Valutare mutazione somatica nel Ramos cellule B dopo iperespressione o Knockdown di specifici geni

L'obiettivo generale del seguente esperimento è modificare l'espressione di un gene e successivamente misurare il suo impatto sulla mutazione somatica iperaccellerata. Questo viene ottenuto trasfettando le cellule Bosque 23 per produrre particelle virali contenenti un costrutto di sovraespressione o un costrutto contenente SHRA. Come secondo passaggio, le cellule ramo vengono infettate con i virus, determinando la riduzione dell'espressione (knockdown) o la sovraespressione del gene di interesse.

Successivamente, singole cellule clonali vengono coltivate per diverse settimane, consentendo alle cellule di accumulare mutazioni. Infine, l'effetto della modifica dell'espressione genica può essere determinato analizzando la perdita di IgM e mediante il sequenziamento dei geni IG. Questo metodo potrebbe contribuire a identificare nuovi fattori coinvolti nella diversificazione degli anticorpi.

Iniziare eluendo 600 microlitri di DMEM riscaldato in un tubo microcentrifuga da 1,5 millilitri. Quindi, avendo cura di pipettare direttamente nel mezzo, aggiungere 30 microlitri di FU gene sei nel tubo, vorticare la soluzione per meno di un secondo e poi incubare il tubo a temperatura ambiente per cinque minuti. Successivamente, per un'infezione lentivirale come questa, aggiungere sei microgrammi di costrutto S-H-R-N-A e 1,5 microgrammi ciascuno di P-V-S-V-G-P-M-D-L-G-P-R-R-E e PRSV rev alla miscela di DMEM e FU gene sei.

Vortexare brevemente la soluzione, quindi incubare nuovamente i due bit a temperatura ambiente, questa volta per 25 minuti. Infine, trasfettare una coltura cellulare Bosque 23 al 50-60% di confluenza con il gene D-N-A-D-M-E-M FU sei. Mescolare e incubare le cellule a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica per 24 ore.

Il giorno successivo, aggiungere cinque millilitri di DMEM alle cellule e rimetterle nell'incubatore per altre 24 ore. Il terzo giorno dopo la trasfezione, utilizzare una siringa da 10 millilitri per raccogliere 10 millilitri di mezzo dalle cellule transfettate box 23, quindi applicare un filtro da 0,45 micrometri all'estremità della siringa. Raccogliere il mezzo filtrato in un tubo pulito in polipropilene da 15 millilitri. 24 ore prima dell'infezione, seminare due millilitri di due volte 10 alla quinta cellule per millilitro di cellule ramo in RPMI completo in una piastra a sei pozzetti. Il giorno seguente, aggiungere tre microlitri di una soluzione di polibrene da 10 microgrammi per millilitro e un millilitro di virus alle cellule ramo, quindi mescolare bene la sospensione cellulare mediante pipettaggio.

Per il controllo non infetto, aggiungere un millilitro di RPMI completo e tre microlitri di polibrene in una delle pozzette al posto del virus. Infettare inoltre una pozzetta con un controllo negativo abbinato e un'altra con un vettore contenente GFP per determinare l'efficienza di infezione mediante fax. Centrifugare quindi la piastra a sei pozzette a 3000 ×g per 90 minuti a temperatura ambiente, quindi rimettere la piastra nell'incubatore per 48 ore.

Infine, centrifugare le cellule infette in un tubo in polipropilene da 15 millilitri a 400 G per quattro minuti. A temperatura ambiente, aspirare il mezzo assicurandosi di non disturbare il pellet cellulare e risospendere le cellule in RPMI fresco. Dopo aver contato le cellule, utilizzare un'equivalenza di cellule ramo infette pari a 10 cellule per millilitro.

In una soluzione di media condizionato RPMI e FBS fino a un volume finale di 10 millilitri per ogni piastra seminata. Quindi utilizzare una pipetta multicanale per seminare le piastre a 96 pozzetti con 100 microlitri per pozzetto delle cellule diluite.

Dopo aver incubato le piastre per 24 ore a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica, utilizzare un microscopio per esaminare ogni singolo pozzetto. Per confermare la presenza di cellule, poiché determinare la profondità corretta per identificare singole cellule può risultare difficile. Innanzitutto, provare a mettere a fuoco i numeri dei pozzetti stampati sul fondo della piastra a 96 pozzetti.

