Analisi di espressione di mammifero Linker-istoni Sottotipi

L'obiettivo generale di questa procedura è analizzare i livelli di espressione dei sottotipi della istone H1 attraverso l'analisi sia dei livelli di mRNA di H1 che della misurazione dei livelli proteici di H1. Per effettuare l'analisi dell'mRNA, l'RNA totale viene innanzitutto estratto da cellule in coltura o da tessuto murino. Il secondo passaggio della procedura consiste nell'eseguire una trascrizione inversa dell'RNA totale con primer casuali, seguita da saggi di PCR quantitativa in tempo reale per ciascuno dei geni dei sottotipi di H1. L'analisi della proteina istone H1 inizia con la preparazione di estratti totali di istoni da tessuti murini o da cellule in coltura.

Successivamente segue la frazionatura e la quantificazione di ciascun sottotipo di istone H1 e dell'istone centrale H2B mediante analisi di HPLC in fase inversa. Infine, la PCR quantitativa in tempo reale e l'analisi di HPLC in fase inversa mostrano i livelli di espressione sia di mRNA che di proteine, per ciascun sottotipo di H1.

Siamo studenti laureati del laboratorio FES della dottoressa Yuhan presso la Scuola di Biologia del Georgia Institute of Technology. Oggi vi mostreremo un insieme di saggi completi per l'analisi dell'espressione delle H one nei sottotipi di H one nei mammiferi. Attraverso questi saggi, potrete ottenere una misurazione quantitativa dei livelli di espressione di mRNA e proteine in vari sottotipi di H one.

La proteina istonica H1 è la principale proteina cromosomica strutturale che facilita il ripiegamento superiore del cromosoma; esistono molteplici varianti dell'istone H1, espresse in modo differenziale durante la differenziazione cellulare e lo sviluppo. Il profilo di espressione di questi sottotipi H1 è necessario per una migliore comprensione della regolazione della struttura e della funzione del cromosoma superiore. Iniziamo dunque.

Prima dell'estrazione dell'RNA, tutte le superfici di lavoro e le pipette devono essere pulite con etanolo al 70% e trattate con una soluzione di decontaminazione per RNAsi. Questa pratica riduce il rischio di contaminazione da RNAsi e di degradazione dell'RNA. Inoltre, si devono indossare guanti per tutte le procedure, a partire dall'estrazione dell'RNA da colture cellulari aderenti, aspirando il mezzo di coltura e risciacquando le cellule con PBS.

Quindi rimuovere il PBS dai pozzetti. È necessaria una quantità sufficiente di reagente triolo per ottenere RNA di alta qualità. Utilizzare un millilitro di reagente triolo per estrarre l'RNA da un pozzetto di una piastra a sei pozzetti; procedere quindi all'estrazione dell'RNA dalle cellule seguendo il manuale del produttore per il reagente triolo. Dopo l'estrazione dell'RNA, misurare la concentrazione di RNA utilizzando il NanoDrop 1000.

Il rendimento tipico varia da cinque a 15 microgrammi di RNA per un milione di cellule coltivate. Prima di procedere alla sintesi di CDNA, analizzare la qualità dell'RNA mediante elettroforesi GE per eliminare eventuali contaminazioni da tracce di DNA genomico; trattare i campioni di RNA con DNasi priva di RNasi seguendo le istruzioni del produttore per la retrotrascrizione dell'RNA totale in CDNA. Utilizzare il sistema di sintesi del primo filamento Superscript Tre secondo le istruzioni del produttore. Poiché l'mRNA della maggior parte dei geni H1 non presenta code poli A, è fondamentale utilizzare esameri casuali anziché oligo DT come primer.

Per la sintesi di CDNA, dopo la trascrizione inversa, l'amplificazione del CDNA può essere ottenuta mediante Q-R-T-P-C-R, rilevata in precedenza al saggio Q-R-T-P-C-R con il colorante cyber green. Sono stati progettati primer PCR diretti e inversi specifici per ciascun gene H one e per il gene di riferimento interno, e l'efficienza dei primer è stata verificata mediante il metodo della curva standard, come descritto nel protocollo scritto. Procedere quindi a preparare ciascuna reazione PCR mescolando primer, CDNA e supermix con colorante CYBERG green.

