Name: Misurazione Traslocazione Peptide in grandi vescicole unilamellari (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-01-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 27 s
Description: Impara a misurare la traslocazione di peptidi in grandi vescicole unilamellari utilizzando FRET e tripsina. Questo metodo quantitativo permette di analizzare la cinetica di attraversamento della membrana lipidica.

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Gli autori desiderano ringraziare Eleonora Fleming e Jessica Chen per le discussioni utili. Il finanziamento è stato fornito da Istituto Nazionale di allergie e malattie infettive (NIAID-NIH) e un Premio R15AI079685 Research Corporation Cottrell Award Science College. Sostegno degli studenti sono state fornite dal Howard Hughes Medical Institute e del fondo Staley.

1. Preparazione di grandi vescicole lipidiche unilamellari (luvs) <ol><li> Preparare luvs a servire come membrana cellulare imita per il dosaggio 19. </li><li> Mix fosfatidilcolina (POPC, 760,10 g / mol), fosfatidilglicerolo (POPG. 770,99 g / mol), 5-dimethylaminonaphthalene-1-sulfonil fosfatidiletanolammina (DNS-PAPA, 994,350 g / mol) (Avanti Polar Lipids) disciolto in cloroformio in un 50 : rapporto 45:5. Come ogni test richiede la gestione separata di luvs sia sperimentale e di controllo, due fiale torta dei lipidi deve essere preparato. 0,376 mg di lipidi totali (0,188 mg POPC, POPG 0,169 mg e 0,019 mg di DNS-PAPA) è solitamente sufficiente a rendere vescicole sufficiente per una prova traslocazione singolo. </li><li> Evaporare cloroformio utilizzando un flusso di gas N 2. </li><li> Asciutto la torta lipidi 9-14 ore in un essiccatore a vuoto. </li><li> Preparare uno stock 10 mM HEPES soluzione tampone (10 mM HEPES, 238,3 g / mol, 45 mM NaCl, 58,44 g / mol, 1 mM EDTA, 372,24 g / mol pH 7,4). Tampone HEPES è stOR a 4 ° C. </li><li> Preparare una soluzione madre di 0,4 mm suina tripsina (23,3 kg / mol) in 10 mM tampone HEPES preparato in precedenza. La tripsina è conservato a -20 ° C e, nella nostra pratica, di solito non subisce più di 2 cicli gelo-disgelo prima dell&#39;uso. </li><li> Preparare una soluzione madre di 4,0 mm Bowman-Birk inibitore della tripsina (8 kg / mol) in 10 mM di soluzione tampone HEPES e conservare a -20 ° C. Nel nostro uso, questo stock è rifornito mensilmente e di solito non subisce più di 3 cicli di gelo / disgelo prima che sia reso di nuovo. </li><li> Ricostituire vescicole sperimentale multilamellari (MLV) in una soluzione 0,2 mM tripsina con l&#39;aggiunta di un uguale volume di magazzino tripsina 0,4 mM e 10 mM tampone HEPES soluzione alla torta secca lipidica. Per un singolo campione di 0,376 mg di lipidi totali, una miscela di 150 ml di soluzione di tripsina e 150 ml di tampone HEPES è sufficiente. </li><li> Controllo MLV ricostituire in una soluzione con tripsina 0,2 mm e 2,0 mm Bowman-Birk inibitore della tripsina con l&#39;aggiunta di un uguale volume di 0.4 mM magazzino tripsina e 4,0 mM inibitore della tripsina per i dolci secchi lipidi. Per un singolo campione di 0,376 mg di lipidi totali, una miscela di 150 ml di soluzione di tripsina e 150 ml di inibitore della tripsina è sufficiente. </li><li> Trasferire soluzioni MLV da fiale di vetro a 1,7 ml di tubo microcentrifuga. </li><li> Oggetto MLV soluzioni a 5 cicli gelo / disgelo in azoto liquido. </li><li> Preparare lipidi estrusore (Avanti Polar Lipids) inserendo due supporti filtro inumidito con tampone HEPES