Name: Isolamento e studio della biofisica cuticole di frutta (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-30T12:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 53 s
Description: Scopri l'isolamento della cuticola del pomodoro e la rimozione selettiva di cere epi- e intracuticolari mediante NMR allo stato solido e microscopia a forza atomica. Questo metodo permette di valutare la capacità di reticolazione dei biopolimeri cuticolari.

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Questo lavoro è stato supportato dal US National Science Foundation sovvenzioni # 0741914 e-MCB MCB-0843627; ulteriore supporto infrastrutturale è stato fornito presso il City College di New York dal National Institutes of Health RR03060 2 G12-26 dal Centro Risorse Nazionale per la ricerca. Riconosciamo con gratitudine il JKC Rosa gruppo nel Dipartimento di Biologia Cornell University impianto per la fornitura di M82 (wild type) e CM15 (mutante) cuticole pomodoro. Ringraziamo il dottor Spyros Monastiriotis dal gruppo CCNY Ingegneria Chimica del Prof. Alexander Couzis per il suo aiuto generoso con gli esperimenti AFM. Ringraziamo la signora Lauren Gohara per il supporto progettazione grafica.

1. Isolamento enzimatica di pomodoro cuticole 5 <ol><li> Mettete i pomodori più commerciali o coltivata in una ciotola. Sbucciare la pelle dai frutti nelle sezioni di grandi dimensioni; eliminare il tessuto interno pericarpo. Lavare le bucce di pomodoro con acqua deionizzata e mantenere sotto acqua in un becher. </li><li> Preparare una 50 mM pH 4,0 tampone acetato di sodio (a 31 ° C) mettendo 1,22 g di sodio acetato triidrato (M r. 136,08 g / mol) e 2,34 ml di acido acetico glaciale (17,485 M) in un becher, aggiungendo 200 ml di acqua deionizzata, e quindi regolando il pH di 4,0 a 31 ° C. Preparare una miscela contenente 4 ml di pectinasi (EC 3.2.1.15; 10 U ml -1, TCI America), 0,2 g di cellulasi (CE 232.734.4; 1,3 unità / mg di solido, Sigma Aldrich), 13 mg e NaN 3, e quindi aggiungere 196 ml di tampone sodio acetato alla miscela di enzima per ottenere 200 ml di cocktail enzimatico finale. 5 immergere completamente la pelle pelati in cocktail enzima e incubarea 31 ° C per 24 ore con agitazione costante (G24 ambientale agitatore incubatore; New Brunswick Scientific Co.). </li><li> Raccogliere le bucce di pomodoro con un colino da cucina o imbuto Büchner e lavarli con acqua deionizzata. Successivamente, metterli in un forno sotto vuoto a temperatura ambiente per un'ora. Mantieni le bucce di pomodoro secchi in una bottiglia etichettata e limitato per le procedure di deceratura successive. </li></ol> 2. Deceratura esaustivo per estrazione Soxhlet 6 <ol><li> L'attrezzatura utilizzata per la deceratura esaustivo consiste in una sorgente di calore (riscaldamento mantello e Variac controller), pallone a fondo tondo per un serbatoio del solvente, Soxhlet, vetro sinterizzato ditale o ditale monouso, anti-ebollizione chip e un condensatore (vedi fig. 1). Si noti che il braccio sifone stretta (parti 6 e 7 in Fig. 1) è molto delicato e soggetto a rottura, richiedono un accurato trattamento. </li><li> Mettere 0,5-1 g di pelle di pomodoro (ottenuto infase 1.) in un mortaio, e macinare il campione di una polvere grossolana con un pestello meno che i campioni devono essere utilizzato per misurazioni AFM (punto 5). Riempire un ditale vetro sinterizzato o monouso approssimativamente a metà con il campione e utilizzare una pinzetta per posizionare accuratamente alla base della colonna di estrazione. </li><li> Collegare il condensatore e avvolgerlo con un foglio di alluminio. Riscaldare il metanolo solvente (ACS grado) in presenza di qualche anti-ebollizione chip fino ad ebollizione dolcemente e riflussi sulle pareti del pallone. Coprire il serbatoio del solvente sia con lana di vetro e foglio di alluminio. Controllare il processo per un'ora, regolando la tensione Variac in modo che il serbatoio si accumula su una goccia al secondo sifone e si verifica all'interno di Soxhlet quando il tamburo è pieno. </li><li> Continuare il processo di estrazione per 12 h, quindi abbassare il mantello di riscaldamento e consentire l'apparecchio si raffreddi. Rimuovere l'estrattore e il serbatoio come una singola unità di disporre del solvente. Utilizzare tweezers per sollevare il ditale a appena sotto il collo della colonna di estrazione, drenare l'eccesso di solvente da esso, e posizionare il tamburo su una superficie pulita. Inclinare la colonna di estrazione per consentire sifone nel pallone sottostante. Togliere il pallone e versare i rifiuti in un contenitore per rifiuti debitamente etichettato solvente. </li><li> Ripetere le fasi 2.3 e 2.4 per le successive solventi di polarità progressivamente decrescente, ad esempio, cloroformio ed esano per 12 h in ciascun caso. </li><li> Lasciare il campione cutina pomodoro per asciugare all'interno del ditale, o soffiando un flusso di gas azoto sopra o ponendolo in un forno sotto vuoto a temperatura ambiente. Infine, misurare la massa del campione secco e conservare a temperatura ambiente in un tappo a vite vaso sigillato con parafilm. </li></ol> 3. Isolamento selettivo delle Cere Epicuticular e intracuticolare 3,4 <ol><li> In primo luogo, lavare i pomodori interi (un lotto separato di pomodori da quelli descritti al punto 1.) Con acqua distillata. Asciugare con paper asciugamani e Kimwipes, e metterli staminali verso il basso su un pezzo di foglio di alluminio. </li><li> Dipingi i pomodori interi con il 120% (w / w, rapporto di massa), la gomma arabica soluzione acquosa in un top-down e consentire di moda circa un'ora per la gomma arabica ad asciugare sulla pelle del frutto, lasciando una sottile pellicola. Rimuovere la pellicola con una pinzetta, facendo attenzione a non forare la pelle di pomodoro. Ripetere la procedura una seconda volta. </li><li> Aggiungere i film di fiale contenenti 1:1 (v / v) cloroformio-acqua e agitare per tre minuti. Dopo agitazione vigorosa e separazione di fase, pipettare le frazioni di cloroformio e far evaporare in distinte fiale scoperti, lasciando cera epicuticular. I pomodori rimarranno fisicamente