Name: Isolamento di cellule polmonari mouse dendritiche (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 4 s
Description: Scopri l'isolamento di cellule dendritiche convenzionali dai polmoni di topo mediante digestione con collagenasi, arricchimento magnetico e citometria a flusso. Questo metodo consente studi immunologici avanzati sul sistema respiratorio.

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Gli autori desiderano ringraziare per Marilyn Dietrich presso l&#39;impianto di core LSU Citometria a flusso per il suo aiuto con la separazione delle cellule e Peter Mottram per la sua assistenza con il microfotografie. Questo lavoro è stato finanziato dal Assistente di volo Medical Research Institute, l&#39;LSU-competitivi Premio programma di ricerca, e il NIH / NIAID Borse P20 RR020159 e R03AI081171.

1. Perfusione polmonare e sospensione singola cellula <ol><li> Euthanize il mouse con un&#39;iniezione intraperitoneale di ketamina / xylazina miscela anestetico (in mg / mouse ketamina 1,8, xilazina 0,19) e dissanguamento attraverso la vena femorale </li><li> Esporre la cavità toracica da taglio e delicatamente tirando indietro la pelle esterna del peritoneo. Procedere per aprire il diaframma tagliando la gabbia toracica per esporre sia il cuore ei polmoni. </li><li> Profumato delicatamente i polmoni usando una siringa da 5 ml riempito con EDTA-HBSS (1 mM EDTA di calcio / magnesio senza HBSS). Collegare un 25 ago G e inserire l&#39;ago nel ventricolo destro. Per evitare perdite durante l&#39;iniezione, fissare il tessuto miocardio intorno all&#39;ago utilizzando pinze. Delicatamente iniettare la soluzione, pur mantenendo una pressione costante. Perfusione accurata si tradurrà in inflazione al polmone e un cambiamento di colore rosa / bianco. </li><li> Rimuovere linfonodo drenante per eliminare qualsiasi potenziale contaminazione da questo tessuto. </li><li> Raccoglieretessuto polmonare, trasferimento in una capsula di Petri sul ghiaccio, e tagliare a piccoli pezzi con una lama di rasoio. </li><li> Trasferimento di tessuto a terra in un tubo gentleMACS C contenente 5 ml / polmone di soluzione collagenasi digestione (collagenasi tipo 1A 0,5 mg / ml, più di tipo IV bovina pancreatica DNasi 20 mg / ml in HBSS contenente il 5% FBS, 100 U / ml di penicillina e 100 mcg / ml streptomicina). </li><li> Utilizzare il dissociatore gentleMACS per ottenere una sospensione singola cella. Scegli il programma: m_lung_01. Incubare campione a 37 ° C per 30 minuti. Agitare tubo ogni 5 minuti per risospendere frammenti di tessuto. Procedere con m_lung_02 programma. </li><li> Trasferimento del campione ad un tubo da 15 ml e centrifugare per 10 minuti a 335 x g a 4 ° C. Dopo questo passo, conservare tutti i reagenti e centrifugazioni a 4 ° C per evitare una riduzione della vitalità delle cellule. </li><li> Gettare il surnatante e lisare restanti globuli rossi con l&#39;aggiunta di 2 ml di tampone di lisi ACK per 1 minuto a temperatura ambiente. Lavare le cellule con 13ml di BSA freddo PBS/0.5% e centrifugare per 10 minuti a 335 x g a 4 ° C. </li><li> Gettare il surnatante, risospendere le cellule totale in 5 ml di BSA freddo PBS/0.5% e passare un approfondito e 100 mesh di nylon micron. </li><li> Determinare il numero totale delle cellule utilizzando trypan esclusione colorante blu. </li></ol> 2. Isolamento magnetico e CD11c + arricchimento delle cellule <ol><li> Centrifugare sospensione singola cella per 10 minuti a 200 g a 4 ° C e scartare il surnatante. </li><li> Risospendere il pellet cellulare in 400 ml di tampone di separazione (PBS, 0,5% di BSA, e 2 mM EDTA) per 10 8 cellule totali. Blocca Fc-mediata anticorpo aspecifico legame utilizzando anti-CD16/CD32 anticorpi (0.5μg / 10 6 celle) per 30 minuti a 4 ° C. </li><li> Lavare le cellule con 10 ml di tampone di separazione a freddo e centrifugare per 10 minuti a 200 g a 4 ° C. Risospendere le cellule in 400 l di tampone di separazione. </li><li> Aggiungere 100 ml di microsfere CD11c al 10 8 </cellule sup&gt; totale. Mescolare bene e incubare per 15 minuti in frigorifero (2-8 ° C). </li><li> Lavare le cellule con 10 ml di tampone di separazione a freddo e centrifugare per 10 minuti a 200 g a 4 ° C e scartare il surnatante. </li><li> Risospendere il pellet cellulare in 3 ml di tampone di separazione a freddo. </li><li> Eseguire separazione magnetica utilizzando il autoMACS Pro separatore TM selezionando il posseld programma. Raccogliere la frazione positiva (0,5 ml). </li></ol> 3. Cellule dendritiche convenzionale (CDC) isolamento <ol><li> Incubare arricchito CD11c sospensione cellulare positivo con anti-CD11c PE-Cy7 e anti-IA/IE (MHC-II)-FITC anticorpi per 30 minuti a 