Misurazione Traslocazione Peptide in grandi vescicole unilamellari

Per quantificare la traslocazione del peptide attraverso le membrane delle vescicole. Vescicole lipidiche marcate con fluorescenza vengono generate con tripsina incapsulata. Viene aggiunto un inibitore della tripsina per inibire l'attività di qualsiasi tripsina esogena, lasciando attiva la tripsina all'interno del lume della vescicola.

Solo quando vengono aggiunti peptidi marcati con fluorescenza alle vescicole, i loro marcatori fluorescenti agiscono da donatori FRET ed eccitano le molecole fluorescenti presenti sulla vescicola. Tuttavia, quando le proteine attraversano la membrana, vengono digerite dalla tripsina e il segnale FRET si perde. L'analisi spettrometrica rivela il grado di traslocazione del peptide, che si manifesta come una diminuzione del segnale FRET tra le vescicole e il peptide nel tempo.

Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ad altri metodi, inclusi altri approcci basati su vescicole lipidiche e metodi per misurare l'ingresso di peptidi nelle cellule, consiste nel fornire informazioni sulla cinetica dell'ingresso nella membrana, e non richiede l'aggiunta di un marcatore fluorescente ai peptidi qualora contengano un triptofano. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nella progettazione e nell'ingegnerizzazione di peptidi attivi sulla membrana, ad esempio quali caratteristiche siano necessarie per una efficace translocazione attraverso la membrana. Il primo passaggio di questa procedura consiste nel preparare vescicole lipidiche grandi e unilamellari o UUVs da utilizzare come modelli di membrana cellulare per il saggio.

Cominciare mescolando fosfatidilcolina, fosfatidilglicerolo e cinque dimetilammino naftalene. Un solfofilo fosfatidil etanolammina in cloroformio. In un rapporto di 50 a 45 a 5, 0,376 milligrammi di lipidi totali sono generalmente sufficienti per produrre un numero adeguato di vescicole per un singolo esperimento o prova di controllo.

Preparare un vial come campione sperimentale e uno come controllo; evaporare il cloroformio utilizzando un flusso di gas azoto. I lipidi essiccati che rimangono dopo questo passaggio sono denominati cake lipidici. Essiccare i cake lipidici da nove a 14 ore in un essiccatore sotto vuoto.

Successivamente, preparare una soluzione madre di HEI 10 millimolare, una soluzione madre di tripsina da suino 0,4 millimolare e una soluzione madre di inibitore della tripsina di Bowman-Birk 4,0 millimolare. I dettagli per la preparazione sono disponibili nel documento allegato. Aggiungere un volume uguale della soluzione madre di tripsina 0,4 millimolare e della soluzione tampone HEI 10 millimolare ai cake lipidici essiccati. Quindi vortexare il vial per ricostituire le vescicole multilamellari (MVS). Per ricostituire le MVS di controllo, aggiungere un volume uguale della soluzione madre di tripsina 0,4 millimolare e dell'inibitore della tripsina 4,0 millimolare al cake lipidico essiccato, quindi vortexare come in precedenza.

Dopo aver ricostituito le mvs, trasferire le soluzioni di MLV da provette in vetro a provette microcentrifuga da 1,7 millilitri. Successivamente, sottoporre le soluzioni di MLV a cinque cicli di congelamento-scongelamento, alternando azoto liquido e un bagno d'acqua a 30 gradi Celsius. Quindi, preparare un estrusore lipidico inumidendo due supporti per filtro nel Buffer di Heiss.

Quindi posizionare ciascuno di essi su un pezzo di estrusore in Teflon inumidito e inserire una membrana in nucleoporo con pori da 0,1 micron tra i due pezzi di estrusore in Teflon. Ora posizionare i pezzi dell'estrusore all'interno di un cilindro metallico dell'estrusore e posizionare un distanziale a forma di ciambella sopra i due pezzi dell'estrusore. Avvitare il coperchio metallico del cilindro dell'estrusore e quindi inserirlo nel supporto utilizzando una siringa di vetro da 250 microlitri.