integra. Passarle in cloroformio per due minuti a temperatura ambiente e raccogliere la cera intracuticolare dopo evaporazione del solvente. Ora, buccia i pomodori e trattarli enzimaticamente (con cellulasi e pectinasi in tampone sodio acetato) per rimuovere cellulosa e pectina, rispettivamente (come descritto nella <li> Se desiderato, eseguire deceratura esaustiva di tali cuticole enzimaticamente isolate mediante estrazione Soxhlet (vedi punto 2), utilizzando tre solventi di polarità diversa (metanolo, cloroformio, esano e, rispettivamente). </li></li></ol> 4. Caratterizzazione molecolare di cutina Tomato Fruit dal Cross-polarizzazione Magic-angolo di Spinning a stato solido Risonanza Magnetica Nucleare (CPMAS ssNMR) 6 <ol><li> Luogo 4-6 mg di cuticole pomodoro pienamente deparaffinati (cutins) in un mm 1.6 fastMAS zirconia rotore utilizzando il tool fornito dal produttore di imballaggio. (Sia le cuticole pomodoro terra deparaffinati o pezzi molto piccoli di cuticole parzialmente deparaffinati sono adatti.) Accertarsi che il campione è imballato in modo uniforme, ma non troppo stretto, nel rotore. Dopo aver messo sul tappo superiore, dipingere mezzo del tappo con un inchiostro nero pennarello per facilitare le misure della velocità di rotazione. </li><li> Regolare la shimming dello spettrometro NMR per la larghezza minima riga spettrale a metà altezza unond calibrare il protone (1 H) e carbonio (13 C) 90 ° larghezza di impulso con un composto standard come adamantano. </li><li> Utilizzo di glicina o glutammina come composti modello, ottenere massima intensità del segnale ottimizzando tutti i parametri (Hartmann-Hahn corrispondenti livelli di potenza, 1 H - 13 C tempo di contatto, eteronucleari 1 H resistenza disaccoppiamento) delle cross-polarizzazione magic-angle spinning (CPMAS) esperimento. Per spettri acquisito a una frequenza di 1 H 600 MHz, condizioni raccomandate comprendono 10 kHz o 15 kHz frequenza di filatura, una 3-sec ritardo tra acquisizioni, e spinale protone eteronucleari disaccoppiamento 7 ad una intensità di campo magnetico equivalente a una frequenza di 185 kHz. </li><li> Inserire il cutina ricco di rotore nella sonda. Quindi, posizionare la sonda nel magnete. Aumentare la velocità di rotazione fino a 10 kHz a poco a poco per verificare imballaggio buon esempio e la stabilità del rotore. Verificare la stabilità di filatura finale del rotore entro± 20 Hz. </li><li> Regolare la sintonizzazione e corrispondenti condensatori della sonda iterativo per ottenere la riflessione minimo di energia sia 1 H e 13 C NMR frequenze. Impostare la temperatura sperimentale a 25 ° C (o temperatura ambiente). </li><li> Avviare il pre-ottimizzato esperimento CPMAS corrispondente alla Hartmann-Hahn determinata condizione di corrispondenza con la frequenza 10 kHz filatura. </li><li> Acquisire 4096 transitori, condizione dello spettro con esponenziale (Lorentzian) linea ampliamento di 50-100 Hz, e fare una trasformata di Fourier per generare uno spettro NMR di intensità del segnale vs chimica schermatura (ppm). </li><li> Fare riferimento alla chimica C 13 turni esternamente usando set adamantano a 38,4 ppm (-CH 2 - gruppo) 8 come standard. </li><li> Aumentare la frequenza del rotore di filatura a 15 kHz e ripetere la misurazione CPMAS (passi 4.6-4.8) corrispondente alla Hartmann-Hahn condizione di corrispondenza determinata in questa frequenza quest'ultimo filatura. </li><li> REPEagli esperimenti CPMAS (passi 4.1-4.9) con i campioni di frutta naturali (ceroso) e parzialmente decerati cuticola. </li></ol> 5. Sondaggio della superficie della cuticola di pomodoro con microscopia a forza atomica (Digital Instruments Nanoscope IIIa, le procedure possono variare leggermente tra i microscopi) 6 <ol><li> Accendere il microscopio a scansione di sonda (SPM) (Fig. 2) e assicurarsi che il selettore di modalità microscopio toggle è impostata la microscopia a forza atomica contatto (AFM) mode. </li><li> Manualmente sollevare la testa SPM ruotando i suoi due regolabili dall'utente manopole frontali. Staccare il tipholder AFM dalla testa SPM ruotando la vite di bloccaggio nella parte posteriore della testa. </li><li> Utilizzare delle pinzette per rimuovere il cantilever AFM esistente dal tipholder, poi accuratamente afferrare un nuovo sbalzo di nitruro di silicio (AFM sonda) dalla confezione e installarlo al posto del cantilever vecchia. Utilizzare un microscopio ottico per verificare che il cantilever appena installato AFM non è rotto. </li><li> Allega °cuticola e del campione di pomodoro (una sezione della cuticola di pomodoro parzialmente deparaffinati ~ 10 mm x 10 mm) su un disco in acciaio inox (campione puck) con nastro biadesivo. Utilizzare un microscopio ottico per verificare che la superficie cuticola rimane piatto e liscio dopo il posizionamento del campione sul disco. </li><li> Posizionare il disco con il campione pomodoro cuticola sulla regione magnetica nella parte superiore dello scanner SPM. </li><li> Impostare le prime due viti di regolazione manuale dello scanner ad alta ruotando le manopole, impostare la vite di regolazione motorizzata ritornato più o meno allo stesso livello delle altre due viti frontali. Assicurarsi che tutte e tre le viti siano abbastanza alto per evitare di rompere la punta AFM quando si posiziona il tipholder nella testa SPM. </li><li> Reinserire il tipholder nella testa SPM e fissarlo stringendo la vite di bloccaggio nella parte posteriore della testa. </li><li> Dopo aver acceso il laser, allineare il punto laser sul cantilever AFM utilizzando la centrale (y) e destro (x) manopole di regolazione laser sulla parte superiore della testa.Monitorare il fascio laser riflesso su un pezzo di carta per posizionare il punto laser esattamente al termine del cantilever AFM. </li><li> Regolare la posizione dello specchio mobile iterativamente con le manopole di regolazione fotorivelatore per ottenere massimo segnale (segnale di somma), assicurando così che il fascio laser riflesso viene ricevuto in modo uniforme i quattro quadranti del fotorivelatore. </li><li> Abbassare la punta AFM ritraendo i manuali viti anteriori di regolazione