4 ° C. Concentrazione ottimizzata di anticorpi è di 0,5 mcg / 10 6 delle cellule. </li><li> Lavare le cellule con il freddo BSA PBS/0.5% e centrifugare per 10 minuti a 335 x g a 4 ° C. Risospendere le cellule in 0,5 ml di PBS/0.5% BSA e passarli attraverso una maglia di nylon 40 micron. </li><li> Procedere allaordinare le celle utilizzando il FACS sorter Aria cellulare in modalità purezza. Aggiungere 100 ml di PBS/0.5% BSA ai tubi di raccolta al fine di prevenire i danni delle cellule purificate. Tenere le cellule ad una temperatura refrigerata per tutto il processo di separazione delle cellule. </li></ol> 4. Protocollo alternativo per ottenere una sospensione singola cellula e CD11c + arricchimento delle cellule <ol><li> In sostituzione del dissociatore gentleMACS, tessuto polmonare a terra a partire dal punto 1.5 può essere trasferito ad un tubo da 15 ml contenente 5 ml di soluzione di collagenasi al polmone e incubare per 1 ora a 37 ° C. Vortex cellule ogni 15 minuti per risospendere frammenti di tessuto. A distruggere il tessuto passando 6-8 volte il campione dentro e fuori attraverso una siringa da 3 ml, collegato ad un ago 20 G. Evitare di fare bolle durante il processo, altrimenti la vitalità cellulare sarà compromessa. Una volta sospensione singola cellula si ottiene, passare alla fase 1.8. </li><li> In sostituzione del TM AutoMACSPro separazionetor, l&#39;isolamento magnetico per l&#39;arricchimento delle cellule CD11c, può essere eseguita anche facendo passare la sospensione cellulare manualmente attraverso due colonne MACS. La selezione delle colonne appropriato varia a seconda della dimensione del campione. </li></ol> 5. Rappresentante dei risultati: Polmone CDC sono identificati come CD11c hi / MHC-II popolazione cellulare hi. Come mostrato in fig. 1, CDC rappresentano una percentuale minore del 1,4% rispetto ad alcuni altri tessuti come milza (4,8%). Tuttavia, a differenza di milza, polmone cellule CD11c positivo esprimere diverse quantità di MHC-II, tra cui una popolazione di cellule diverso da quello di CDC. Dopo la cella singola preparazione, la resa di cellule polmonari totale era di circa 3,0-3,8 x 10 7 cellule / polmonare con una vitalità del 60-70%, da cui poco più dell&#39;1% rappresentato sottoinsieme CDC. Questa percentuale è aumentata dopo l&#39;isolamento CD11c magnetico in cui è stato incrementato il totale del polmone CDC circa 10 tIME (&gt; 16%) rispetto al preparato originale (Fig. 2A). Tuttavia, le cellule che esprimono CD11c basse quantità di MHC-II (CD11c hi / lo MHC-II, macrofagi) ha rappresentato una popolazione di cellule ad alta contaminazione (&gt; 70%) che è stato mescolato con il sottoinsieme polmone CDC. Come mostrato in fig. 2B, queste cellule sono stati eliminati dopo la fase di separazione delle cellule quando la purezza CDC ha raggiunto&gt; 96%. Il rendimento abituale di CDC, dopo l&#39;intera procedura è stata di 5 x 10 4 cellule / polmone. Microfotografie mostrare caratteristiche morfologiche di CDC come cellule arrotondate con i dendriti tipico (pannello superiore). D&#39;altra parte, CD11c hi / MHC-II lo ha rappresentato un sottoinsieme morfologicamente differente che mostra protuberanze cellulari che sono tipici di macrofagi (MΦ, pannello inferiore) 12. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3563/3563fig1.jpg" /> Figura 1. Differenziale frequenza DC nel polmone del mouse e della milza. Polmone unomilza tessuti da C57BL ° / 6 topi sono stati raccolti e trattati con collagenasi. A seguito di digestione collagenasi, le cellule sono state colorate con anticorpi anti-mouse CD11c-PE-Cy7 e anti-topo IA / IE-FITC. Rappresentante trame citometria a flusso mostrano percentuali di CDC (CD11c hi / MHC-II hi) nei polmoni e nella milza. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3563/3563fig2.jpg" /> Figura 2. Isolamento di CDC dal polmone del mouse. Polmone del mouse sospensione cellulare è stato etichettato con anti-CD11c microsfere e passato attraverso un separatore cellulare automatico. A) Un grafico rappresentante mostra le percentuali di CDC (CD11c hi / MHC-II hi) e macrofagi (MΦ, CD11c hi / MHC-II lo) le popolazioni dopo arricchimento CD11c. Ulteriori colorazione della frazione arricchita seguita con anti-topo CD11c-PE-Cy7 e anti-topo IA / IE-FITC. Doppia cellule positive erano ordinati e analizzati mediante citometria a flusso. Aidentificare i loro morfologia, le cellule sono state cytospun e tinto con un Wright-Giemsa colorazione modificato. B) Rappresentante trame mostrano percentuali di CDC e MΦ dopo l&#39;ordinamento delle cellule. Microfotografie mostrare una immagine rappresentativa del polmone CDC e MΦ polmone. Barra di scala = 20 micron.