su ogni pezzo in teflon estrusore. Inserire una membrana nuclepore traccia incisa con 0,1 micron pori (Whatman, Regno Unito) tra i due pezzi di Teflon estrusore, e disporre i pezzi estrusore all&#39;interno del contenitore metallico estrusore. Posizionare il distanziale ciambella sopra i due pezzi estrusore prima di stringere la parte superiore in metallo del filtro estrusore e inserirlo nella porta. </li><li> Riempire il volume vuoto all&#39;interno della estrusore con 500 microlitri di buffer 10 mM HEPES usando una siringa da 250 microlitri di vetro per evitare la perdita di campione vescicole. &lt;/ Li&gt; <li> Caricare ogni campione MLV nel estrusore e spingere il campione attraverso la membrana almeno 21 volte per assicurare uniformi dimensioni unilamellari vescicola. Luvs sono ottenuti dalla estrusione seguente soluzione MLV. </li><li> Luvs conservare a 4 ° C ed utilizzare entro 48 ore. </li></ol> 2. Quantificare LUV Concentrazione <ol><li> LUV concentrazione è stata quantificata mediante determinazione del contenuto di fosforo totale presente nel campione 20. </li><li> Preparare 8,9 NH 2 SO 4 in acqua Nanopure e conservare a temperatura ambiente. </li><li> Preparare un 2,5% w / v di ammonio molibdato VI (588,04 g / mol), soluzione in acqua Nanopure. Preparare al 10% w / v acido ascorbico (176,1 g / mol) la soluzione in acqua Nanopure. Proteggere la soluzione di acido ascorbico da esposizione alla luce coprendo il tubo con un foglio. Conservare entrambe le soluzioni a 4 ° C per un massimo di 2 mesi. </li><li> Preparare 0,65 mM fosfato soluzione tampone (sodio fosfato monobasico anidro, 120 g / mol). </li><li> Preparare sei normale tubes. Gli standard dovrebbero contenere 0,0 microlitri, 50 microlitri (0,0325 μmoles), 100 l (0,065 μmoles), 175 microlitri (0,114 μmoles), 250 microlitri (0,163 μmoles), o 350 microlitri (0,228 μmoles) di soluzione di fosforo. </li><li> Preparare LUV provette in triplice copia. Ogni tubo campione dovrebbe contenere circa 0,1 μmoles di luvs. Sperimentale e di controllo LUV concentrazioni devono essere misurate separatamente. </li><li> Per correggere eventuali sali di fosforo asciugato in Bowman-Birk in polvere inibitore, un controllo LUV vuoto deve essere preparato. Il bianco deve contenere lo stesso volume del 0,2 mM trypsin/2.0 mM Bowman-Birk soluzione inibitore come è stata posta nel controllo LUV provetta. </li><li> Mettere 450 ml di 8,9 NH 2 SO 4 in ciascuno dei campioni, standard, e tubi vuoti. </li><li> Campioni di calore, gli standard e gli spazi per 25 minuti a 175-210 ° C in un forno. </li><li> Rimuovere tutti i tubi e lasciare raffreddare. Aggiungere 150 ml di 30% di H 2 O 2 a ciascuno dei tubes. </li><li> Campioni di calore, gli standard e gli spazi per 30 minuti a 175-210 ° C. </li><li> Rimuovere i campioni, gli standard e gli spazi di calore. Se una delle soluzioni non sono ancora incolore, aggiungere 50 microlitri di H 2 O 2 a tutti i tubi e il calore per altri 15 minuti a 175-210 ° C. </li><li> Aggiungere 3,9 mL Nanopure H 2 O, 0,5 ml di soluzione di ammonio molibdato e 0,5 mL di soluzione di acido ascorbico ad ogni provetta. </li><li> Tutti i tubi di calore per 5-7 minuti in un bagno di acqua bollente. </li><li> Misurare l&#39;assorbanza di ogni standard e campione a 820 nm utilizzando un Agilent 8453 spettrofotometro UV-Visibile. La provetta contenente 0,0 mmol fosforo dovrebbe essere usato come la protezione da tutti gli standard e sperimentali LUV campioni. Il tubo