e la vite di regolazione motorizzata retro dello scanner SPM, monitorare visivamente l'approccio della punta AFM verso la superficie del campione con un microscopio invertito. Assicurarsi che tutte e tre le viti siano allo stesso livello, per evitare artefatti dalle immagini di un campione inclinato. Portare la punta verso il campione, ma non così vicino che i tocchi di punta o interruzioni attraverso la superficie del campione. </li><li> A questo punto, la luce laser riflessa sul cantilever AFM rimbalzano lo specchio mobile al fotorivelatore. Per il modo AFM contatto con un siliAFM con nitruro di punta, impostare il segnale di OUTPUT (deflessione verticale) Tensione a -2 V per V 0 Setpoint e il segnale DIFF (verticale / orizzontale differenza) a 0 V regolando la posizione dello specchio. </li><li> Utilizzando il software Nanoscope, fare clic sull'icona microscopio e selezionare il profilo appropriato (Contact modalità AFM). </li><li> Con la funzione "Controlla le impostazioni di scansione" pannello, impostare la velocità di scansione e le dimensioni ad esempio la scansione, 10 micron formato di scansione e 2 Hz frequenza di scansione. </li><li> Lasciare la punta AFM per impegnare la superficie del campione, fare clic sul impegnarsi punta icona. Controllando la vite motorizzata posteriore della base SPM, il programma sarà ora abbassare la punta fino ad impegnare la superficie del campione. Il processo di scansione si avvia automaticamente una volta che la punta si è impegnata con successo. </li><li> Monitorare il processo di scansione utilizzando entrambe le modalità di immagine e campo di applicazione del software, la regolazione dei parametri quali setpoint, guadagno integrale, guadagno proporzionale, dimensioni di scansione, velocità di scansione, linee e campioni per linea iterativo per ottenere il massimorisoluzione delle immagini. Avviare la scansione con un grande asse Z range (scala di dati), poi accuratamente ridurre il valore di scala di dati per osservare il miglior contrasto delle caratteristiche superficiali sull'immagine. Minimizzare il verificarsi di aree bianche nell'immagine scansionata, che indicano che l'altezza delle caratteristiche superficiali supera la disposizione asse z gamma. </li><li> Cattura l'immagine per salvare il file di dati, quindi elaborare i dati utilizzando le funzioni di spianatura per rimuovere artefatti dovuti alla verticale (Z) deriva scanner, archi di immagine, e verticale tra le linee di scansione; 9 Infine calcolare la rugosità media. Dopo aver salvato i dati, ritirare la punta AFM invertendo l'azione del computer controllato motore della vite che è stato usato per farlo scattare. L'elaborazione delle immagini può essere eseguita in modalità offline analisi delle immagini e / o utilizzando un computer diverso. </li><li> Utilizzare le manopole frontali in metallo grigio fondo del titolare punta a modificare le posizioni x e y dell'area di scansione, quindi ripetere la misurazione a campione loca cinquezioni per verificare la riproducibilità, sostituendo il cantilever AFM se la qualità dell'immagine si deteriora. </li></ol> 6. Risultati rappresentativi Spostamento Analisi chimica del CPMAS 13 C NMR (Fig. 3) ha identificato i principali gruppi funzionali presenti nella cuticola di pomodoro esaustivo deparaffinati (cutina). Le frazioni di carbonio chiave nella biopolyester cutina sono risultate alifatici a catena lunga (0-45 ppm), alifatici ossigenato (45-110 ppm), si moltiplicano-bonded e aromatici (110-160 ppm) e carbonili (160-220 ppm). Le frazioni alchiliche ossigenati (CHO + CH 2 O) svolgono un ruolo determinante nello stabilire connessioni covalenti tra le unità monomeriche del biopolimero cutina, formando in tal modo l'architettura molecolare della matrice cutina. Le differenze nelle aree dei picchi relativi osservate nella regione spettrale tra 45 e 100 ppm suggeriscono che la cutina mutante ha una percentuale relativamente alta di cross-link di formazione CHO structura frazioni l rispetto al wild-type cutina; attente misurazioni quantitative con polarizzazione diretta (DPMAS) NMR 5 metodi supportano questa inferenza (dati non riportati). CPMAS 13 C NMR ha mostrato un picco cera progressivamente decrescente a 31 ppm (Fig. 4), indicando la rimozione sequenziale di epi-e cere intracuticolare dal cutina-cera composito mantenendo l'architettura principale chimica del biopolimero cutina. Parallela analisi dell'immagine AFM (Fig. 5) ha rivelato irregolarità superficiali dovuti alla estrazione graduale di epi-e cere intracuticolare dalla cuticola frutta, significando alterazioni nell'organizzazione del gruppo cuticolare. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3529/3529fig1.jpg"> . Figura 1 estrattore Soxhlet (fonte immagine: Wikipedia). "/&gt; Figura 2. A) microscopio elettronico a scansione. B) SPM testa (tratto dal manuale di formazione AFM previste dagli strumenti digitali). <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3529/3529fig3.jpg"> Figura 3. 150 MHz CPMAS 13 C spettri NMR del esaustivo deparaffinati cuticole pomodoro frutta rossa matura (cutins) da wild-type (M82) e mutanti (CM15) mostrano risonanze con spostamenti chimici corrispondente ai gruppi funzionali di un reticolato acido hydroxyfatty poliestere a base ed anche alcune frazioni moltiplicano incollati. Tutti gli spettri sono stati acquisiti con una frequenza di 10 kHz filatura. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/3529/3529fig4.jpg"> Figura 4. 150 MHz 13 CCPMAS spettri NMR delle cuticole commerciali pomodoro frutta rossa matura mostrano cambiamenti di composizione dopo la rimozione sequenziale delle cere epicuticular e intracuticolare mediante estrazione meccanica gomma arabica e un two minuti di cloroformio dip, rispettivamente. Tutti gli spettri sono stati acquisiti con una frequenza di 15 kHz filatura. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/3529/3529fig5.jpg"> Figura 5. Immagini AFM e stime rugosità per il pomodoro parzialmente deparaffinati commerciale cuticole descritto in Figura 4, dopo la rimozione graduale di epicuticular (sinistra) e intracuticolare (destra) cere.