Riempire lo spazio vuoto dell'estrusore con 500 microlitri di tampone He piece 10 millimolare per prevenire qualsiasi perdita del campione di vescicole. Trasferire il campione in un becher da 10 millilitri.

Quindi caricare ogni campione di MLV nell'estrusore e spingere il campione attraverso la membrana almeno 21 volte. Per garantire una dimensione uniforme delle vescicole Ella dopo l'estruzione, trasferire le vescicole lipidiche grandi di ELLA o L UUVs in una provetta microcentrifuga da 1,7 millilitri. Conservare gli UUVs a quattro gradi Celsius e utilizzarli entro 48 ore.

Per valutare la concentrazione di LUV, si determina il contenuto totale di fosforo nel campione. Preparare quanto segue secondo le specifiche indicate nel protocollo scritto allegato: acido solforico 8,9 N, soluzione al 2,5% p/v di molibdato di ammonio, soluzione al 6% p/v di acido ascorbico e soluzione tampone fosfato 0,65 millimolare.

Preparare sei standard di fosforo come indicato qui. Quindi preparare un bianco di LUV con lo stesso volume di soluzione di tripsina 0,2 millimolare e inibitore Bowman BIR 2,0 millimolare utilizzati per i controlli. Questo passaggio viene effettuato per correggere la presenza di sali di fosforo essiccati nella polvere dell'inibitore Bowman B.

Successivamente, pipettare circa 0,1 micromoli, generalmente circa 25 microlitri di UUV, in provette di vetro monouso, in triplice replicato. Aggiungere quindi 450 microlitri di H₂SO₄ normale 8,9 in ciascuna delle provette contenenti campione, standard e bianco. Successivamente, collocare i campioni, gli standard e i bianchi in un forno a temperatura compresa tra 175 e 210 °C per 25 minuti.

Trascorsi 25 minuti, rimuovere tutti i tubi dal forno e lasciarli raffreddare. Aggiungere 150 microlitri di 30%H2O a ciascun tubo. Quindi riscaldare i campioni, gli standard e i bianchi per altri 30 minuti a una temperatura compresa tra 175 e 210 gradi Celsius.

Dopo 30 minuti, rimuovere gli standard, i campioni e i bianchi dal riscaldamento. Se alcuna delle soluzioni non è ancora incolore, aggiungere 50 microlitri di H2O in tutti i tubi e riscaldare per ulteriori 15 minuti a una temperatura compresa tra 175 e 210 gradi Celsius. Una volta che le soluzioni sono diventate incolori, aggiungere a ciascun tubo 3,9 millilitri di H2O nano pura, 0,5 millilitri di soluzione di molibdato di ammonio e 0,5 millilitri di soluzione di acido ascorbico.

Quindi riscaldare tutti i tubi per cinque a sette minuti. In un bagno di acqua in ebollizione, misurare l'assorbanza di ogni standard e campione a 820 nanometri utilizzando uno spettrofotometro UV-visibile Agilent 8 4 5 3. Le concentrazioni di LUV sperimentali e di controllo devono essere misurate separatamente.

Il tubo contenente 0,0 millimoli di fosforo deve essere utilizzato come bianco per tutti gli standard e i campioni sperimentali di LUV. Il tubo contenente 0,2 millimolare di tripsina, 2,0 millimolare di osso e soluzione inibitrice di bir deve essere utilizzato come bianco per il campione di controllo di LUV. La curva standard lineare di assorbanza rispetto al contenuto di fosforo ottenuta deve essere utilizzata per calcolare il contenuto totale di fosforo e la concentrazione di LUV dei campioni.