che contiene il 0,2 mM trypsin/2.0 mM Bowman-Birk soluzione inibitori dovrebbero essere usati come bianco per il controllo LUV campione. </li><li> Un lineare contenuto assorbanza vs fosforo curva standard può essere prodotto ed utilizzato per calcolare il totale phosphOrus LUV contenuto e la concentrazione dei campioni. </li></ol> 3. Preparazione Soluzioni Peptide <ol><li> Sciogliere peptide in Nanopure H 2 O. Peptidi utilizzati in questo test come descritto deve contenere un residuo di triptofano. </li><li> Misurare l&#39;assorbanza della soluzione di peptidi a 282 nm in triplice copia. Calcolare la concentrazione del peptide utilizzando il coefficiente di estinzione molare per triptofano di 5700 M -1 cm -1. </li><li> Diluire in acqua peptide Nanopure ad una concentrazione finale di 30 micron. Conservare a -20 ° C </li></ol> 4. Traslocazione Quantificazione <ol><li> Preparazione di campioni sperimentali e di controllo in tubi da microcentrifuga 1,7 ml. Aggiungi luvs sufficiente per ogni soluzione per una concentrazione finale di 250 micron. Aggiungi sufficiente Bowman-Birk soluzione inibitore in modo che inibitore è una concentrazione finale 10 volte superiore alla concentrazione tripsina. Aggiungi abbastanza 10 mM tampone HEPES per portare il volume finale di soluzione a 450 microlitri. </li> &lt;li&gt; si pongono 50 microlitri soluzione peptide in un fluorimetro Starna micro cella di quarzo. Il rapporto tra luvs e peptide è sufficientemente alta da assicurare che praticamente tutti i peptidi intatti sono in stretta vicinanza ad un gruppo abbastanza dansyl per dare un segnale FRET, anche se nessuno ha traslocato nella vescicola. Ciò è coerente con l&#39;analogo FRET osservato in condizioni di controllo per i peptidi che fanno e non traslocare in vescicole. </li><li> Aggiungere il campione sperimentale o di controllo per la soluzione del peptide nella cuvetta. Questo dovrebbe portare la concentrazione del peptide finale a 3 micron. </li><li> Iniziare un esperimento di 25 minuti fluorescenti cinetica immediatamente dopo l&#39;aggiunta di sperimentale o di controllo LUV soluzione, prendendo una lettura fluorescenza almeno una volta al secondo. Impostare la lunghezza d&#39;onda di eccitazione a 280 nm, la lunghezza d&#39;onda di emissione a 525 nm, e la temperatura a 25 ° C. Utilizzando un spettrofotometro Cary Eclipse a fluorescenza, abbiamo impostato la sensibilità PMT ad alta. </li></ol><html> 5. Generazione di un rapporto quantitativo Traslocazione <ol><li> Definire fluorescenza iniziale (F o) come la lettura a fluorescenza, dopo quindici secondi di raccolta dei dati. Nella nostra configurazione dello strumento, abbiamo trovato che i primi quindici secondi di fluorescenza dati raccolti sono inaffidabili a causa della miscelazione, la chiusura della camera campione, e le altre perturbazioni al sistema dopo l&#39;aggiunta del campione. Dividere ogni lettura successiva o F per ottenere la fluorescenza relativa (F / F 0) in ogni punto. </li><li> Media tutte le letture relative a fluorescenza da l&#39;ultimo minuto della sperimentazione per ottenere un finale fluorescenza relativa media <img alt="[F / Fo] avg" src="/files/ftp_upload/3571/3571eq1.jpg" /> . </li><li> Dividere il <img alt="[F / Fo] avg" src="/files/ftp_upload/3571/3571eq1.jpg" /> per i campioni di controllo da parte della <img alt="[F / Fo] avg" src="/files/ftp_upload/3571/3571eq1.jpg" /> per i campioni sperimentali per ottenere un corretto valore finale