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<li>Muller, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AFM%3A+A+Nanotool+in+Membrane+Biology%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">AFM: A Nanotool in Membrane Biology.</a> Biochemistry. 47, 7986-7998 (2008).</li>
<li>Last, J. A., Russell, P., Nealey, P. F., Murphy, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Applications+of+Atomic+Force+Microscopy+to+Vision+Science%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">The Applications of Atomic Force Microscopy to Vision Science.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51, 6083-6094 (2010).</li>
</ol>

Non ci sono conflitti di interesse dichiarati.

I protocolli descritti consentono dettagliata caratterizzazione molecolare e microscala di un materiale complesso vegetale intrattabile senza la necessità di decomposizione chimica distruttiva. Per studiare la fusione del biopolyester cutina con vari lipidi (cere), che controllano l&#39;organizzazione strutturale del gruppo cuticolare, il 10 abbiamo condotto e monitorato le procedure per la rimozione selettiva di cere e epicuticular intracuticolare dalla fusione eterogenea cuticolare. Stato solido 13 C NMR è stato usato per misurare l&#39;estrazione dei componenti molecolari cera, e microscopia a forza atomica servita per esaminare conseguenti modifiche della ruvidità superficiale. 6,11 Per confrontare i reticolanti capacità di cutins da coltivata wild-type e singolo gene bacche di pomodoro mutanti, allo stato solido 13 C NMR è stato anche usato per stimare il numero relativo di CHO e CH 2 O porzioni chimiche. Un certo numero di funzionalità di progettaziones di questo protocollo sono notevoli. Poiché i materiali cera comprendono una vasta gamma di lipidi, trattando la cuticola frutta con una serie di solventi aventi polarità divergenti è essenziale per ottenere deparaffinazione esaustiva. Inoltre, il tempo di deparaffinazione può variare da 8 ore a 24 ore a seconda della natura dei campioni cuticola. Per estrarre cere epicuticular costantemente dalla cuticola frutto intatto, è indispensabile per applicare il rivestimento adesivo uniformemente alla superficie. Stato solido CPMAS 13 C NMR 12 è un metodo qualitativo rapido per identificare vari componenti strutturali di biopolimeri vegetali altamente insolubile eterogenei e mantenendo le caratteristiche fisiche nativi; 13 soluzione tradizionale-NMR allo stato può anche essere utilizzato per caratterizzare le miscele di cera estratti. Se la stima quantitativa dei gruppi funzionali si desidera per i polimeri pianta intatta, 5 ad alta fedeltà diretta polarizzazione magic-angle spinning (DPMA) 13 C NMR 5,14 deve essere utilizzato come metodo complementare. Quantificazione accurata dei gruppi funzionali richiede una attenta ottimizzazione dei tempi di ricarica, le lunghezze di impulso di eccitazione, e la forza di disaccoppiamento eteronucleari. 15 Il disaccoppiamento eteronucleari può essere impostata per una forza di campo H 1 da 50 kHz a 185 kHz utilizzando il TPPM 16 o SPINALI 7 metodologie. In aggiunta a questi parametri, la sensibilità di misurazione CPMAS dipende dalla spin-lock tempo e Hartmann-Hahn condizione di corrispondenza. 15 In luogo di CPMAS tradizionali, una rampa di ampiezza-CP (RAMP-CP) tecnica può essere implementata per massimizzare la croce -polarizzazione variando l&#39;efficienza di ampiezza 1 H linearmente (~ 20-50%) o tangenzialmente mantenendo l&#39;ampiezza di 13 intensità di campo C costante durante il periodo di spin-lock (o viceversa). 17,18 effettuare la misura in CPMAS un minimo di due ro diversetor-filatura frequenze è indispensabile per distinguere bande laterali filatura dalle vette principali spettrali. Simultanee effettuate misurazioni AFM in modalità contatto consentire l&#39;imaging diretto della condizione della superficie cuticola con velocità di scansione elevate e ad alta risoluzione, 19 per esempio durante la rimozione sequenziale di componenti cerose. Operativo AFM in maschiatura (senza contatto) può essere usato come alternativa per la caratterizzazione superficie di delicati &quot;soft&quot; materiali vegetali, evitando possibili danni dovuti a laterali (taglio) forze e raschiatura della superficie del campione. 5,20 In entrambi i casi , l&#39;acquisizione sequenziale di immagini multiple nello stesso punto sulla superficie serve per individuare eventuali danni alla superficie a causa della &quot;sonda-superficie interazioni&quot; nelle misurazioni AFM. 6,21 per la riproducibilità ottimale, sonde AFM con costanti elastiche adatte per superfici morbide cuticolari dovrebbe essere utilizzati, e costanza di temperatura e umidità deve essere mantenuta. 6,15,20 </sup&gt; considerando che la NMR a stato solido offre un profilo molecolare di ensemble media (bulk) immobili a cuticole frutto di pomodoro, l&#39;imaging a forza atomica fornisce una sonda complementare non invasiva 22,23 per il tracciamento della topografia superficiale di queste assemblee squisitamente complessi macromolecolari. 1,2