Per preparare le soluzioni peptidiche, sciogliere il peptide in Oppu H2O; i peptidi utilizzati in questo saggio devono contenere un residuo di triptofano. Misurare l'assorbanza della soluzione peptidica a 282 nanometri in triplice replicato. Calcolare la concentrazione del peptide utilizzando il coefficiente di estinzione molare per il triptofano pari a 5.700.

Inverso molare inverso centimetri diluire il peptide in acqua nano pura fino a una concentrazione finale di 30 micromolare, conservare a meno 20 gradi Celsius. Per quantificare la traslocazione, preparare campioni sperimentali e di controllo in provette microcentrifuga da 1,7 millilitro. Aggiungere quantità sufficiente di UUV a ogni soluzione per ottenere una concentrazione finale di 250 micromolare.

Aggiungere una quantità sufficiente di soluzione inibitore Bowman BIR in modo che l'inibitore raggiunga una concentrazione finale 10 volte maggiore rispetto alla concentrazione di tryina. Aggiungere una quantità sufficiente di tampone heis 10 millimolare per portare il volume finale della soluzione a 450 microlitri. Versare 50 microlitri di soluzione peptidica in una cuvetta per fluorimetro stana micro chords e inserirla nel programma dello spettrofotometro.

Uno spettrofotometro fluorimetrico per eseguire un esperimento di cinetica fluorimetrica della durata di 25 minuti, nel quale viene registrata un'acquisizione di fluorescenza almeno una volta al secondo con una lunghezza d'onda di eccitazione di 280 nanometri e una lunghezza d'onda di emissione di 525 nanometri a 25 gradi Celsius. Con la sensibilità del PMT impostata al massimo, aggiungere il campione sperimentale o di controllo alla soluzione peptidica nel qve. Questo deve portare immediatamente la concentrazione finale del peptide a tre micromolari, iniziando subito l'esperimento di cinetica fluorimetrica.

Dopo aver eseguito sia i campioni sperimentali che quelli di controllo, calcolare i rapporti di traslocazione come descritto nel documento allegato. Il rapporto tra i peptidi e il gruppo dansil è sufficientemente elevato da garantire che virtualmente tutti i peptidi integri siano abbastanza vicini a un gruppo dansil da produrre un segnale FRET, anche se nessuno di essi ha attraversato la vescicola. Questo risultato è coerente con il simile segnale FRET osservato nelle condizioni di controllo per peptidi che attraversano o non attraversano le vescicole.

Gli saggi di traslocazione sono stati eseguiti come descritto in questo video. Questa figura mostra i risultati ottenuti con un peptide rappresentativo che ha evidenziato una traslocazione robusta. Il segnale in questo esperimento, rappresentato dalla traccia nera, mostra una marcata diminuzione del segnale FRET.

Nel tempo, rapporti di traslocazione più elevati indicano peptidi che si traslocano in modo efficiente. Il rapporto di traslocazione per i peptidi penetranti cellulari mostrati qui è 1,19; i peptidi con traduzione settimanale presentano rapporti di traslocazione più vicini a uno, al fine di controllare la potenziale perdita del segnale FRET dovuta a triptasi incomplete, inibizione o altri fattori non correlati alla capacità di traslocazione. Viene misurato il segnale FRET tra il peptide e le UUV contenenti sia la tripsina che l'inibitore della tripsina Bowman-BRK.

Questo è mostrato come traccia grigia. L'importanza dell'esperimento di controllo che utilizza UUV contenenti inibitore della tripsina è evidenziata dai dati mostrati qui. In questo caso, il segnale del peptide è diminuito in misura simile a quella della figura precedente nel campione sperimentale rappresentato dalla traccia nera.

Tuttavia, il campione di controllo mostra una diminuzione più rapida per questo peptide, quindi la sua traslocazione netta è inferiore. Dopo aver visto questo video, dovresti avere un'idea chiara di come preparare vescicole lipidiche e misurare la traslocazione di peptidi contenenti triptofano. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di iniziare a raccogliere i dati immediatamente dopo che il peptide e le vescicole sono stati mescolati.