Mescolare accuratamente le reazioni in una piastra PCR da 96 pozzetti utilizzando sigilli adesivi per micros EAL B per assicurare che il coperchio sia ben sigillato alla piastra. Quindi, vortexare la piastra sigillata e centrifugare brevemente per far sedimentare le miscele di reazione. Posizionare la piastra nel sistema di rilevamento in tempo reale My IQ a singolo colore per QPCR.

Impostare le condizioni di QPCR ed eseguire la corsa come indicato nel testo successivo all'amplificazione. Esaminare le curve di amplificazione per verificare l'efficienza della PCR e il valore soglia del ciclo o CT. La linea soglia può essere impostata automaticamente dal software del sistema ottico IQ five versione 2.0.

Poiché il cyber green rileva qualsiasi DNA a doppio filamento, è fondamentale eseguire un'analisi della curva di denaturazione dopo la QPCR per assicurarsi che venga amplificato e rilevato l'amplificone desiderato, e non i dimeri di primer o contaminanti. Per il programma di analisi della curva di denaturazione, lo strumento di QPCR riscalda i campioni da 55 gradi centigradi a 95 gradi centigradi a incrementi di 0,5 gradi centigradi con raccolta dei dati. Poiché la temperatura o TM del DNA a doppio filamento dipende dalla lunghezza dell'amplificone e dal contenuto di GC, diversi ampliconi avranno differenti TM.

Esaminare le curve derivate di fusione dei prodotti QPCR per confermare la temperatura di fusione specifica degli ampliconi desiderati, nonché l'assenza di picchi di ampliconi indesiderati, come ad esempio le curve di fusione degli ampliconi PCR di H one A mostrate qui con una TM di 86 gradi centigradi. Procedere all'analisi dei dati QPCR mediante il software del sistema ottico IQ five. Normalizzare i valori di espressione dei geni isoforma H one con l'espressione dei geni di controllo per ottenere i livelli di espressione relativi dei geni H one.

Dopo aver dissezionato l'organo di interesse da un topo eutanasizzato, sciacquarlo con PBS freddo. In questa dimostrazione, la preparazione di istoni totali viene eseguita sul fegato; dopo il lavaggio, tritare il tessuto in pezzi con una lametta. Trasferire il tessuto tritato in un omogeneizzatore Dounce, quindi aggiungere tampone saccarosio all'omogeneizzatore in un volume di 10 millilitri per grammo di tessuto.

Procedere all'omogeneizzazione del tessuto con 10-15 movimenti. Dopo aver trasferito gli omogeneati in un tubo da 15 millilitri, centrifugare i campioni a 500 RPM per 30 secondi. Successivamente alla centrifugazione, trasferire con attenzione il soprannatante in un nuovo tubo e centrifugare a 2000 RPM per cinque minuti.

Per pelletizzare le cellule, risospendere il pellet cellulare in 10 millilitri di tampone saccarosio, integrato con lo 0,5% di NP-40. Trasferire il campione in un omogeneizzatore Dounce e eseguire 10 passaggi durante un'incubazione di 20 minuti. A questo punto, si ottengono i nuclei.

Esaminare la qualità dei nuclei al microscopio. Dopo aver centrifugato i nuclei a 2000 giri al minuto per cinque minuti, il soprannatante può essere eliminato. Successivamente, risospendere il pellet di nuclei in tre millilitri di tampone ad alto contenuto salino per ogni grammo di tessuto.

Trasferire il campione in un piccolo omogeneizzatore e omogeneizzare con cinque-dieci passaggi. Aliquotare la sospensione in tre provette eonor. Incubare le provette sul ghiaccio per 20 minuti.

Dopo l'incubazione, centrifugare a 14.000 giri al minuto per 10 minuti per ottenere il pellet di cromatina. Dopo aver eliminato il soprannadante, estrarre le istoni totali aggiungendo 0,8 millilitri di acido solforico 0,2 N a ciascun pellet di cromatina. Utilizzare un pestello per provette eppendorf per macinare accuratamente il pellet finché non sia completamente dissociato.

Incubare i campioni su una piattaforma rotante a quattro gradi centigradi durante la notte. Successivamente alla centrifugazione, trasferire il soprannatante in due provette EOR. Aggiungere 2,5 volumi di etanolo freddo di ghiaccio a ciascuna provetta.