<ol><li>Pulendran, B., Palucka, K., Banchereau, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensing+pathogens+and+tuning+immune+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Sensing pathogens and tuning immune responses.</a> Science. 293, 253-256 (2001).</li>
<li>Banchereau, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunobiology+of+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Immunobiology of dendritic cells.</a> Annual Review of Immunology. 18, 767-811 (2000).</li>
<li>Manicassamy, S., Pulendran, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+cell+control+of+tolerogenic+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Dendritic cell control of tolerogenic responses.</a> Immunol. Rev. 241, 206-227 (2011).</li>
<li>Steinman, R. M., Cohn, Z. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+novel+cell+type+in+peripheral+lymphoid+organs+of+mice.+I.+Morphology%2C+quantitation%2C+tissue+distribution%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Identification of a novel cell type in peripheral lymphoid organs of mice. I. Morphology, quantitation, tissue distribution.</a> J. Exp. Med. 137, 1142-1162 (1973).</li>
<li>Asselin-Paturel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+type+I+IFN-producing+cells+are+immature+APCs+with+plasmacytoid+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Mouse type I IFN-producing cells are immature APCs with plasmacytoid morphology.</a> Nat. Immunol. 2, 1144-1150 (2001).</li>
<li>Chan, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interferon-producing+killer+dendritic+cells+provide+a+link+between+innate+and+adaptive+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Interferon-producing killer dendritic cells provide a link between innate and adaptive immunity.</a> Nat. Med. 12, 207-213 (2006).</li>
<li>Taieb, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+dendritic+cell+subset+involved+in+tumor+immunosurveillance%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">A novel dendritic cell subset involved in tumor immunosurveillance.</a> Nat. Med. 12, 214-219 (2006).</li>
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<li>Sung, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+major+lung+CD103+%28alphaE%29-beta7+integrin-positive+epithelial+dendritic+cell+population+expressing+Langerin+and+tight+junction+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">A major lung CD103 (alphaE)-beta7 integrin-positive epithelial dendritic cell population expressing Langerin and tight junction proteins.</a> J. Immunol. 176, 2161-2172 (2006).</li>
<li>Wang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+CD11c%2B+MHC+class+II-+precursors+generate+lung+dendritic+cells+during+respiratory+viral+infection%2C+but+are+depleted+in+the+process%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Local CD11c+ MHC class II- precursors generate lung dendritic cells during respiratory viral infection, but are depleted in the process.</a> J. Immunol. 177, 2536-2542 (2006).</li>
<li>Bhatia, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+host+defense+against+Aspergillus+fumigatus+involves+alveolar+macrophages+with+a+predominance+of+alternatively+activated+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Rapid host defense against Aspergillus fumigatus involves alveolar macrophages with a predominance of alternatively activated phenotype.</a> PLoS One. 6, e15943-e15943 (2011).</li>
<li>Shao, Z., Makinde, T. O., McGee, H. S., Wang, X., Agrawal, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fms-like+tyrosine+kinase+3+ligand+regulates+migratory+pattern+and+antigen+uptake+of+lung+dendritic+cell+subsets+in+a+murine+model+of+allergic+airway+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Fms-like tyrosine kinase 3 ligand regulates migratory pattern and antigen uptake of lung dendritic cell subsets in a murine model of allergic airway inflammation.</a> J. Immunol. 183, 7531-75381 (2009).</li>
<li>Hao, X., Kim, T. S., Braciale, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+response+of+respiratory+dendritic+cell+subsets+to+influenza+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Differential response of respiratory dendritic cell subsets to influenza virus infection.</a> J. Virol. 82, 4908-4919 (2008).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Isolamento dei polmonare topo DC è una tecnica importante per lo studio di una vasta gamma di stimoli respiratori. Il processo per ottenere queste cellule include passaggi critici che impediscono la perdita di cellule così come la vitalità cellulare e la purezza. Perfusione del polmone prima della raccolta contribuirà a eliminare eventuali cellule periferiche e ridurre eritrociti contaminante. L&#39;utilizzo della dissociazione automatico può essere advanteogus quando un gran numero di polmoni vengono gestiti, altriment...