Quindi provare a cercare una cellula dopo due settimane. Verificare la presenza di colonie cellulari lungo i bordi delle pozzette utilizzando inchiostro indelebile. Contrassegnare le pozzette con una crescita cellulare robusta, quindi trasferire le colonie in piastre a 24 pozzette con un millilitro di RPMI per un'ulteriore incubazione.

Dopo alcuni giorni di crescita, trasferire le cellule in una piastra a sei pozzetti e continuare l'incubazione delle colture. Tre settimane dopo la semina delle colonie cellulari nella piastra a sei pozzetti Eloqua, raccogliere cinque volte 10 alla quinta cellule da ciascun pozzetto in un tubo microcentrifuga da 1,5 millilitro. In questo momento, raccogliere anche le cellule da ciascuno dei pozzetti di controllo e con silenziamento dell'HRNA, oltre a un campione per un controllo non colorato.

Ora centrifugare tutte le cellule a 400 G per quattro minuti a temperatura ambiente, lavando due volte le cellule con un millilitro di PBS per la seconda centrifugazione. Dopo il secondo lavaggio, sospenderemo il pellet del controllo non colorato in 50 microlitri di PBS e gli altri pellet in PBS più una diluizione 1:20 di anticorpo anti-umano IgM marcato con PE. Quindi incubare tutti i campioni cellulari sul ghiaccio per un'ora dopo aver lavato le cellule altre due volte con PBS come in precedenza, scartare il soprannatante e risospendere tutti i pellet in 100 microlitri di PBS.

Successivamente, trasferire le cellule sospese e colorate e le cellule di controllo non colorate in provette per citofluorimetria e analizzare quindi le cellule mediante citometria a flusso. Confrontare la percentuale di cellule negative per IgM dai controlli rispetto alle cellule con silenziamento di S-H-R-N-A. Un vettore retrovirale per sovraespressione di un ID è stato trasfettato in cellule bosque 23.

I virus sono stati quindi raccolti e utilizzati per infettare cellule Ramos, sia di tipo selvatico (wt) che sovraesprimenti a ID; le cellule a ID.High sono state seminate singolarmente e coltivate per tre settimane, al termine delle quali sono state analizzate per l'espressione genica mediante RT-PCR quantitativa. Come previsto, i risultati della RT-PCR mostrano un marcato aumento dell'espressione di a ID dopo l'infezione delle cellule con un vettore di sovraespressione di a ID. La perdita di IgM sulle cellule infette è stata valutata anche mediante citometria a flusso. L'IgM di superficie è stata misurata mediante citometria a flusso, utilizzando i dati della figura precedente al tempo di tre settimane, e la percentuale di perdita di IgM è stata calcolata per le cellule di tipo selvatico e quelle ad alta espressione di a ID, rappresentandola graficamente. Come previsto, le cellule che sovraesprimono a ID hanno mostrato una maggiore perdita di IgM di superficie.

In un esperimento separato, sono stati prodotti lentivirus contenenti o un S-H-R-N-A irrilevante come controllo oppure un S-H-R-N-A diretto contro un fattore di riparazione del DNA ad alta fedeltà, che si ritiene protegga contro la SHM, in cellule bosque 23. I lentivirus sono stati quindi utilizzati per infettare una clone a ID elevato di cellule Ramos. Ancora una volta, è stata analizzata l'espressione genica e, come previsto, si è osservata una riduzione dei livelli del fattore di riparazione del DNA in presenza del S-H-R-N-A specifico contro tale fattore. Inoltre, dopo tre settimane è stata analizzata la perdita di IGM nei cloni monocellulari, poiché si ritiene che il fattore fornisca protezione contro le mutazioni durante la SHM; pertanto, in assenza di tale fattore si verifica un aumento della perdita di IGM e della SHM, come si può osservare in questa figura.

Dopo aver guardato questo video, dovresti avere una buona comprensione di come eseguire infezioni virali di costrutti contenenti OVEREXPRESSION o S-H-R-N-A nella linea cellulare di linfociti B raw, e successivamente di come misurare la mutazione ipersomatica in queste cellule.