<table><tbody><tr><td>Acetato di sodio triidrato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8625-500G</td><td></td></tr><tr><td>Pectinasi</td><td>TCI America</td><td>P0026</td><td>EC 3.2.1.15; 10 U ml&lt;sup&gt;-1&lt;/sup&gt;, conservare in frigorifero</td></tr><tr><td>Cellulasi</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1184-100KU</td><td>EC232.734.4; 1,3 unità/mg, conservare in frigorifero</td></tr><tr><td>Acido acetico glaciale</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9967</td><td></td></tr><tr><td>Azoturo di sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2002-100G</td><td>Estremamente pericoloso</td></tr><tr><td>Incubatore/agitatore</td><td>New Brunswick Scientific</td><td>Modello n. G24</td><td>N. di produzione M1036-000G</td></tr><tr><td>Forno a vuoto</td><td>Precision Scientific</td><td>31566</td><td></td></tr><tr><td>Regolatore Variac</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Capsula in vetro sinterizzato (85 mm/25 mm)</td><td>VWR international</td><td>89056</td><td></td></tr><tr><td>Capsula di estrazione monouso (80 mm/25 mm)</td><td>VWR international</td><td>28320</td><td></td></tr><tr><td>Metanolo</td><td>VWR international</td><td>EMD-MX0485-7</td><td></td></tr><tr><td>Lana di vetro</td><td>VWR international</td><td>RK20789</td><td></td></tr><tr><td>Foglio di alluminio</td><td>Fisher Scientific</td><td>01-213-100</td><td></td></tr><tr><td>Pinzette</td><td>VWR international</td><td>82027-452</td><td></td></tr><tr><td>Cloroformio</td><td>VWR international</td><td>EM-CX1050-1</td><td></td></tr><tr><td>Esano</td><td>Fisher Scientific</td><td>H302-4</td><td></td></tr><tr><td>Gas azoto</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>VWR international</td><td>52858</td><td></td></tr><tr><td>Carta assorbente</td><td>VWR international</td><td>89002-984</td><td></td></tr><tr><td>Kim wipes</td><td>VWR international</td><td>21905-026</td><td></td></tr><tr><td>Gomma arabica</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9752</td><td></td></tr><tr><td>Rotore in zirconia 1,6 mm fastMAS</td><td>Varian Inc., Agilent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spettrometro NMR</td><td>Varian Inc., Agilent</td><td>magnete a foro standard</td><td></td></tr><tr><td>Glicina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>50046</td><td>Composto modello per CPMAS</td></tr><tr><td>Glutammina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>49419</td><td>Composto modello per CPMAS</td></tr><tr><td>Adamantano</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>100277</td><td>Per calibrare l'impulso a 90&amp;#x00B0; in NMR</td></tr><tr><td>Microscopio multifunzione a sonda (Nanoscope IIIA)</td><td>Digital Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Software Nanoscope</td><td>Digital Instruments</td><td></td><td>Versione 5.30r3sr3 (2005)</td></tr><tr><td>Sonda AFM (punta in nitruro di silicio non conduttiva)</td><td>Veeco Instruments, Inc.</td><td>Modello NP-20</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio ottico</td><td>Digital Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Piastrina magnetica</td><td>Digital Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nastro adesivo doppia faccia</td><td>VWR international</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sbucciaverdure</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Imbuto di B&amp;#252;chner</td><td>VWR international</td><td>89038</td><td></td></tr></tbody></table>

isolamento e studio della biofisica cuticole di frutta

Isolation and Biophysical Study of Fruit Cuticles

La cuticola, uno strato idrofobico di protezione sulle parti aeree delle piante terrestri, funziona come una barriera difensiva versatile a diversi stress biotici e abiotici e regola anche il flusso di acqua dall&#39;ambiente esterno. 1 A biopolyester (cutina) e acidi grassi a catena lunga ( cere) costituiscono il quadro strutturale principale della cuticola, l&#39;integrità funzionale dello strato cuticolare dipende lo strato esterno &#39;epicuticular&#39; nonché la miscela consistente del biopolimero cutina e dei intracuticolare dei cere 2 Qui, si descrive un protocollo completo. per estrarre cere esaustivamente dal pomodoro commerciale (Solanum lycopersicum) cuticole di frutta o di cancellare cere epicuticular e intracuticolare in sequenza e in modo selettivo dal composito cuticola. Il metodo di Jetter e Schaffer (2001) è stato adattato per l&#39;estrazione graduale delle cere epicuticular e intracuticolare dalla cuticola frutto. 3,4 Per monitorare laprocesso di rimozione della cera sequenziale, a stato solido cross-polarizzazione-magic-angle spinning (CPMAS) 13 C NMR è stato utilizzato in parallelo con microscopia a forza atomica (AFM), fornendo profili strutturali a livello molecolare dei materiali sfusi integrata da informazioni sulle microscala la topografia e la rugosità delle superfici cuticolari. Per valutare le capacità di cross-linking di cuticole deparaffinati frutti coltivati ​​da wild-type e singolo gene di pomodoro mutanti, MAS 13 C NMR è stato utilizzato per confrontare le proporzioni relative di alifatici ossigenati (CHO e CH 2 O) porzioni chimiche. Deparaffinazione esaustivo per estrazione Soxhlet graduale con un pannello di solventi di varia polarità fornisce un mezzo efficace per isolare porzioni di cera in base alle caratteristiche idrofobiche della loro costituenti aromatici e alifatici, pur mantenendo la struttura chimica del biopolyester cutina. L&#39;estrazione meccanica di cere epicuticular e Selerimozione ctive di cere intracuticolare, quando monitorati da complementari metodologie fisiche, fornisce un mezzo senza precedenti per indagare il gruppo cuticola: questo approccio rivela l&#39;organizzazione strutturale supramolecolare e integrazione di vari tipi di cere, l&#39;architettura del cutina-cera matrice, e la chimica composizione di ciascun componente. Inoltre, allo stato solido 13 C NMR rivela differenze nei numeri relativi di CHO e CH 2 porzioni chimiche O per frutti rossi wild-type e mutanti pomodoro maturo. Le tecniche NMR offrono strumenti eccezionali per impronte la struttura molecolare dei materiali cuticolari che sono insolubili, amorfa, e chimicamente eterogeneo. Come non invasivo superficie selettiva tecnica di imaging, AFM fornisce uno strumento efficace e diretto per sondare l&#39;organizzazione strutturale del gruppo cuticolare sul nm-micron scala di lunghezza.