<table width="200" border="1"><tr><td> Nome del reagente </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Commenti (opzionale) </td></tr><tr><td> Lisi buffer di ACK </td><td> Invitrogen </td><td> D6-0005DG </td><td></td></tr><tr><td> Anti-topo CD11c (HL3) </td><td> BD Pharmingen </td><td> 5580979 </td><td> PE-Cy7 coniugato </td></tr><tr><td> Anti-topo IA / IE (269) </td><td> BD-Pharmingen </td><td> 553623 </td><td> Coniugato con FITC </td></tr><tr><td> Collangenase tipo 1A </td><td> Sigma </td><td> 9891-500mg </td><td></td></tr><tr><td> Cellula filtri </td><td> BD Falcon </td><td> 352340, 352360 </td><td></td></tr><tr><td> CD11c (N418) microsfere </td><td> Miltenyi </td><td> 130-052-001 </td><td></td></tr><tr><td> DNasi I </td><td> Sigma </td><td> D5025-150KU </td><td></td></tr><tr><td> Sale di Hank soluzione equilibrata </td><td> Invitrogen </td><td> 14170 </td><td></td></tr><tr><td> Hepes soluzione tampone </td><td> Invitrogen </td><td> 15630 </td><td></td></tr><tr><td> Piastre di Petri 60 millimetri </td><td> BD Falcon </td><td> 351016 </td><td></td></tr><tr><td> GentleMACS ™ C tubi </td><td> Miltenyi </td><td> 130-093-237 </td><td></td></tr><tr><td> Gentle MACS dissociatore </td><td> Miltentyi </td><td> 130-093-235 </td><td></td></tr><tr><td> AutoMACS-Pro ™ </td><td> Miltenyi </td><td> 130-092-545 </td><td></td></tr><tr><td> FASCS Aria </td><td> BD </td><td></td><td></td></tr></table>

