Modificato lievito-sistema del doppio ibrido per identificare proteine che interagiscono con il fattore di crescita progranulina
17 gennaio 2012
Abbiamo modificato il lievito tradizionale doppio ibrido di screening, un efficace strumento genetico per identificare interazioni proteiche. Questa modifica riduce notevolmente il processo, riduce il carico di lavoro e, soprattutto, riduce il numero di falsi positivi. Inoltre, questo approccio è riproducibile ed affidabile.
Questo sistema MY due ibridi migliora il protocollo tradizionale di due ibridi nel lievito, riducendo in modo significativo il numero di falsi positivi. Preparare innanzitutto una trasformazione su piccola scala del plasmide esca nel lievito. Dopo aver convalidato la costruzione dell'esca mediante uno schermo con inibitore competitivo, analizzare la libreria di cDNA su piastre prive di quattro nutrienti.
Procedere alla verifica dei cloni positivi mediante saggi XGL e di reazione. Successivamente, identificare le proteine interagenti potenziali mediante sequenziamento del DNA e analisi bioinformatica. In definitiva, questo sistema modificato di ibrido in lievito aumenta significativamente l'efficacia e il successo del processo di screening.
Il sistema convenzionale di due ibridi nel lievito è noto per generare falsi positivi. Questo messaggio illustra la procedura di screening modificata, notevolmente migliorata a favore delle code a due punti. Cominciamo dunque.
Inoculare 50 millilitri di YPD con una coltura notturna di 5 millilitri di MAV 2 0 3. Far crescere da due a quattro ore a 30 gradi Celsius. Successivamente, raccogliere i lieviti mediante centrifugazione, dopo un lavaggio risospendere i pellet in 2 millilitri di soluzione uno e incubare a temperatura ambiente per 10 minuti.
Preparare la miscela di DNA per la trasformazione. Aggiungere 100 microlitri di cellule di lievito e mescolare bene. Quindi aggiungere 700 microlitri della soluzione due e mescolare bene.
Incubare prima a 30 gradi Celsius per 30 minuti, quindi eseguire un trattamento termico di shock. Raccogliere ora le cellule mediante centrifugazione e risospendere il pellet in 200 microlitri di acqua distillata sterilizzata in autoclave; effettuare diluizioni seriali della sospensione e seminare su piastre SD LU, quindi incubare a 30 gradi Celsius per due o tre giorni. Questo passaggio conferma che il plasmide esca attiva la trascrizione e che questa attivazione spontanea può essere neutralizzata da inibitori come il tre, un inibitore competitivo del prodotto del gene hiss tre.
Prima di tutto, trasformare il plasmide esca in lievito MAV 2 0 3. Distribuire la reazione su piastre SD LU e incubare a 30 gradi Celsius. Per selezionare le colonie in base all'attivazione autonoma indotta da tre at, utilizzare stecchini autoclavati per trasferire le colonie da ciascuna trasformazione su piastre SD LU hiss contenenti concentrazioni crescenti di tre at; incubare le piastre a 30 gradi Celsius.
Eliminare ceppi di esca che crescono su piastre contenenti 100 millimolar three at in quanto non adatti per l'uso nel test dell'ibrido per re. Per le esche rimanenti, selezionare la concentrazione più bassa di three at che inibisce la crescita cellulare da utilizzare nel screening della libreria CD NA, sospendere diverse colonie isolate di lievito contenenti il plasmide esca in 100 microlitri di acqua distillata autoclavata. Distribuirle su due piastre SD LU da 10 centimetri.
Incubare entrambe le piastre a 30 gradi Celsius. Raschiare e sospendere completamente le cellule in 10 millilitri. Autoclavare l'acqua distillata e inoculare 500 millilitri di terreno YPD liquido.
Verificare la densità cellulare mediante spettrofotometria e coltura a 30 gradi Celsius. Procedere al raccolto delle cellule mediante centrifugazione. Lavare una volta con 100 millilitri di acqua distillata autoclavata e una volta con 50 millilitri della soluzione uno.
Quindi risospendere il pellet in 2,5 millilitri di soluzione uno. Aggiungere ora DNA di sperma di salmone denaturato e frammentato e anche la libreria di DNA CD, mescolando delicatamente con una pipetta. Quindi aggiungere 15 millilitri di soluzione due contenente il 40% di polietilene glicole.