Mantenere i campioni a meno 20 gradi centigradi durante la notte; il giorno seguente, centrifugare a 14.000 giri al minuto per 10 minuti per ottenere il pellet degli istoni totali e scartare il soprannatante. Dopo aver lavato il pellet tre volte con etanolo al 70%, lasciare i tubi aperti in banco per 20-30 minuti per farli asciugare all'aria e procedere immediatamente all'analisi tramite HPLC. Sospendere il pellet di istoni nel volume raccomandato di acqua doppio-distillata, in base alla capacità della colonna in fase inversa e dello strumento HPLC, quindi centrifugare a 14.000 giri al minuto per cinque minuti.

Per rimuovere i residui insolubili, iniettare da 50 a 100 microgrammi di proteina istonica totale sulla colonna a fase inversa del sistema HPLC, ad esempio il GE ACTA purifier UPC 900. Caricamento. Si deve evitare un eccesso di proteina per prevenire l'intasamento della colonna. Eluendo con un gradiente crescente di acetonitrile, come indicato nel protocollo scritto, vengono separati il frazionamento otto, le istoni linker e le istoni core. L'effluente viene monitorato a 214 nanometri e i profili HPLC vengono registrati e analizzati. Le frazioni proteiche possono inoltre essere raccolte mediante il raccoglitore automatico di frazioni GE FRAC nine 20 per ulteriori analisi.

Qui sono mostrate curve di amplificazione tipiche di reazioni H one A-Q-P-C-R utilizzando CDNA preparato da fegato di topo e cellule staminali embrionali di topo. La valutazione del grafico di amplificazione mostra che le reazioni QPCR in triplice replicato di ogni campione hanno prodotto segnali coerenti con valori CT quasi identici, suggerendo un'elevata riproducibilità. L'assenza di accumulo di ampliconi nelle reazioni RT negative indica che non era presente contaminazione da DNA genomico o che questa era minima. Utilizzando i valori CT dei geni H one e dei geni di controllo costitutivi, sono stati calcolati i livelli relativi di espressione dell'RNA per ciascun gene H one.

I grafici mostrati qui sono esempi di risultati calcolati per i geni H one A e H one zero. I livelli relativi di espressione dell'mRNA di H one A sono più elevati nelle cellule staminali embrionali di topo rispetto al fegato di topo, mentre l'espressione di H one zero è molto più alta nel fegato rispetto alle cellule staminali embrionali. La differenza nell'espressione di H one A o H one zero nelle cellule staminali embrionali di topo rispetto al fegato adulto di topo è evidente anche dai profili HPLC delle proteine istoniche.

H uno zero. L'H uno specifico della differenziazione si accumula in grande quantità nel fegato del topo adulto. Al contrario, la proteina H uno zero è quasi assente nelle cellule staminali embrionali del topo non differenziate.

D'altra parte, l'H one A è altamente espressa nelle cellule staminali embrionali, ma è presente a bassi livelli nel fegato di topo adulto attraverso la quantificazione dei picchi di H one. Nel profilo HPLC, la proporzione relativa di ciascun sottotipo individuale di H one all'interno della famiglia H one viene determinata nel fegato di topo adulto. Inoltre, i valori di ciascun sottotipo di H one per nucleosoma possono essere calcolati dal rapporto tra il valore normalizzato del picco dell'assorbanza a 214 nanometri dei corrispondenti sottotipi di H one e la metà del valore normalizzato per l'H two B. Questo valore può essere calcolato in modo analogo per l'H one totale per nucleosoma.

Una volta padroneggiata l'analisi Q-R-T-P-C-R, un sottotipo di H può essere analizzato in un giorno e l'estrazione delle istoni e l'analisi HPRC possono essere completate in tre giorni, se eseguite correttamente. Durante l'analisi Q-R-T-P-C-R dei geni delle istoni H, è fondamentale evitare la degradazione dell'RNA, eliminare la contaminazione da DNA genomico e, soprattutto, includere primer casuali nella reazione di trascrizione inversa. Durante l'estrazione delle istoni e l'analisi HPOC, è importante aggiungere inibitori proteici freschi al buffer di estrazione per prevenire la degradazione delle proteine e prestare attenzione a disgregare completamente la cromatina per facilitare un'estrazione completa delle istoni.

Dopo aver guardato questo video, dovresti avere una buona comprensione di come analizzare in modo completo l'espressione dei sottotipi di istone H1 nei mammiferi a livello sia di mRNA che di proteina.