fluorescenza. </li></ol>le &quot;&gt; 6. Risultati Rappresentante La Figura 2 mostra i risultati di questo test un peptide rappresentante che ha mostrato la traslocazione robusto. Il segnale in questo esperimento (traccia nera) mostra un netto calo della FRET segnale nel tempo. Tuttavia, è importante controllare per la potenziale perdita di segnale FRET a causa dell&#39;inibizione tripsina incomplete o altri fattori non correlati alla capacità di traslocazione. A tal fine, abbiamo sempre anche misurare il segnale FRET tra peptide e luvs contenenti sia tripsina e Bowman-Birk inibitore della tripsina (grigio traccia, Figura 2). Nelle nostre mani, è stato importante effettuare questo controllo per ogni peptide ogni volta che viene eseguito un esperimento. Questo ci permette di correggere in modo chiaro per eventuali variazioni del segnale a causa di eventuali differenze tra le preparazioni delle vescicole lipidiche o rumore dello strumento, che può essere significativo per i segnali relativamente deboli fluorescenti tipicamente osservati a queste concentrazioni. L&#39;importanza del controllo esperiment utilizzando luvs contenenti inibitori della tripsina è evidenziata dai dati mostrati in Figura 3. In questo caso, il segnale è diminuito peptide una quantità simile a quella in figura 2 nel campione sperimentale (traccia nera). Tuttavia, il campione di controllo mostra un calo più rapido di questo peptide, quindi la sua traslocazione netto è più basso. Sezione 5 del nostro protocollo descrive un metodo semplice per quantificare traslocazione da questo esperimento. Rapporti di traslocazione superiori sono indicativi di peptidi che traslocare in modo efficace; il rapporto di traslocazione per il peptide cellula penetrando mostrato nella Figura 2 è 1,16, mentre debolmente peptidi translocating hanno rapporti traslocazione più vicino a 1. Nella nostra esperienza, l&#39;errore standard di tre esperimenti indipendenti eseguiti con preparazioni diverse vescicola è nel range da 0,01 a 0,06. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3571/3571fig1.jpg" /> Figura 1. Schematica di translocatsaggio di ioni. Sperimentale LUV campioni (A) sono drogato con fluorescenti PAPA dansyl (barre nere) e contengono incapsulato tripsina (forbici). Inibitore della tripsina (cerchio rosso) è utilizzato per inibire la tripsina al di fuori del luvs. Il luvs sono esposti al peptide (viola). Peptide di associazione con i rendimenti LUV membrane uno FRET segnale (verde), che diminuisce man mano che i peptidi translocting incontro disinibita tripsina interno. Sia tripsina e inibitore della tripsina sono incapsulati in controllo LUV campioni (B) per misurare la diminuzione del segnale FRET estranei a traslocazione. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3571/3571fig2.jpg" /> Figura 2. Dati rappresentativi per una cella-peptide penetrante. Un rappresentante translocating pepide antimicrobica mostra un calo significativo FRET segnale rispetto al suo controllo. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3571/3571fig3.jpg" /> Figura3. Dati rappresentativi sottolineando l&#39;importanza del controllo. Incompleta inibizione della digestione trittico di un non-peptidico translocating porta ad un calo di FRET segnale nel tempo in entrambe le sperimentali e di controllo LUV soluzioni. Perché la differenza tra il controllo e le tracce sperimentale è relativamente piccola, questo mutante è caratterizzato come un peptide debolmente translocating.

