbonio-13 come descritto nel testo.

Aumentare la frequenza di rotazione del rotore a 15 kilohertz e ripetere la misurazione C-P-M-A-S corrispondente alla condizione di accoppiamento Hartman Han determinata all'analisi dello spostamento chimico in funzione della frequenza di rotazione del gradino del carbonio C-P-M-A-S. Gli spettri di risonanza magnetica nucleare al 13 C hanno identificato i principali gruppi funzionali presenti nella cuticola di pomodoro esaustivamente sottoposta a cera DW, inclusi PHA a catena lunga, PHA ossigenati, legami multipli, composti aromatici e rese di carbonio. Gli almo ossigenati svolgono un ruolo cruciale nel formare connessioni covalenti tra le unità monomeriche del biopolimero cutina, contribuendo così a formare l'architettura molecolare della matrice di cutina.

Differenze nelle aree relative dei picchi osservate nella regione spettrale compresa tra 45 e 100 parti per milione suggeriscono che la cutina mutante possiede una proporzione relativamente maggiore di gruppi strutturali CHO in grado di formare legami incrociati rispetto all'apina di tipo selvatico. Per iniziare l'isolamento selettivo delle cere epicuticolari ed intracuticolari.

Lavare un secondo lotto di pomodori interi con acqua distillata. Asciugarli con salviette di carta e tamponi Kim e disporli con il picciolo rivolto verso il basso su un pezzo di carta d'alluminio. Spennellare i pomodori interi dall'alto verso il basso con una soluzione acquosa di gomma arabica al 120%.

Lasciare asciugare la gomma arabica sulla superficie del frutto per un'ora, formando un sottile film. Rimuovere questo film con pinzette, evitando di forare la superficie del pomodoro. Un ulteriore trattamento del film, come descritto nel testo, consente di ottenere la cera cuticolare epicarpica.

I pomodori rimarranno fisicamente integri. Li si immerge nel cloroformio per due minuti. A temperatura ambiente, dopo aver evaporato il solvente, è possibile raccogliere la cera intracuticolare, pelare i pomodori e trattarli enzimaticamente con cellulasi e pectinato e tampone di acetato di sodio per rimuovere rispettivamente cellulosa e pectina.

È quindi possibile eseguire un'estrazione con sali, come descritto in precedenza, per eliminare completamente la cera dai pomodori. Gli esperimenti C-P-M-A-S possono essere ripetuti con campioni di cuticola di frutto naturali e parzialmente scerati, come descritto nel testo. La configurazione del microscopio a forza atomica è un processo complesso e viene eseguita al meglio sotto la supervisione iniziale di personale tecnico esperto. Una FM inizia accendendo il microscopio a sonda scansione, abbreviato SPM, e assicurandosi che l'interruttore di selezione della modalità del microscopio sia impostato sulla modalità di microscopia a forza atomica a contatto.

Successivamente, sollevare manualmente la testa dello SPM ruotando le due manopole anteriori regolabili dall'utente. Staccare il supporto della punta FM dalla testa dello SPM ruotando la vite di bloccaggio sul retro della testa. Utilizzare una pinzetta per rimuovere la mensola FM esistente dal suo supporto.

Quindi afferrare con cura un nuovo cantilever con punta in nitruro di silicio dal suo imballaggio e installarlo al posto del vecchio cantilever. Utilizzare un microscopio ottico per verificare che il cantilever FM appena installato non sia danneggiato. Fissare il campione di cuticola di pomodoro a un disco campione mediante nastro adesivo doppia faccia.

Utilizzare un microscopio ottico per verificare che il campione di cuticola rimanga piatto e liscio. Dopo aver posizionato il campione sul disco, collocare il campione di cuticola di pomodoro fissato al disco sulla zona magnetica in cima al microscopio a forza atomica (SPM). Ruotando le manopole, regolare le due viti manuali anteriori del microscopio in modo sufficientemente alto da evitare di rompere la punta AFM.

Quando il porta-punte viene inserito nella testa dello SPM, regolare la vite posteriore motorizzata a un livello approssimativamente uguale a quello delle altre due viti anteriori. Reinserire il porta-punte nella testa dello SPM e fissarlo serrando la vite di bloccaggio posteriore della testa. Dopo aver acceso il laser, allineare il punto laser su una mensola in modalità frequenza (FM) utilizzando le manopole di regolazione del laser centrale e destra situate sulla sommità della testa.