Mescolare delicatamente e distribuire aliquote di 700 microlitri in 25 provette microcentrifuga da 1,5 millilitro. Incubare per 30 minuti in un bagno d'acqua a 30 gradi Celsius, seguito da un trattamento termico di 15 minuti in un bagno d'acqua a 42 gradi Celsius.
Raccogliere le cellule mediante centrifugazione e risospendere delicatamente ogni pellet in 400 microlitri di acqua distillata sterilizzata in autoclave. Distribuire ciascuna miscela di trasformazione su due piastre selettive e incubare per cinque fino a 10 giorni a 30 gradi Celsius come controllo per stimare l'efficienza di trasformazione della piastra di reazione. Diluizioni seriali di una reazione.
Dopo un'incubazione di tre giorni a 30 gradi Celsius, determinare il numero di colonie totali. Trasferire le colonie su una piastra YPD e incubare a 30 gradi Celsius durante la notte. Quindi posizionare direttamente sulla piastra YPD una membrana di nitrocellulosa arrotondata, assicurandosi che non vi siano bolle d'aria.
Dopo un minuto, verificare che tutte le colonie siano state trasferite sulle membrane. Posizionare la membrana con il lato delle colonie rivolto verso l'alto in un contenitore di alluminio e appoggiarlo sulla superficie dell'azoto liquido per 20 secondi. Successivamente, immergere nell'azoto liquido per alcuni minuti.
Ora rimuovere la membrana per scongelarla. Nel frattempo, preparare una piastra di Petri con uno strato fresco di soluzione XCA su carta Aman. Successivamente immergere con attenzione la membrana scongelata e incubare a 37 gradi Celsius.
Fino a quando non compaiono colonie blu. La reazione tra preda, cloni e costrutto esca nel lievito può ulteriormente eliminare i falsi positivi. Per prima cosa, isolare il DNA plasmidico dai ceppi di lievito che potrebbero contenere proteine interagenti.
Trasformare il DNA in e coli DH cinque alfa e selezionare mediante crescita su piastre di LB con ampicillina. Analizzare i trasformanti mediante analisi con enzimi di restrizione. Ora cotrasformare i plasmidi preda ed esca in lievito MAV 2 0 3, piastrare su piastre SC LU trip e incubare da due a tre giorni a 30 gradi Celsius.
Selezionare tre colonie diverse per eseguire la sequenza del saggio xal, isolare il DNA plasmidico dai cloni positivi e identificare i geni utilizzando la bioinformatica. In questo esperimento, il fattore di crescita Rine pro-Granulina è stato utilizzato come esca per analizzare una libreria di cDNA cerebrale, ottenendo 54 cloni positivi.
I candidati sono stati isolati tra 2,5 milioni di trasformanti sottoposti a schermo con l'esca pro-granulina. Ulteriori analisi mediante il saggio ex skull hanno indicato 23 cloni candidati positivi per l'esca pro-granulina.
È interessante notare che analisi bioinformatiche dei dati di sequenziamento hanno identificato TNF R due. In effetti, ulteriori esperimenti funzionali hanno confermato la progranulina come un nuovo ligando dei recettori TT NF. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come eseguire questo schermo ibrido modificato con la base di tuo interesse.
Non dimenticare di lavorare con i guanti poiché alcune delle aree utilizzate sono pericolose. Buona fortuna con i tuoi esperimenti.
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Panoramica
Questo studio presenta un sistema modificato di due ibridi nel lievito che migliora il protocollo convenzionale per l'identificazione delle interazioni proteiche. Il nuovo approccio riduce in modo significativo i falsi positivi e aumenta l'affidabilità dei risultati.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Interazioni proteiche
- Screening genetico
- Sistema yeast two-hybrid
Sfondo
- Il sistema two-hybrid nei lieviti è un metodo ampiamente utilizzato per lo studio delle interazioni proteina-proteina.
- I metodi convenzionali spesso producono un elevato numero di falsi positivi.
- Migliorare l'accuratezza di questi screening è fondamentale per ottenere informazioni biologiche affidabili.
- Questo studio si propone di affrontare tali problemi attraverso modifiche metodologiche.
Scopo dello studio
- Modificare il protocollo del two-hybrid in lievito per aumentarne l'accuratezza.
- Ridurre il carico di lavoro e il tempo necessari per i saggi.
- Fornire un metodo riproducibile e affidabile per identificare le interazioni proteiche.
Metodi Utilizzati
- Preparazione di una trasformazione su piccola scala del plasmide esca in lievito.