Organi della pianta aeree sono protetti dalla cuticola, uno supramolecolare biopolyester-cera di montaggio. Vi presentiamo i protocolli per monitorare la rimozione selettiva di epi-e cere intracuticolare da cuticole frutto di pomodoro su scala molecolare e micro da NMR allo stato solido e di microscopia a forza atomica, rispettivamente, e per valutare la capacità di cross-linking di ingegneria biopolyesters cuticolari.

Isolamento e studio della biofisica cuticole di frutta

La cuticola, uno strato protettivo idrofobico sulle parti aeree delle piante terrestri, funge da versatile barriera difensiva contro vari agenti biotici e...

Questo esperimento utilizza tecniche biofisiche per valutare la capacità di reticolazione del polimero cuticolare del pomodoro, nonché per monitorare la rimozione selettiva delle cere epicuticolari e intracuticolari dalle cuticole dei frutti. L'isolamento della cuticola dall'intero frutto viene ottenuto mediante trattamento enzimatico delle bucce di pomodoro e delle pareti cellulari aderenti. In un secondo passaggio, un'estrazione con ate viene utilizzata per disperdere completamente le cere dalla cuticola del frutto, al fine di ottenere la caratterizzazione molecolare del cutina isolata.Il poliestere biologico viene analizzato mediante risonanza magnetica nucleare allo stato solido. L'analisi spettrale mediante NMR allo stato solido rivela che nel cutina dei rivestimenti epicuticolari di frutti di pomodoro di tipo selvatico e ingegnerizzati esistono differenze nelle proporzioni relative di gruppi alifatici ossigenati capaci di formare legami incrociati. In alternativa, l'intero frutto viene ricoperto e pelato con gomma arabica per rimuovere le cere epicuticolari, quindi immerso nel cloroformio per eliminare le cere intracuticolari dal rivestimento epicuticolare del frutto.Successivamente, le cuticole parzialmente dewassate, isolate mediante lo stesso trattamento enzimatico utilizzato per le bucce di pomodoro, vengono analizzate mediante risonanza magnetica nucleare in stato solido e microscopia a forza atomica. In definitiva, la rimozione sequenziale delle cere epicuticolari e intracuticolari risulta evidente dall'osservazione di un picco di cera progressivamente decrescente negli spettri NMR e da alterazioni nel profilo superficiale della cuticola del frutto, osservate mediante contemporanea imaging in AFM. Gli organi aerei delle piante sono protetti da un assemblaggio di poliestere e cera definito cuticola. Verranno presentati protocolli per valutare la rimozione selettiva delle cere interne ed esterne dalle cuticole del frutto del pomodoro, mediante risonanza magnetica nucleare in stato solido e microscopia a forza atomica.Questi metodi possono essere utilizzati anche per valutare la capacità di reticolazione di materiali cuticolari ingegnerizzati. A dimostrare le procedure saranno tre membri del gruppo Stark: il dott. Ishish Chatterjee, la candidata al dottorato Shantani Sarkar e l'ex studentessa delle scuole superiori Julia Tik. Un ulteriore dimostratore è la dott.ssa Olivia Nisau, ricercatrice post-dottorato nel laboratorio del nostro collega di ingegneria chimica, il dott. Alexander S. Per iniziare l'isolamento enzimatico della buccia del pomodoro, posizionare tre frutti commerciali o coltivati in una ciotola, rimuovere la buccia in ampie sezioni e scartare il tessuto interno del pericarpo.Quindi lavare le bucce di pomodoro con acqua deionizzata e conservarle sott'acqua in un becher, immergendo completamente la buccia di pomodoro sbucciata in un cocktail enzimatico preparato come descritto nel protocollo scritto. Incubare a 31 gradi Celsius per 24 ore con agitazione continua. Raccogliere le bucce di pomodoro utilizzando un imbuto di Büchner o un colino da cucina e lavarle con acqua deionizzata.Dopo aver collocato le cuticole in un fornetto a vuoto a temperatura ambiente per un'ora, le cuticole essiccate possono essere conservate in un flacone etichettato e con tappo. Per le successive procedure di dewaxing, riempire un alveolo in vetro centrato o monouso all'incirca a metà con il campione di cuticola di pomodoro, utilizzando pinzette per posizionarlo con cura alla base della colonna di estrazione da utilizzare nell'estrazione solida. Proseguire con l'allestimento dell'apparato Soxhlet utilizzando metanolo come solvente, come descritto nel protocollo scritto.Monitorare il processo per un'ora, regolando la tensione del variac in modo che nel serbatoio si accumuli circa una goccia al secondo e che il sifonamento avvenga all'interno dei calzini dell'apparato. Quando il cilindro è pieno, dopo un'estrazione di 12 ore, lasciare raffreddare l'apparato, quindi abbassare il mantello riscaldante ed estrarre l'estrattore e il serbatoio come un'unica unità per smaltire il solvente a seguito dell'estrazione. Inclinare la colonna per consentire il sifonamento nel flacone sottostante.Utilizzare pinzette per sollevare il cilindro estrattivo appena sotto il collo della colonna di estrazione. Svuotare il solvente in eccesso e posizionare il cilindro su una superficie pulita. Scollegare il pallone e versare lo scarto in un contenitore per solventi etichettato.Ripetere la procedura di estrazione con solventi successivi di polarità progressivamente decrescente, come cloroformio e taxano, per 12 ore ciascuno. Una volta che il campione di cuticola di pomodoro è secco, misurare la massa e conservarlo a temperatura ambiente in un barattolo con tappo a vite sigillato con paraffina. Per preparare il campione per la NMR, inserire quattro-sei milligrammi di cuticole di pomodoro completamente prive di cera, chiamate cutina, in un rotore in zirconia da 1,6 millimetri per Fast MAS, utilizzando lo strumento per il