Monitorare il fascio laser riflesso su un foglio di carta per posizionare esattamente il punto laser all'estremità di una mensola in FM. Regolare la posizione del punto laser per ottenere un segnale somma massimo. Regolare la posizione del punto laser riflesso sul fotodetettore modificando la posizione dello specchio mobile in senso orizzontale e verticale, in modo che la luce incidente venga ricevuta in modo uniforme dai quattro quadranti.

Il rilevatore abbassa la punta FM ritraendo le viti frontali regolabili dall'utente e la vite posteriore motorizzata dello scanner SPM. Monitorare visivamente l'avvicinamento della punta FM alla superficie del campione mediante un microscopio invertito. Assicurarsi che tutte e tre le viti siano allo stesso livello.

Per evitare artefatti derivanti dall'acquisizione di immagini di un campione inclinato, avvicinare la punta al campione senza tuttavia avvicinarla troppo da toccare o perforare la superficie del campione. La luce laser riflessa dalla mensola del microscopio a forza atomica (AFM) verrà riflessa da uno specchio mobile verso un rilevatore fotosensibile per la modalità AFM a contatto con una sonda AFM in nitruro di silicio. Impostare la tensione del segnale in uscita a meno due volt per un punto di regolazione di zero volt e il segnale differenziale a zero volt, regolando la posizione dello specchio.

Utilizzando il software nano scope, fare clic sull'icona del microscopio e selezionare il profilo appropriato. Nel pannello delle impostazioni di controllo della scansione, impostare la velocità di scansione e la dimensione della scansione.

Consentire alla punta AFM di entrare in contatto con la superficie del campione facendo clic sull'icona di avvicinamento della punta. Controllando la vite posteriore motorizzata della base SPM, il programma abbasserà ora la punta fino a quando non entrerà in contatto con la superficie del campione. Il processo di scansione inizierà automaticamente non appena la punta avrà effettuato con successo il contatto.

Monitorare il processo di scansione utilizzando sia la modalità immagine che quella del microscopio del software, regolando iterativamente i parametri per ottenere immagini con la massima risoluzione, come descritto nel protocollo scritto. Ad esempio, iniziare la scansione con un valore elevato della scala dati dell'asse Z. Successivamente, ridurre con attenzione il valore della scala dati Z per ottenere il migliore contrasto delle caratteristiche superficiali nell'immagine.

Acquisire l'immagine per salvare il file di dati. Elaborare i dati utilizzando funzioni di appiattimento per rimuovere gli artefatti dell'immagine dovuti alla deriva verticale del scanner, alle curvature dell'immagine e allo scostamento verticale tra le linee di scansione. Infine, calcolare la rugosità media del carbonio.

Gli spettri di risonanza magnetica nucleare 13 C-P-M-A-S-N-M-R hanno mostrato una progressiva riduzione del picco della cera a 31 parti per milione, indicando la rimozione sequenziale delle cere epicuticolari e intracuticolari dal composito cuticola-cera, mantenendo nel contempo l'architettura chimica principale del biopolimero cutina in modo parallelo. Un'analisi dell'immagine in microscopia a forza atomica ha rivelato irregolarità superficiali dovute all'estrazione progressiva della cera epicuticolare e della cera intracuticolare dalla cuticola del frutto, indicando alterazioni nell'organizzazione dell'insieme cuticolare. Una volta padroneggiata questa tecnica, la rimozione sequenziale delle cere epicuticolari e intracuticolari dalle cuticole del frutto del pomodoro può essere completata in due ore.

Quando si esegue l'estrazione su colonna per l'analisi esaustiva delle cuticole dei frutti, è importante utilizzare un insieme di solventi a polarità variabile dopo aver impiegato il nodo di contatto. Viene illustrato qui un protocollo FM. Possono essere utilizzati ulteriori esperimenti FM per misurare l'elasticità superficiale della cuticola.

Dopo aver guardato questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come isolare sistematicamente i componenti dal composito ceroso della cutina e condurre l'analisi molecolare e un'esame rapido della superficie dei materiali della cuticola utilizzando rispettivamente risonanza magnetica in stato solido e microscopia a forza. Le tecniche illustrate in questo video permettono ai ricercatori nel campo della biologia vegetale di determinare la composizione molecolare e l'architettura supramolecolare di tessuti vegetali naturali e ingegnerizzati.