Name: Analisi di espressione di mammifero Linker-istoni Sottotipi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-19T12:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 40 s
Description: Scopri come analizzare l'espressione degli istoni linker H1 in mammiferi mediante PCR in tempo reale e cromatografia HPLC. Questo metodo quantifica i livelli di mRNA e proteine per studiare la dinamica della cromatina.

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<ol><li>Fan, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((H1+linker+histones+are+essential+for+mouse+development+and+affect+nucleosome+spacing+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">H1 linker histones are essential for mouse development and affect nucleosome spacing in vivo.</a> Mol. Cell Biol. 23, 4559-4572 (2003).</li>
<li>Woodcock, C. L., Skoultchi, A. I., Fan, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+linker+histone+in+chromatin+structure+and+function%3A+H1+stoichiometry+and+nucleosome+repeat+length%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosome+Res%22%5BJournal%5D)">Role of linker histone in chromatin structure and function: H1 stoichiometry and nucleosome repeat length.</a> Chromosome Res. 14, 17-25 (2006).</li>
<li>Shen, X., Gorovsky, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Linker+histone+H1+regulates+specific+gene+expression+but+not+global+transcription+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Linker histone H1 regulates specific gene expression but not global transcription in vivo.</a> Cell. 86, 475-483 (1996).</li>
<li>Alami, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+linker-histone+subtypes+differentially+affect+gene+expression+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Mammalian linker-histone subtypes differentially affect gene expression in vivo.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 5920-5925 (2003).</li>
<li>Happel, N., Doenecke, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+H1+and+its+isoforms%3A+contribution+to+chromatin+structure+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Histone H1 and its isoforms: contribution to chromatin structure and function.</a> Gene. 431, 1-12 (2009).</li>
<li>Clausell, J., Happel, N., Hale, T. K., Doenecke, D., Beato, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+H1+subtypes+differentially+modulate+chromatin+condensation+without+preventing+ATP-dependent+remodeling+by+SWI%2FSNF+or+NURF%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Histone H1 subtypes differentially modulate chromatin condensation without preventing ATP-dependent remodeling by SWI/SNF or NURF.</a> PLoS One. 4, 0007243-0007243 (2009).</li>
<li>Khadake, J. R., Rao, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA-+chromatin-condensing+properties+of+rat+testes+H1a+and+H1t+compared+to+those+of+rat+liver+H1bdec%3B+H1t+is+a+poor+condenser+of+chromatin%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">DNA- chromatin-condensing properties of rat testes H1a and H1t compared to those of rat liver H1bdec; H1t is a poor condenser of chromatin.</a> Biochemistry. 34, 15792-15801 (1995).</li>
<li>Orrego, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+affinity+of+mammalian+histone+H1+somatic+subtypes+for+DNA+and+chromatin%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biol%22%5BJournal%5D)">Differential affinity of mammalian histone H1 somatic subtypes for DNA and chromatin.</a> BMC Biol. 5, 22-22 (2007).</li>
<li>Th'ng, J. P., Sung, R., Ye, M., Hendzel, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((H1+family+histones+in+the+nucleus.+Control+of+binding+and+localization+by+the+C-terminal+domain%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">H1 family histones in the nucleus. Control of binding and localization by the C-terminal domain.</a> J. Biol. Chem. 280, 27809-27814 (2005).</li>
<li>Wang, Z. F., Sirotkin, A. M., Buchold, G. M., Skoultchi, A. I., Marzluff, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mouse+histone+H1+genes%3A+gene+organization+and+differential+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">The mouse histone H1 genes: gene organization and differential regulation.</a> J. Mol. Biol. 271, 124-138 (1997).</li>
<li>Brown, D. T., Sittman, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+through+overexpression+and+tagging+of+the+variant+type+of+the+mouse+H1e+and+H1c+genes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Identification through overexpression and tagging of the variant type of the mouse H1e and H1c genes.</a> J. Biol. Chem. 268, 713-718 (1993).</li>
<li>Fan, Y., Sirotkin, A., Russell, R. G., Ayala, J., Skoultchi, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Individual+somatic+H1+subtypes+are+dispensable+for+mouse+development+even+in+mice+lacking+the+H1%280%29+replacement+subtype%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Individual somatic H1 subtypes are dispensable for mouse development even in mice lacking the H1(0) replacement subtype.</a> Mol. Cell. Biol. 21, 7933-7943 (2001).</li>
<li>Fan, Y., Skoultchi, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+analysis+of+H1+linker+histone+subtypes+and+their+functions+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Genetic analysis of H1 linker histone subtypes and their functions in mice.</a> Methods Enzymol. 377, 85-107 (2004).</li>
<li>Heid, C. A., Stevens, J., Livak, K. J., Williams, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real+time+quantitative+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Real time quantitative PCR.</a> Genome Res. 6, 986-994 (1996).</li>
</ol>

Non ci sono conflitti di interesse dichiarati.