isolamento di cellule polmonari mouse dendritiche

Isolation of Mouse Lung Dendritic Cells

Le cellule dendritiche del polmone (DC) svolgono un ruolo fondamentale nel rilevamento invadendo 1,2 patogeni così come nel controllo della risposta tollerogeniche 3 nel tratto respiratorio. Almeno tre principali sottoinsiemi di cellule dendritiche del polmone sono stati descritti nei topi: convenzionale DC (CDC) 4, plasmacitoidi DC (PDC) 5 e la produzione di IFN-DC assassino (IKDC) 6,7. Il sottoinsieme CDC è il sottoinsieme DC più importanti nel polmone 8. Il marcatore comune noto per identificare sottoinsiemi DC è CD11c, un tipo mi transmembrana integrina (β2), che si esprime anche sui monociti, macrofagi, neutrofili e alcune cellule B 9. In alcuni tessuti, utilizzando CD11c come marcatore per identificare il mouse DC è valido, come nella milza, dove la maggior parte delle cellule + CD11c rappresentano il sottoinsieme CDC che esprime alti livelli del complesso maggiore di istocompatibilità di classe II (MHC-II). Tuttavia, il polmone è un tessuto più eterogeneo dove esseresottoinsiemi lato DC, vi è un&#39;alta percentuale di una popolazione di cellule distinte che esprime alti livelli di CD11c attacco bassi livelli di MHC-II. Sulla base della sua caratterizzazione e soprattutto sulla sua espressione di F4/80, un marcatore dei macrofagi della milza, il CD11c hi-MHC II popolazione di cellule del polmone lo è stato identificato come i macrofagi polmonari 10 e più recentemente, come un potenziale precursore DC 11. In contrasto con il mouse pDC, lo studio del ruolo specifico del CDC nella risposta immunitaria polmonare è stata limitata a causa della mancanza di un marcatore specifico che potrebbe aiutare a l&#39;isolamento di queste cellule. Pertanto, in questo lavoro, si descrive una procedura per isolare altamente purificato del mouse polmone CDC. L&#39;isolamento di polmonare sottoinsiemi DC rappresenta uno strumento molto utile per acquisire conoscenze in funzione di queste cellule in risposta a patogeni respiratori così come i fattori ambientali che possono innescare la risposta immunitaria nei polmoni.

Una preparazione altamente purificato di cellule dendritiche del polmone del mouse è descritto. Particolare enfasi è data l&#39;isolamento delle tradizionali sottoinsieme delle cellule dendritiche.

Isolamento di cellule polmonari mouse dendritiche

Le cellule dendritiche (DC) polmonari svolgono un ruolo fondamentale nel rilevamento dei patogeni invasori 1,2 così come nel controllo delle risposte tolerogeniche 3 nel...