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</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Il protocollo presentato qui può essere utilizzato per valutare la variazione relativa della concentrazione di peptidi all&#39;interno e all&#39;esterno delle vescicole lipidiche. Questi cambiamenti sono legati alla capacità di traslocazione. Questo protocollo può essere utilizzato per identificare cellule penetrante peptidi con potenziale come vettori di consegna della droga. Come interesse nella cella-penetrante peptidi cresce, sarà interessante vedere come i metodi che misurano direttamente l&#39;evento traslocazione...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td></tr><tr><td> 16:00-18:01 PG </td><td> Lipidi Avanti Polar </td><td> 840457C </td></tr><tr><td> 01:18 Dansyl PE </td><td> Lipidi Avanti Polar </td><td> 810330C </td></tr><tr><td> 16:00-18:01 PC </td><td> Lipidi Avanti Polar </td><td> 850457C </td></tr><tr><td> Suini tripsina </td><td> Sigma </td><td> T-0303 </td></tr><tr><td> Bowman-Birk tripsina / chimotripsina inibitore </td><td> Sigma </td><td> T-9777 </td></tr><tr><td> Mini-estrusore </td><td> Lipidi Avanti Polar </td><td> 610000 </td></tr><tr><td> Ammonio molibdato (para) </td><td> Alfa Aesar </td><td> 10811 </td></tr><tr><td> Acido L-ascorbico </td><td> Sigma </td><td> A1417 </td></tr><tr><td> Perossido di idrogeno, 30% di soluzione </td><td> Mallinckrodt prodotti chimici </td><td> 5240-05 </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Sigma </td><td> H-3375 </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> Sigma </td><td> S-9625 &lt;/ Td&gt; </tr><tr><td> EDTA </td><td> Sigma </td><td> E5134 </td></tr><tr><td> NaH 2 PO 4 </td><td> Sigma </td><td> S-0751 </td></tr></tbody></table>

misurazione traslocazione peptide in grandi vescicole unilamellari

Measuring Peptide Translocation into Large Unilamellar Vesicles

C&#39;è un interesse attivo nel peptidi che attraversano facilmente le membrane cellulari senza l&#39;ausilio di recettori di membrana delle cellule 1. Molti di questi sono indicati come cella penetrante peptidi, che sono spesso noti per il loro potenziale come vettori di consegna della droga 1-3. Inoltre, c&#39;è un interesse crescente in peptidi antimicrobici che operano attraverso meccanismi di membrana non-litica 4,5, in particolare quelli che attraversano le membrane batteriche senza causare la lisi cellulare e uccidere le cellule interferendo con i processi intracellulari 6,7. In realtà, gli autori hanno sempre sottolineato il rapporto tra peptidi cellula-penetrante e antimicrobico 1,8. Una solida conoscenza del processo di traslocazione della membrana e il rapporto tra struttura peptidica e la sua capacità di traslocare devono essere efficaci, i test riproducibili per traslocazione. Diversi gruppi hanno proposto metodi per misurare la traslocazione in unilamel grandeLAR vescicole lipidiche (luvs) 9-13. Luvs servire come modelli utili per le membrane delle cellule batteriche e eucariotiche e sono frequentemente utilizzati in studi peptide fluorescente 14,15. Qui, descriviamo la nostra applicazione del primo metodo sviluppato da Matsuzaki e collaboratori di prendere in considerazione peptidi antimicrobici, come magainin e buforin II 16,17. Oltre a fornire il nostro protocollo per questo metodo, abbiamo anche presentare un approccio diretto per l&#39;analisi dei dati che quantifica la capacità traslocazione da questo test. I vantaggi di questo test traslocazione rispetto ad altri che ha il potenziale per fornire informazioni circa la velocità di traslocazione della membrana e non richiede l&#39;aggiunta di un&#39;etichetta fluorescente, che possono alterare le proprietà del peptide 18, di triptofano contenenti peptidi. In breve, la capacità di traslocazione in vescicole lipidiche è misurata in funzione della Foster Resonance Energy Transfer (FRET) tra i residui di triptofano nativi e dansyl fosfatidiletanolamina quando le proteine ​​sono associate con l&#39;esterno LUV membrana (Figura 1). Cell-penetrante peptidi sono spaccati in quanto incontro tripsina disinibita incapsulato con il luvs, porta alla dissociazione dal LUV membrana e un calo del segnale FRET. Il calo FRET segnale osservato per un peptide translocating è significativamente maggiore di quello osservato per il peptide stesso quando il luvs contengono sia tripsina e inibitore della tripsina, o quando un peptide che non spontaneamente attraversare le membrane lipidiche è esposto a tripsina contenenti luvs. Questo cambiamento di fluorescenza fornisce una quantificazione diretta della traslocazione del peptide nel tempo.