L&#39;insieme dei saggi qui presentati consentono un&#39;analisi complessiva dei livelli di espressione di mammifero sottotipi istone linker. Adeguatamente progettati RT-PCR test forniscono misurazioni estremamente sensibili e accurate dei messaggi RNA da eventuali geni di mammifero H1. La parte critica della qRT-PCR per linker geni sottotipo istone è la preparazione di cDNA utilizzando primer casuale basato trascrizione inversa. mRNA di geni più istoni, incluse maggior parte dei geni H1, non contengono una lunga coda p...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reattivo </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td></tr><tr><td> RNasi Zap </td><td> Applied Biosystems </td><td> AM9780 </td></tr><tr><td> Reagente Trizol </td><td> Invitrogen </td><td> 15596-018 </td></tr><tr><td> SuperScriptIII </td><td> Invitrogen </td><td> 18080-051 </td></tr><tr><td> Etanolo assoluto </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP2818-4 </td></tr><tr><td> IQ SYBR Green </td><td> Bio-Rad </td><td> 170-8880 </td></tr><tr><td> RNeasy Mini Kit </td><td> Qiagen </td><td> 74104 </td></tr><tr><td> I deossiribonucleasi </td><td> Sigma </td><td> AMP-D1 </td></tr><tr><td> Microseal piastra a 96 pozzetti PCR </td><td> Bio-Rad </td><td> MSP-9605 </td></tr><tr><td> Microseal &#39;B&#39; Sigilli adesivi </td><td> Bio-Rad </td><td> MSB-1001 </td&gt; </tr><tr><td> Saccarosio </td><td> Agros Organics </td><td> AC40594 </td></tr><tr><td> Sodio fosfato bibasico eptaidrato (Na 2 HPO 4 · 7H 2 O) </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP332 </td></tr><tr><td> Cloruro di sodio (NaCl) </td><td> Americano Bioanalytical </td><td> AB01915 </td></tr><tr><td> Eptaidrato sodio fosfato monobasico (NaH 2 PO 4 · 7H2O) </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP-330 </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP310 </td></tr><tr><td> Complete Mini tablet cocktail inibitore di proteasi </td><td> Roche Applied Science </td><td> 11836153001 </td></tr><tr><td> EDTA </td><td> Sigma </td><td> E-5134 </td></tr><tr><td> Phenylmethanesulfonyl fluoruro (PMSF) </td><td> Americano Bioanalytical </td><td> AB01620 </td></tr><tr><td> Nonidet-40 (NP-40) </td&gt; <td> Americano Bioanalytical </td><td> AB01425 </td></tr><tr><td> Cloruro di potassio (KCl) </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP366 </td></tr><tr><td> Tris [amminometano idrossimetil] </td><td> Americano Bioanalytical </td><td> AB02000 </td></tr><tr><td> Magnesio cloruro (MgCl2) </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP214 </td></tr><tr><td> Acido solforico (H2SO4) </td><td> VWR </td><td> VW3648-3 </td></tr><tr><td> Idrossido di ammonio (NH 4 OH) </td><td> Agros Organics </td><td> AC42330 </td></tr><tr><td> Bradford Protein Assay </td><td> Bio-Rad </td><td> 500-0001 </td></tr><tr><td> Acetonitrile </td><td> EMD </td><td> AX0145-1 </td></tr><tr><td> Acido trifluoroacetico (TFA) </td><td> JTBaker </td><td> 9470-01 </td></tr></tbody></table>

