Isolamento di cellule polmonari mouse dendritiche

L'obiettivo generale di questa procedura è ottenere una preparazione altamente purificata di cellule dendritiche polmonari di topo. Questo risultato si ottiene innanzitutto raccogliendo il tessuto polmonare senza includere i linfonodi di drenaggio. Successivamente, una sospensione di singole cellule viene ottenuta mediante digestione con collaghenasi.

Il passo successivo consiste nell'arricchire le cellule positive per CD11C utilizzando un sistema di isolamento cellulare magnetico. Ora, il sottogruppo di cellule dendritiche convenzionali viene isolato mediante sorting cellulare citofluorimetrico. Infine, le cellule dendritiche convenzionali isolate dal tessuto polmonare del topo possono essere analizzate mediante citofluorimetria e microscopia ottica.

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande fondamentali nel campo dell'immunologia, come ad esempio quale sia il coinvolgimento del sottogruppo di cellule dendritiche convenzionali nell'immunità innata e nelle malattie infettive del tratto respiratorio. La procedura sarà dimostrata da Issa Lancelin, un ricercatore associato del mio laboratorio, e da me stesso. Dopo l'eutanasia del topo, iniziare tagliando e quindi tirando delicatamente all'indietro la pelle esterna del peritoneo per esporre la cavità toracica.

Procedere aprendo il diaframma mediante il taglio della gabbia toracica per esporre sia il cuore che i polmoni. Una volta esposti il cuore e i polmoni, si può iniziare la procedura di perfusione. Riempire una siringa da cinque millilitri con E-D-T-A-H-B-S-S e collegare un ago da 25 gauge alla siringa.

Quindi inserire l'ago nel ventricolo destro per prevenire perdite durante l'iniezione. Utilizzare la pinzetta per fissare il tessuto miocardico intorno all'ago. Quindi iniettare delicatamente la soluzione mantenendo una pressione costante.

Una perfusione accurata determinerà il gonfiamento del polmone e un cambiamento di colore verso il rosa o il bianco; per evitare possibili contaminazioni, rimuovere e scartare i linfonodi di drenaggio. Quindi raccogliere il tessuto polmonare, trasferendo l'organo escisso in una piastra di Petri posta su ghiaccio. Riempire una provetta Gentle Max C con cinque millilitri di soluzione di digestione del collagene polmonare, quindi tritare il polmone in piccoli pezzi.

Utilizzando una lametta, trasferire il tessuto nel tubo mediante una dissociazione massima delicata. Per ottenere una sospensione di singole cellule, selezionare il programma M lung zero one. Quindi incubare il campione a 37 gradi Celsius per 30 minuti, agitando il tubo ogni cinque minuti per risospendere i frammenti di tessuto F, quindi procedere con il programma M lung zero two.

Ora trasferire il campione in un tubo conico da 15 millilitri e centrifugare le cellule per 10 minuti a 335 ×g a quattro gradi Celsius. Rimuovere il soprannatante e aggiungere due millilitri di un tampone lisante CK al pellet, lasciando in incubazione per un minuto a temperatura ambiente per lisare i globuli rossi residui. Successivamente, lavare le cellule con 13 millilitri di PBS freddo integrato con 0,5% di BSA.

Dopo aver scartato il sopranatante, risospendere nuovamente questo pellet in cinque millilitri di PBS freddo più BSA, quindi far passare la soluzione cellulare attraverso un filtro in nylon da 100 micrometri. Infine, determinare il numero totale di cellule mediante esclusione del blu di trian. Invece di utilizzare una dissociazione delicata, riempire un tubo conico da 15 millilitri con cinque millilitri di soluzione di collaghenasi per polmone.

Aggiungere il tessuto polmonare tritato al tubo, incubare il tessuto polmonare per un'ora a 37 gradi Celsius. Vortexare le cellule ogni 15 minuti per ri-centrifugare i frammenti di tessuto. Quindi disgregare il tessuto digerito passando il campione da sei a otto volte attraverso una siringa da tre millilitri collegata a un ago da 20 gauge.