Questa dettagli del protocollo un metodo per la misura quantitativa della traslocazione peptidica in grandi vescicole lipidiche unilamellari. Questo metodo fornisce anche informazioni circa la velocità di traslocazione della membrana e può essere utilizzato per identificare i peptidi che in modo efficiente e spontaneamente croce doppi strati lipidici.

Misurazione Traslocazione Peptide in grandi vescicole unilamellari

Esiste un attivo interesse per i peptidi che attraversano agevolmente le membrane cellulari senza l'ausilio di recettori di membrana1. Molti di questi sono definiti...

Per quantificare la traslocazione del peptide attraverso le membrane delle vescicole. Vescicole lipidiche marcate con fluorescenza vengono generate con tripsina incapsulata. Viene aggiunto un inibitore della tripsina per inibire l'attività di qualsiasi tripsina esogena, lasciando attiva la tripsina all'interno del lume della vescicola.Solo quando vengono aggiunti peptidi marcati con fluorescenza alle vescicole, i loro marcatori fluorescenti agiscono da donatori FRET ed eccitano le molecole fluorescenti presenti sulla vescicola. Tuttavia, quando le proteine attraversano la membrana, vengono digerite dalla tripsina e il segnale FRET si perde. L'analisi spettrometrica rivela il grado di traslocazione del peptide, che si manifesta come una diminuzione del segnale FRET tra le vescicole e il peptide nel tempo.Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ad altri metodi, inclusi altri approcci basati su vescicole lipidiche e metodi per misurare l'ingresso di peptidi nelle cellule, consiste nel fornire informazioni sulla cinetica dell'ingresso nella membrana, e non richiede l'aggiunta di un marcatore fluorescente ai peptidi qualora contengano un triptofano. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nella progettazione e nell'ingegnerizzazione di peptidi attivi sulla membrana, ad esempio quali caratteristiche siano necessarie per una efficace translocazione attraverso la membrana. Il primo passaggio di questa procedura consiste nel preparare vescicole lipidiche grandi e unilamellari o UUVs da utilizzare come modelli di membrana cellulare per il saggio.Cominciare mescolando fosfatidilcolina, fosfatidilglicerolo e cinque dimetilammino naftalene. Un solfofilo fosfatidil etanolammina in cloroformio. In un rapporto di 50 a 45 a 5, 0,376 milligrammi di lipidi totali sono generalmente sufficienti per produrre un numero adeguato di vescicole per un singolo esperimento o prova di controllo.Preparare un vial come campione sperimentale e uno come controllo; evaporare il cloroformio utilizzando un flusso di gas azoto. I lipidi essiccati che rimangono dopo questo passaggio sono denominati cake lipidici. Essiccare i cake lipidici da nove a 14 ore in un essiccatore sotto vuoto.Successivamente, preparare una soluzione madre di HEI 10 millimolare, una soluzione madre di tripsina da suino 0,4 millimolare e una soluzione madre di inibitore della tripsina di Bowman-Birk 4,0 millimolare. I dettagli per la preparazione sono disponibili nel documento allegato. Aggiungere un volume uguale della soluzione madre di tripsina 0,4 millimolare e della soluzione tampone HEI 10 millimolare ai cake lipidici essiccati. Quindi vortexare il vial per ricostituire le vescicole multilamellari (MVS). Per ricostituire le MVS di controllo, aggiungere un volume uguale della soluzione madre di tripsina 0,4 millimolare e dell'inibitore della tripsina 4,0 millimolare al cake lipidico essiccato, quindi vortexare come in precedenza.Dopo aver ricostituito le mvs, trasferire le soluzioni di MLV da provette in vetro a provette microcentrifuga da 1,7 millilitri. Successivamente, sottoporre le soluzioni di MLV a cinque cicli di congelamento-scongelamento, alternando azoto liquido e un bagno d'acqua a 30 gradi Celsius. Quindi, preparare un estrusore lipidico inumidendo due supporti per filtro nel Buffer di Heiss.Quindi posizionare ciascuno di essi