L'obiettivo generale di questa procedura è ottenere una preparazione altamente purificata di cellule dendritiche polmonari di topo. Questo risultato si ottiene innanzitutto raccogliendo il tessuto polmonare senza includere i linfonodi di drenaggio. Successivamente, una sospensione di singole cellule viene ottenuta mediante digestione con collaghenasi.Il passo successivo consiste nell'arricchire le cellule positive per CD11C utilizzando un sistema di isolamento cellulare magnetico. Ora, il sottogruppo di cellule dendritiche convenzionali viene isolato mediante sorting cellulare citofluorimetrico. Infine, le cellule dendritiche convenzionali isolate dal tessuto polmonare del topo possono essere analizzate mediante citofluorimetria e microscopia ottica.Questo metodo può aiutare a rispondere a domande fondamentali nel campo dell'immunologia, come ad esempio quale sia il coinvolgimento del sottogruppo di cellule dendritiche convenzionali nell'immunità innata e nelle malattie infettive del tratto respiratorio. La procedura sarà dimostrata da Issa Lancelin, un ricercatore associato del mio laboratorio, e da me stesso. Dopo l'eutanasia del topo, iniziare tagliando e quindi tirando delicatamente all'indietro la pelle esterna del peritoneo per esporre la cavità toracica.Procedere aprendo il diaframma mediante il taglio della gabbia toracica per esporre sia il cuore che i polmoni. Una volta esposti il cuore e i polmoni, si può iniziare la procedura di perfusione. Riempire una siringa da cinque millilitri con E-D-T-A-H-B-S-S e collegare un ago da 25 gauge alla siringa.Quindi inserire l'ago nel ventricolo destro per prevenire perdite durante l'iniezione. Utilizzare la pinzetta per fissare il tessuto miocardico intorno all'ago. Quindi iniettare delicatamente la soluzione mantenendo una pressione costante.Una perfusione accurata determinerà il gonfiamento del polmone e un cambiamento di colore verso il rosa o il bianco; per evitare possibili contaminazioni, rimuovere e scartare i linfonodi di drenaggio. Quindi raccogliere il tessuto polmonare, trasferendo l'organo escisso in una piastra di Petri posta su ghiaccio. Riempire una provetta Gentle Max C con cinque millilitri di soluzione di digestione del collagene polmonare, quindi tritare il polmone in piccoli pezzi.Utilizzando una lametta, trasferire il tessuto nel tubo mediante una dissociazione massima delicata. Per ottenere una sospensione di singole cellule, selezionare il programma M lung zero one. Quindi incubare il campione a 37 gradi Celsius per 30 minuti, agitando il tubo ogni cinque minuti per risospendere i frammenti di tessuto F, quindi procedere con il programma M lung zero two.Ora trasferire il campione in un tubo conico da 15 millilitri e centrifugare le cellule per 10 minuti a 335 ×g a quattro gradi Celsius. Rimuovere il soprannatante e aggiungere due millilitri di un tampone lisante CK al pellet, lasciando in incubazione per un minuto a temperatura ambiente per lisare i globuli rossi residui. Successivamente, lavare le cellule con 13 millilitri di PBS freddo integrato con 0,5% di BSA.Dopo aver scartato il sopranatante, risospendere nuovamente questo pellet in cinque millilitri di PBS freddo più BSA, quindi far passare la soluzione cellulare attraverso un filtro in nylon da 100 micrometri. Infine, determinare il numero totale di cellule mediante esclusione del blu di trian. Invece di utilizzare una dissociazione delicata, riempire un tubo conico da 15 millilitri con cinque millilitri di soluzione di collaghenasi per polmone.Aggiungere il tessuto polmonare tritato al tubo, incubare il tessuto polmonare per un'ora a 37 gradi Celsius. Vortexare le cellule ogni 15 minuti per ri-centrifugare i frammenti di tessuto. Quindi disgregare il tessuto digerito passando il campione da sei a otto volte attraverso una siringa da tre millilitri collegata a un ago da 20 gauge.Evitare la formazione di bolle durante il processo. Per prima cosa, lavare la sospensione di cellule singole per 10 minuti a 200 ×g a quattro