caricamento fornito dal produttore.Dopo aver installato il cappuccio superiore, verniciarne metà con un pennarello a inchiostro nero per consentire la misurazione della velocità di rotazione. L'allestimento iniziale dell'esperimento di NMR in stato solido è un processo tecnicamente complesso e deve essere eseguito sotto la supervisione di personale esperto. Iniziare regolando l'omogeneità del campo magnetico e ottimizzando i parametri sperimentali utilizzando un composto modello, come descritto nel protocollo scritto. Inserire il rotore carico e confezionato nella sonda, quindi posizionare la sonda all'interno del magnete.Aumentare gradualmente la velocità di rotazione fino a 10 kilohertz per verificare un buon impacchettamento del campione e la capacità del rotore di ruotare in modo stabile con una variazione inferiore a 20 hertz. Regolare iterativamente i condensatori di accordo e sintonia della sonda per ottenere una riflessione minima della potenza sia alle frequenze NMR del protone che del carbonio 13. Impostare la temperatura sperimentale a 25 gradi Celsius.Avviare l'esperimento CPMA pre-ottimizzato corrispondente alla condizione di accoppiamento protoni-carbonio di Hartman-Hahn determinata alla frequenza di rotazione di 10 chilohertz. Dopo aver acquisito 4.096 transitori, condizionare lo spettro con un allargamento esponenziale della linea compreso tra 50 e 100 hertz ed eseguire una trasformata di Fourier per generare uno spettro NMR dell'intensità del segnale in funzione dello schermo chimico espresso in parti per milione. Riferire gli spostamenti chimici del carbonio-13 come descritto nel testo.Aumentare la frequenza di rotazione del rotore a 15 kilohertz e ripetere la misurazione C-P-M-A-S corrispondente alla condizione di accoppiamento Hartman Han determinata all'analisi dello spostamento chimico in funzione della frequenza di rotazione del gradino del carbonio C-P-M-A-S. Gli spettri di risonanza magnetica nucleare al 13 C hanno identificato i principali gruppi funzionali presenti nella cuticola di pomodoro esaustivamente sottoposta a cera DW, inclusi PHA a catena lunga, PHA ossigenati, legami multipli, composti aromatici e rese di carbonio. Gli almo ossigenati svolgono un ruolo cruciale nel formare connessioni covalenti tra le unità monomeriche del biopolimero cutina, contribuendo così a formare l'architettura molecolare della matrice di cutina.Differenze nelle aree relative dei picchi osservate nella regione spettrale compresa tra 45 e 100 parti per milione suggeriscono che la cutina mutante possiede una proporzione relativamente maggiore di gruppi strutturali CHO in grado di formare legami incrociati rispetto all'apina di tipo selvatico. Per iniziare l'isolamento selettivo delle cere epicuticolari ed intracuticolari.Lavare un secondo lotto di pomodori interi con acqua distillata. Asciugarli con salviette di carta e tamponi Kim e disporli con il picciolo rivolto verso il basso su un pezzo di carta d'alluminio. Spennellare i pomodori interi dall'alto verso il basso con una soluzione acquosa di gomma arabica al 120%.Lasciare asciugare la gomma arabica sulla superficie del frutto per un'ora, formando un sottile film. Rimuovere questo film con pinzette, evitando di forare la superficie del pomodoro. Un ulteriore trattamento del film, come descritto nel testo, consente di ottenere la cera cuticolare epicarpica.I pomodori rimarranno fisicamente integri. Li si immerge nel cloroformio per due minuti. A temperatura ambiente, dopo aver evaporato il solvente, è possibile raccogliere la cera intracuticolare, pelare i pomodori e trattarli enzimaticamente con cellulasi e pectinato e tampone di acetato di sodio per rimuovere rispettivamente cellulosa e pectina.È quindi possibile eseguire un'estrazione con sali, come descritto in precedenza, per eliminare completamente la cera dai pomodori. Gli esperimenti C-P-M-A-S possono essere ripetuti con campioni di cuticola di frutto naturali e parzialmente scerati, come descritto nel testo. La configurazione del microscopio a forza atomica è un processo complesso e viene eseguita al meglio sotto la supervisione iniziale di personale tecnico esperto. Una FM inizia accendendo il microscopio a sonda scansione, abbreviato SPM, e assicurandosi che l'interruttore di selezione della modalità del microscopio sia impostato sulla modalità di microscopia a forza atomica a contatto.Successivamente, sollevare manualmente la testa dello SPM ruotando le due manopole anteriori regolabili dall'utente. Staccare il supporto della punta FM dalla testa dello SPM ruotando la vite di bloccaggio sul retro della testa. Utilizzare una pinzetta per rimuovere la mensola FM esistente dal suo supporto.Quindi afferrare con cura un nuovo cantilever con punta in nitruro di silicio dal suo imballaggio e installarlo al posto del vecchio cantilever. Utilizzare un microscopio ottico per verificare che il cantilever FM appena installato non sia danneggiato. Fissare il campione di cuticola di pomodoro a un disco campione mediante nastro adesivo doppia faccia.Utilizzare un microscopio ottico per verificare che il campione di cuticola rimanga piatto e liscio. Dopo aver posizionato il campione sul disco, collocare il campione di cuticola di pomodoro fissato al disco sulla zona magnetica in cima al microscopio a forza atomica (SPM). Ruotando le manopole, regolare le due viti manuali anteriori del microscopio in modo sufficientemente alto da evitare di rompere la punta AFM.Quando il porta-punte viene inserito nella testa dello SPM, regolare la vite posteriore motorizzata a un livello approssimativamente uguale a quello delle altre due viti anteriori. Reinserire il porta-punte nella testa dello SPM e fissarlo serrando la vite di