su un pezzo di estrusore in Teflon inumidito e inserire una membrana in nucleoporo con pori da 0,1 micron tra i due pezzi di estrusore in Teflon. Ora posizionare i pezzi dell'estrusore all'interno di un cilindro metallico dell'estrusore e posizionare un distanziale a forma di ciambella sopra i due pezzi dell'estrusore. Avvitare il coperchio metallico del cilindro dell'estrusore e quindi inserirlo nel supporto utilizzando una siringa di vetro da 250 microlitri.Riempire lo spazio vuoto dell'estrusore con 500 microlitri di tampone He piece 10 millimolare per prevenire qualsiasi perdita del campione di vescicole. Trasferire il campione in un becher da 10 millilitri.Quindi caricare ogni campione di MLV nell'estrusore e spingere il campione attraverso la membrana almeno 21 volte. Per garantire una dimensione uniforme delle vescicole Ella dopo l'estruzione, trasferire le vescicole lipidiche grandi di ELLA o L UUVs in una provetta microcentrifuga da 1,7 millilitri. Conservare gli UUVs a quattro gradi Celsius e utilizzarli entro 48 ore.Per valutare la concentrazione di LUV, si determina il contenuto totale di fosforo nel campione. Preparare quanto segue secondo le specifiche indicate nel protocollo scritto allegato: acido solforico 8,9 N, soluzione al 2,5% p/v di molibdato di ammonio, soluzione al 6% p/v di acido ascorbico e soluzione tampone fosfato 0,65 millimolare.Preparare sei standard di fosforo come indicato qui. Quindi preparare un bianco di LUV con lo stesso volume di soluzione di tripsina 0,2 millimolare e inibitore Bowman BIR 2,0 millimolare utilizzati per i controlli. Questo passaggio viene effettuato per correggere la presenza di sali di fosforo essiccati nella polvere dell'inibitore Bowman B.Successivamente, pipettare circa 0,1 micromoli, generalmente circa 25 microlitri di UUV, in provette di vetro monouso, in triplice replicato. Aggiungere quindi 450 microlitri di H₂SO₄ normale 8,9 in ciascuna delle provette contenenti campione, standard e bianco. Successivamente, collocare i campioni, gli standard e i bianchi in un forno a temperatura compresa tra 175 e 210 °C per 25 minuti.Trascorsi 25 minuti, rimuovere tutti i tubi dal forno e lasciarli raffreddare. Aggiungere 150 microlitri di 30%H2O a ciascun tubo. Quindi riscaldare i campioni, gli standard e i bianchi per altri 30 minuti a una temperatura compresa tra 175 e 210 gradi Celsius.Dopo 30 minuti, rimuovere gli standard, i campioni e i bianchi dal riscaldamento. Se alcuna delle soluzioni non è ancora incolore, aggiungere 50 microlitri di H2O in tutti i tubi e riscaldare per ulteriori 15 minuti a una temperatura compresa tra 175 e 210 gradi Celsius. Una volta che le soluzioni sono diventate incolori, aggiungere a ciascun tubo 3,9 millilitri di H2O nano pura, 0,5 millilitri di soluzione di molibdato di ammonio e 0,5 millilitri di soluzione di acido ascorbico.Quindi riscaldare tutti i tubi per cinque a sette minuti. In un bagno di acqua in ebollizione, misurare l'assorbanza di ogni standard e campione a 820 nanometri utilizzando uno spettrofotometro UV-visibile Agilent 8 4 5 3. Le concentrazioni di LUV sperimentali e di controllo devono essere misurate separatamente.Il tubo contenente 0,0 millimoli di fosforo deve essere utilizzato come bianco per tutti gli standard e i campioni sperimentali di LUV. Il tubo contenente 0,2 millimolare di tripsina, 2,0 millimolare di osso e soluzione inibitrice di bir deve essere utilizzato come bianco per il campione di controllo di LUV. La curva standard lineare di assorbanza rispetto al contenuto di fosforo ottenuta deve essere utilizzata per calcolare il contenuto totale di fosforo e la concentrazione di LUV dei campioni.Per preparare le soluzioni peptidiche, sciogliere il peptide in Oppu H2O; i peptidi utilizzati in questo saggio devono contenere un residuo di triptofano. Misurare l'assorbanza della soluzione peptidica a 282 nanometri in triplice replicato. Calcolare la concentrazione del peptide