gradi Celsius e scartare il soprannatante. Quindi, risospendere le cellule in 400 µL di buffer di separazione.Bloccare la legatura anticorpale non specifica mediata da FC nelle cellule totali utilizzando 0,5 microgrammi di anticorpo anti-CD16/32, aggiunti alle cellule per 30 minuti a quattro gradi Celsius. Dopo aver lavato le cellule con 10 millilitri di buffer di separazione freddo, risospendere le cellule in 400 microlitri di buffer di separazione. Quindi aggiungere 100 microlitri di microperle coniugate a CD11c, aggiunti all'ottavo delle cellule totali, mescolare bene e incubare la soluzione di cellule e perle per 15 minuti in frigorifero.Dopo aver rimosso le perle non legate con 10 millilitri di tampone di separazione freddo, scartare il soprannatante e risospendere il pellet cellulare in un millilitro di tampone di separazione freddo. Infine, caricare i campioni nel separatore AutoMax pro ed eseguire il programma P-O-S-S-E-L-D. Per raccogliere la frazione cellulare esprimente CD11C.Incubare la sospensione cellulare arricchita positiva per CD11c con l'anticorpo anti-CD11c PE-Cy7 e con anticorpi diretti contro le molecole MHC di classe II presenti su queste cellule per 30 minuti a quattro gradi Celsius. Dopo aver lavato le cellule con PBS freddo più BSA, risospendere le cellule in 0,5 millilitri di PBS più BSA e farle passare attraverso un filtro in rete di nylon da 40 micrometri. Infine, aggiungere le cellule positive per CD11c purificate in un tubo FACS per una successiva quantificazione in tubi vuoti separati.Aggiungere 100 microlitri di PBS con BSA in provette da cinque millilitri per prevenire danni alle cellule purificate ed eseguire il sorting della sospensione cellulare filtrata mediante facts, mantenendo le cellule raccolte a temperatura refrigerata durante tutto il processo di sorting cellulare. In questi grafici di densità, il numero di cellule dendritiche convenzionali presenti nella milza è superiore di oltre tre volte rispetto a quello riscontrato nel polmone. Inoltre, nel polmone le cellule positive per CD11C includono una popolazione cellulare che non appartiene alle cellule dendritiche convenzionali, rappresentata dal gruppo di eventi con bassa espressione di MHC classe II al di fuori della finestra definita per le cellule dendritiche convenzionali.Nella parte sinistra della figura, come si osserva in questo grafico di densità, la separazione magnetica delle cellule polmonari totali aumenta il numero delle cellule dendritiche convenzionali dal circa 1,5% delle cellule totali al circa 16,5%. Tuttavia, i macrofagi CD11c positivi e MHC classe II bassi costituiscono ancora oltre il 70% della popolazione cellulare totale, contaminando in modo significativo la purezza del sottoinsieme arricchito di cellule dendritiche convenzionali polmonari in questa fase del processo di isolamento. Il sorting mediante FACS, invece, migliora la purezza delle cellule dendritiche convenzionali a oltre il 96%, come mostrato nella microfotografia in alto a destra. Le cellule dendritiche convenzionali CD11c elevato e MHC classe II elevato sono cellule arrotondate dotate dei tipici prolungamenti dendritici, mentre le cellule CD11c elevato e MHC classe II basso visibili nella microfotografia in basso a destra mostrano protrusioni cellulari più tipiche della morfologia dei macrofagi.Nel tentativo di eseguire questa procedura, è importante ricordare di manipolare il tessuto polmonare e la preparazione di cellule singole alle temperature indicate. Questo è fondamentale per preservare la vitalità cellulare e il rendimento delle cellule dendritiche convenzionali. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come isolare i sottogruppi di cellule dendritiche dal polmone del topo.L'isolamento dei sottogruppi di cellule dendritiche polmonari rappresenta uno strumento molto utile per comprendere le funzioni di queste cellule in risposta a patogeni respiratori e a fattori ambientali in grado di innescare la risposta immunitaria dell'ospite a livello polmonare.