bloccaggio posteriore della testa. Dopo aver acceso il laser, allineare il punto laser su una mensola in modalità frequenza (FM) utilizzando le manopole di regolazione del laser centrale e destra situate sulla sommità della testa.Monitorare il fascio laser riflesso su un foglio di carta per posizionare esattamente il punto laser all'estremit&agrave; di una mensola in FM. Regolare la posizione del punto laser per ottenere un segnale somma massimo. Regolare la posizione del punto laser riflesso sul fotodetettore modificando la posizione dello specchio mobile in senso orizzontale e verticale, in modo che la luce incidente venga ricevuta in modo uniforme dai quattro quadranti.Il rilevatore abbassa la punta FM ritraendo le viti frontali regolabili dall'utente e la vite posteriore motorizzata dello scanner SPM. Monitorare visivamente l'avvicinamento della punta FM alla superficie del campione mediante un microscopio invertito. Assicurarsi che tutte e tre le viti siano allo stesso livello.Per evitare artefatti derivanti dall'acquisizione di immagini di un campione inclinato, avvicinare la punta al campione senza tuttavia avvicinarla troppo da toccare o perforare la superficie del campione. La luce laser riflessa dalla mensola del microscopio a forza atomica (AFM) verrà riflessa da uno specchio mobile verso un rilevatore fotosensibile per la modalità AFM a contatto con una sonda AFM in nitruro di silicio. Impostare la tensione del segnale in uscita a meno due volt per un punto di regolazione di zero volt e il segnale differenziale a zero volt, regolando la posizione dello specchio.Utilizzando il software nano scope, fare clic sull'icona del microscopio e selezionare il profilo appropriato. Nel pannello delle impostazioni di controllo della scansione, impostare la velocità di scansione e la dimensione della scansione.Consentire alla punta AFM di entrare in contatto con la superficie del campione facendo clic sull'icona di avvicinamento della punta. Controllando la vite posteriore motorizzata della base SPM, il programma abbasserà ora la punta fino a quando non entrerà in contatto con la superficie del campione. Il processo di scansione inizierà automaticamente non appena la punta avrà effettuato con successo il contatto.Monitorare il processo di scansione utilizzando sia la modalità immagine che quella del microscopio del software, regolando iterativamente i parametri per ottenere immagini con la massima risoluzione, come descritto nel protocollo scritto. Ad esempio, iniziare la scansione con un valore elevato della scala dati dell'asse Z. Successivamente, ridurre con attenzione il valore della scala dati Z per ottenere il migliore contrasto delle caratteristiche superficiali nell'immagine.Acquisire l'immagine per salvare il file di dati. Elaborare i dati utilizzando funzioni di appiattimento per rimuovere gli artefatti dell'immagine dovuti alla deriva verticale del scanner, alle curvature dell'immagine e allo scostamento verticale tra le linee di scansione. Infine, calcolare la rugosità media del carbonio.Gli spettri di risonanza magnetica nucleare 13 C-P-M-A-S-N-M-R hanno mostrato una progressiva riduzione del picco della cera a 31 parti per milione, indicando la rimozione sequenziale delle cere epicuticolari e intracuticolari dal composito cuticola-cera, mantenendo nel contempo l'architettura chimica principale del biopolimero cutina in modo parallelo. Un'analisi dell'immagine in microscopia a forza atomica ha rivelato irregolarità superficiali dovute all'estrazione progressiva della cera epicuticolare e della cera intracuticolare dalla cuticola del frutto, indicando alterazioni nell'organizzazione dell'insieme cuticolare. Una volta padroneggiata questa tecnica, la rimozione sequenziale delle cere epicuticolari e intracuticolari dalle cuticole del frutto del pomodoro può essere completata in due ore.Quando si esegue l'estrazione su colonna per l'analisi esaustiva delle cuticole dei frutti, è importante utilizzare un insieme di solventi a polarità variabile dopo aver impiegato il nodo di contatto. Viene illustrato qui un protocollo FM. Possono essere utilizzati ulteriori esperimenti FM per misurare l'elasticità superficiale della cuticola.Dopo aver guardato questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come isolare sistematicamente i componenti dal composito ceroso della cutina e condurre l'analisi molecolare e un'esame rapido della superficie dei materiali della cuticola utilizzando rispettivamente risonanza magnetica in stato solido e microscopia a forza. Le tecniche illustrate in questo video permettono ai ricercatori nel campo della biologia vegetale di determinare la composizione molecolare e l'architettura supramolecolare di tessuti vegetali naturali e ingegnerizzati.

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Isolamento non acquoso e arricchimento di tricomi ghiandolari e sessili da Cannabis sativa

Il presente articolo si propone di fornire protocolli dettagliati e adeguati per l'isolamento di funghi endofiti associati alle piante, la conservazione a lungo termine degli isolati, la caratterizzazione morfologica e l'estrazione del DNA totale per la successiva identificazione molecolare e analisi metagenomica.

Isolamento, caratterizzazione ed estrazione totale del DNA per l'identificazione di funghi endofiti in piante micoeterotrofe

Scopri l'isolamento della cuticola del pomodoro e la rimozione selettiva di cere epi- e intracuticolari mediante NMR allo stato solido e microscopia a forza atomica. Questo metodo permette di valutare la capacità di reticolazione dei biopolimeri cuticolari.

Isolamento e studio della biofisica cuticole di frutta

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