utilizzando il coefficiente di estinzione molare per il triptofano pari a 5.700.Inverso molare inverso centimetri diluire il peptide in acqua nano pura fino a una concentrazione finale di 30 micromolare, conservare a meno 20 gradi Celsius. Per quantificare la traslocazione, preparare campioni sperimentali e di controllo in provette microcentrifuga da 1,7 millilitro. Aggiungere quantità sufficiente di UUV a ogni soluzione per ottenere una concentrazione finale di 250 micromolare.Aggiungere una quantità sufficiente di soluzione inibitore Bowman BIR in modo che l'inibitore raggiunga una concentrazione finale 10 volte maggiore rispetto alla concentrazione di tryina. Aggiungere una quantità sufficiente di tampone heis 10 millimolare per portare il volume finale della soluzione a 450 microlitri. Versare 50 microlitri di soluzione peptidica in una cuvetta per fluorimetro stana micro chords e inserirla nel programma dello spettrofotometro.Uno spettrofotometro fluorimetrico per eseguire un esperimento di cinetica fluorimetrica della durata di 25 minuti, nel quale viene registrata un'acquisizione di fluorescenza almeno una volta al secondo con una lunghezza d'onda di eccitazione di 280 nanometri e una lunghezza d'onda di emissione di 525 nanometri a 25 gradi Celsius. Con la sensibilità del PMT impostata al massimo, aggiungere il campione sperimentale o di controllo alla soluzione peptidica nel qve. Questo deve portare immediatamente la concentrazione finale del peptide a tre micromolari, iniziando subito l'esperimento di cinetica fluorimetrica.Dopo aver eseguito sia i campioni sperimentali che quelli di controllo, calcolare i rapporti di traslocazione come descritto nel documento allegato. Il rapporto tra i peptidi e il gruppo dansil è sufficientemente elevato da garantire che virtualmente tutti i peptidi integri siano abbastanza vicini a un gruppo dansil da produrre un segnale FRET, anche se nessuno di essi ha attraversato la vescicola. Questo risultato è coerente con il simile segnale FRET osservato nelle condizioni di controllo per peptidi che attraversano o non attraversano le vescicole.Gli saggi di traslocazione sono stati eseguiti come descritto in questo video. Questa figura mostra i risultati ottenuti con un peptide rappresentativo che ha evidenziato una traslocazione robusta. Il segnale in questo esperimento, rappresentato dalla traccia nera, mostra una marcata diminuzione del segnale FRET.Nel tempo, rapporti di traslocazione più elevati indicano peptidi che si traslocano in modo efficiente. Il rapporto di traslocazione per i peptidi penetranti cellulari mostrati qui è 1,19; i peptidi con traduzione settimanale presentano rapporti di traslocazione più vicini a uno, al fine di controllare la potenziale perdita del segnale FRET dovuta a triptasi incomplete, inibizione o altri fattori non correlati alla capacità di traslocazione. Viene misurato il segnale FRET tra il peptide e le UUV contenenti sia la tripsina che l'inibitore della tripsina Bowman-BRK.Questo è mostrato come traccia grigia. L'importanza dell'esperimento di controllo che utilizza UUV contenenti inibitore della tripsina è evidenziata dai dati mostrati qui. In questo caso, il segnale del peptide è diminuito in misura simile a quella della figura precedente nel campione sperimentale rappresentato dalla traccia nera.Tuttavia, il campione di controllo mostra una diminuzione più rapida per questo peptide, quindi la sua traslocazione netta è inferiore. Dopo aver visto questo video, dovresti avere un'idea chiara di come preparare vescicole lipidiche e misurare la traslocazione di peptidi contenenti triptofano. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di iniziare a raccogliere i dati immediatamente dopo che il peptide e le vescicole sono stati mescolati.

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Misurazione Traslocazione Peptide in grandi vescicole unilamellari

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