- Convalida del costrutto esca mediante schermo con inibitore competitivo.
- Schermatura della libreria di cDNA su piastre prive di quattro nutrienti.
- Verifica delle clone positive con saggi XGL e reazioni enzimatiche.
Risultati principali
- Il sistema modificato riduce in modo significativo il numero di falsi positivi.
- Sono stati osservati un'efficacia e un tasso di successo maggiori nel processo di screening.
- Le proteine interagenti potenziali sono state identificate mediante sequenziamento del DNA.
- L'analisi bioinformatica ha confermato i risultati.
Conclusioni
- Il sistema modificato del two-hybrid in lievito è uno strumento affidabile per lo studio delle interazioni proteiche.
- Questo approccio migliora l'efficienza complessiva dei test genetici.
- Applicazioni future potrebbero trarre vantaggio dai tassi ridotti di falsi positivi.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
La mappatura delle interazioni proteiche nella fase di scoperta è fondamentale per la validazione degli obiettivi e la riduzione dei rischi meccanicistici nel settore biofarmaceutico R&D. Il sistema modificato del two-hybrid nei lieviti (MY2H) consente un'identificazione più affidabile dei partner proteici, riducendo i falsi positivi e accelerando l'ottenimento di risultati utilizzabili. Questo approccio aumenta la sicurezza predittiva nei momenti chiave della selezione del bersaglio e dell'identificazione precoce dei composti promettenti.
Applicazioni Strategiche nella R&D di Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Bersaglio
- Permette un'interrogazione sistematica delle interazioni proteina-proteina per la validazione funzionale delle proteine bersaglio.
- Riduce l'ambiguità meccanicistica minimizzando i falsi positivi negli screening delle interazioni.
- Consente un triage affidabile dei bersagli sulla base di partner di legame validati.
Sviluppo di screening e saggi
- Prepara costrutti di richiamo validati per flussi di lavoro di screening successivi.
- Migliora la riproducibilità e l'affidabilità del saggio mediante controlli con inibitori competitivi.
- Permette lo screening scalabile di librerie di cDNA per la scoperta di interazioni.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Allinea i risultati delle interazioni proteiche a percorsi biologici rilevanti per la malattia quando la scelta dell'esca è associata a una patologia.
- Permette una transizione continua dalla scoperta alla validazione preclinica identificando partner proteici su cui è possibile intervenire.
- Supporta decisioni di avanzamento proporzionate al rischio, basate su dati robusti riguardo le interazioni.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il sistema MY2H si colloca all'interfaccia tra la fase iniziale di scoperta e l'identificazione dei composti promettenti, fornendo una piattaforma riproducibile per mappare le interazioni proteiche prima di studi funzionali successivi.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi e la chiarificazione dei percorsi identificando gli interattori diretti di fattori di crescita o proteine rilevanti per le malattie.
- Screening: Fornisce risultati validati con bassa incidenza di falsi positivi, adatti per ulteriori saggi biochimici o cellulari.
- Analisi: Offre conteggi quantitativi di colonie e riscontri confermati mediante sequenziamento per analisi comparative.
- Ricerca traslazionale: Collega i dati sulle interazioni a modelli di malattia quando le proteine esca sono coinvolte in patologie.
- Riutilizzo aziendale: Offre un flusso di lavoro standardizzato e riproducibile, adattabile a diversi bersagli proteici all'interno di portafogli eterogenei.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva e riduce l'incertezza meccanicistica nella validazione degli obiettivi.
- Valore operativo: Migliora la standardizzazione, la riproducibilità e la capacità di analisi degli screening delle interazioni proteiche.
- Valore strategico: Permette decisioni di avanzamento o interruzione del progetto più informate e una gestione efficiente del portafoglio in termini di capitale.
- Impatto sul portafoglio: Favorisce la priorizzazione e l'avanzamento di obiettivi validati, adeguati al livello di rischio.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze in genetica dei lieviti, clonaggio molecolare e analisi bioinformatiche.
- Necessita dell'accesso a strumentazione per la trasformazione, mezzi selettivi e infrastrutture per il sequenziamento.
- Richiede una standardizzazione tra i gruppi di lavoro per la validazione dell'esca e i controlli con inibitori.
- È adattabile a diverse proteine esca, ma potrebbe richiedere un'ottimizzazione per costrutti specifici.
- La riduzione dei falsi positivi dipende da rigorosi passaggi di controllo e validazione.