Evitare la formazione di bolle durante il processo. Per prima cosa, lavare la sospensione di cellule singole per 10 minuti a 200 ×g a quattro gradi Celsius e scartare il soprannatante. Quindi, risospendere le cellule in 400 µL di buffer di separazione.

Bloccare la legatura anticorpale non specifica mediata da FC nelle cellule totali utilizzando 0,5 microgrammi di anticorpo anti-CD16/32, aggiunti alle cellule per 30 minuti a quattro gradi Celsius. Dopo aver lavato le cellule con 10 millilitri di buffer di separazione freddo, risospendere le cellule in 400 microlitri di buffer di separazione. Quindi aggiungere 100 microlitri di microperle coniugate a CD11c, aggiunti all'ottavo delle cellule totali, mescolare bene e incubare la soluzione di cellule e perle per 15 minuti in frigorifero.

Dopo aver rimosso le perle non legate con 10 millilitri di tampone di separazione freddo, scartare il soprannatante e risospendere il pellet cellulare in un millilitro di tampone di separazione freddo. Infine, caricare i campioni nel separatore AutoMax pro ed eseguire il programma P-O-S-S-E-L-D. Per raccogliere la frazione cellulare esprimente CD11C.

Incubare la sospensione cellulare arricchita positiva per CD11c con l'anticorpo anti-CD11c PE-Cy7 e con anticorpi diretti contro le molecole MHC di classe II presenti su queste cellule per 30 minuti a quattro gradi Celsius. Dopo aver lavato le cellule con PBS freddo più BSA, risospendere le cellule in 0,5 millilitri di PBS più BSA e farle passare attraverso un filtro in rete di nylon da 40 micrometri. Infine, aggiungere le cellule positive per CD11c purificate in un tubo FACS per una successiva quantificazione in tubi vuoti separati.

Aggiungere 100 microlitri di PBS con BSA in provette da cinque millilitri per prevenire danni alle cellule purificate ed eseguire il sorting della sospensione cellulare filtrata mediante facts, mantenendo le cellule raccolte a temperatura refrigerata durante tutto il processo di sorting cellulare. In questi grafici di densità, il numero di cellule dendritiche convenzionali presenti nella milza è superiore di oltre tre volte rispetto a quello riscontrato nel polmone. Inoltre, nel polmone le cellule positive per CD11C includono una popolazione cellulare che non appartiene alle cellule dendritiche convenzionali, rappresentata dal gruppo di eventi con bassa espressione di MHC classe II al di fuori della finestra definita per le cellule dendritiche convenzionali.

Nella parte sinistra della figura, come si osserva in questo grafico di densità, la separazione magnetica delle cellule polmonari totali aumenta il numero delle cellule dendritiche convenzionali dal circa 1,5% delle cellule totali al circa 16,5%. Tuttavia, i macrofagi CD11c positivi e MHC classe II bassi costituiscono ancora oltre il 70% della popolazione cellulare totale, contaminando in modo significativo la purezza del sottoinsieme arricchito di cellule dendritiche convenzionali polmonari in questa fase del processo di isolamento. Il sorting mediante FACS, invece, migliora la purezza delle cellule dendritiche convenzionali a oltre il 96%, come mostrato nella microfotografia in alto a destra. Le cellule dendritiche convenzionali CD11c elevato e MHC classe II elevato sono cellule arrotondate dotate dei tipici prolungamenti dendritici, mentre le cellule CD11c elevato e MHC classe II basso visibili nella microfotografia in basso a destra mostrano protrusioni cellulari più tipiche della morfologia dei macrofagi.

Nel tentativo di eseguire questa procedura, è importante ricordare di manipolare il tessuto polmonare e la preparazione di cellule singole alle temperature indicate. Questo è fondamentale per preservare la vitalità cellulare e il rendimento delle cellule dendritiche convenzionali. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come isolare i sottogruppi di cellule dendritiche dal polmone del topo.

L'isolamento dei sottogruppi di cellule dendritiche polmonari rappresenta uno strumento molto utile per comprendere le funzioni di queste cellule in risposta a patogeni respiratori e a fattori ambientali in grado di innescare la risposta immunitaria dell'ospite a livello polmonare.