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Immunology and Infection

Immunologia e Infezioni

Dissociare cellule di tipi di tessuto specifico richiede parametri specifici per l'agitazione dei tessuti per ottenere un elevato volume di vitali, cellule coltivabili. Il Miltenyi gentleMACS dissociatore ottimizza questa operazione con un semplice protocollo pratico. In questa pubblicazione l'utilizzo di questo apparecchio sul tessuto polmonare viene spiegata.

La preparazione standardizzata di Single-Cell Sospensioni da tessuto polmonare del mouse utilizzando il dissociatore gentleMACS

In questo articolo dimostriamo l'isolamento di cellule staminali murine residente polmone mesenchimali (MSC polmone), la loro espansione, caratterizzazione e analisi delle proprietà immunomodulanti.

Isolamento e caratterizzazione di Hoechst Basso CD45 Negativo Mouse cellule staminali mesenchimali del polmone

Qui, dettaglio una metodologia per l'isolamento rapido delle cellule dendritiche di topo intestinali (DCS) e macrofagi. Caratterizzazione fenotipica di DC intestinali e macrofagi viene eseguita utilizzando multi-color analisi citometrica mentre magnetica arricchimento tallone seguita dalla selezione cellulare viene utilizzato per produrre le popolazioni di elevata purezza per gli studi funzionali.

Isolamento e caratterizzazione di cellule dendritiche ei macrofagi dall&#39;intestino mouse

Dettagli Questo protocollo un metodo per isolare le cellule presentanti l'antigene da timo umano attraverso diverse fasi di digestione enzimatica del tessuto seguita dalla densità centrifugazione della sospensione di cellule singole e smistamento finalmente magnetico e / o FACS delle popolazioni cellulari di interesse.

Isolamento di cellule dendritiche mieloidi e cellule epiteliali di timo umano

Esistono sottogruppi distinti di cellule dendritiche come popolazioni rare negli organi linfoidi, e quindi sono difficili da isolare in numero e purezza sufficienti per esperimenti immunologici. Qui descriviamo un metodo ad alta efficienza e ad alta resa per l'isolamento di tutti i principali sottogruppi attualmente noti di cellule dendritiche spleniche di topo.

Un metodo del rendimento efficiente e di alta per l&#39;isolamento di mouse dendritiche sottopopolazioni cellulari

Si descrive un metodo per la generazione di precisione intercettato Lung fette (PCLS) e immunocolorazione loro di visualizzare la localizzazione dei vari tipi di cellule immunitarie nel polmone. Il nostro protocollo può essere esteso per visualizzare la posizione e la funzione dei diversi tipi di cellule in una varietà di condizioni.

Taglio di precisione polmone mouse Fette per la visualizzazione in diretta cellule dendritiche polmonare

Monocito-derivate DC (MoDC) può percepire la minor quantità di molecole associate al pericolo e sono pertanto facilmente innescato. Forniamo un protocollo dettagliato per l'isolamento di MoDC da sangue e tumori e la loro attivazione con complessi immuni evidenziando le principali precauzioni che dovrebbero essere considerate al fine di evitare loro attivazione prematura.

Protocollo di isolamento del Mouse cellule dentritiche monocito-derivate e loro attivazione successiva In Vitro con tumore immunocomplessi

Qui, presentiamo un metodo economico ed efficiente per isolare e generare cellule dendritiche derivate dal midollo osseo ad alta purezza dai topi dopo 7 giorni di coltura con 10 ng / mL GM-CSF / IL-4.

Protocollo economico ed efficiente per l'isolamento e la coltura di cellule dendritiche derivate dal midollo osseo da topi

In questo articolo, le cellule endoteliali polmonari primarie sono state isolate e coltivate da topi neonatali.

Isolamento delle cellule endoteliali polmonari primarie di topo

Forniamo un protocollo dettagliato per l'isolamento e l'identificazione di rare popolazioni di cellule T antigene-specifiche nei polmoni di topo attraverso l'arricchimento di cellule T basato su biglie magnetiche e i tetrameri peptide:complesso maggiore di istocompatibilità (MHC).

Identificazione di rare cellule T antigene-specifiche da polmoni di topo con tetrameri del complesso peptide:istocompatibilità maggiore

Questo protocollo descrive in dettaglio l'isolamento di popolazioni vive immunitarie e non immuni dal polmone di topo allo stato stazionario e in seguito all'infezione influenzale. Fornisce inoltre strategie di gating per l'identificazione di sottogruppi di cellule epiteliali e mieloidi.

Isolamento di popolazioni di cellule mieloidi ed epiteliali vive dal polmone di topo

Scopri l'isolamento di cellule dendritiche convenzionali dai polmoni di topo mediante digestione con collagenasi, arricchimento magnetico e citometria a flusso. Questo metodo consente studi immunologici avanzati sul sistema respiratorio.

Isolamento di cellule polmonari mouse dendritiche

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