analisi di espressione di mammifero linker-istoni sottotipi

Expression Analysis of Mammalian Linker-histone Subtypes

Linker istone H1 si lega alla particella nucleo nucleosoma e il DNA linker, facilitando ripiegamento della cromatina nella struttura di ordine superiore. H1 è essenziale per lo sviluppo dei mammiferi 1 e regola l&#39;espressione genica specifica in vivo 2-4. Tra le proteine ​​altamente conservate istoniche, la famiglia degli istoni linker H1 è il gruppo più eterogeneo. Ci sono 11 sottotipi H1 in mammiferi che sono differenzialmente regolati durante lo sviluppo e in differenti tipi cellulari. Tali sottotipi H1 includono 5 somatica H1S (H1a-e), l&#39;H1 sostituzione 0, 4 sottotipi H1 cellule germinali specifici e H1x 5. La presenza di sottotipi H1 multipli che differiscono nella affinità di legame al DNA e capacità compattazione cromatina 6-9 fornisce un ulteriore livello di modulazione della funzione cromatina. Così, l&#39;analisi quantitativa di espressione dei sottotipi H1 individuali, sia di mRNA e di proteine, è necessario per una migliore comprensione del regolamento dell&#39;istruzione superiorePer la struttura della cromatina e la funzione. Qui si descrive una serie di saggi progettati per analizzare i livelli di espressione di singoli sottotipi H1 (Figura 1). espressione di mRNA di vari geni varianti H1 è misurata da un insieme di altamente sensibili e quantitativa PCR di trascrizione inversa (qRT-PCR) saggi, che sono più veloce, più accurata e richiedono campioni molto meno rispetto al metodo alternativo di analisi Northern blot. A differenza di molti altri messaggi mRNA cellulari, mRNA per geni più istone, compresa la maggior parte dei geni H1, non hanno una lunga coda polyA, ma contengono uno stem-loop struttura alla regione 3 &#39;non tradotta (UTR) 10. Pertanto, cDNA sono preparati da RNA totale mediante trascrizione inversa usando primer casuali invece di oligo-dT primer. Tempo reale PCR con primer specifici per ciascuna sottotipi H1 (Tabella 1) vengono eseguite per ottenere una misurazione altamente quantitativa dei livelli di mRNA di sottotipo H1 individuales. Espressione dei geni costitutivi sono analizzati come controlli per la normalizzazione. L&#39;abbondanza relativa di proteine ​​di ciascun sottotipo H1 e istoni nucleo è ottenuto mediante fase inversa la cromatografia liquida (RP-HPLC) su istoni totale estratto da cellule di mammifero 11-13. Il metodo HPLC eluizione e le condizioni qui descritte dare separazioni ottimali di sottotipi H1 mouse. Per quantificare il profilo HPLC, si calcola la percentuale relativa di sottotipi H1 individuali all&#39;interno famiglia H1, oltre a determinare il rapporto di H1 nucleosoma nelle cellule.

Descriviamo una serie di saggi per analizzare i livelli di espressione di istoni linker H1. mRNA di geni H1 individuali sono quantitativamente misurato casuale trascrizione inversa primer a base seguita da PCR in tempo reale, mentre la quantificazione della proteina istoni H1 è ottenuta mediante analisi HPLC.

Analisi di espressione di mammifero Linker-istoni Sottotipi

L'istone linker H1 si lega alla particella del core nucleosomico e al DNA linker, facilitando il ripiegamento della cromatina in strutture di ordine superiore. H1 è essenziale...

L'obiettivo generale di questa procedura è analizzare i livelli di espressione dei sottotipi della istone H1 attraverso l'analisi sia dei livelli di mRNA di H1 che della misurazione dei livelli proteici di H1. Per effettuare l'analisi dell'mRNA, l'RNA totale viene innanzitutto estratto da cellule in coltura o da tessuto murino. Il secondo passaggio della procedura consiste nell'eseguire una trascrizione inversa dell'RNA totale con primer casuali, seguita da saggi di PCR quantitativa in tempo reale per ciascuno dei geni dei sottotipi di H1. L'analisi della proteina istone H1 inizia con la preparazione di estratti totali di istoni da tessuti murini o da cellule in coltura.Successivamente segue la frazionatura e la quantificazione di ciascun sottotipo di istone H1 e dell'istone centrale H2B mediante analisi di HPLC in fase inversa. Infine, la PCR quantitativa in tempo reale e l'analisi di HPLC in fase inversa mostrano i livelli di espressione sia di mRNA che di proteine, per ciascun sottotipo di H1.Siamo studenti laureati del laboratorio FES della dottoressa Yuhan presso la Scuola di Biologia del Georgia Institute of Technology. Oggi vi mostreremo un insieme di saggi completi per l'an

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L&#39;approccio ChroP Combina ChIP e Spettrometria di Massa a sezionare Locus-specifiche proteomica Paesaggi della cromatina

Questo protocollo descrive un flusso di lavoro completamente integrato per la caratterizzazione di istone modificazioni post-traslazionali utilizzando la spettrometria di massa (MS). Il flusso di lavoro prevede la purificazione istone da colture di cellule o tessuti, istone derivatizzazione e la digestione, analisi MS utilizzando nano-flusso cromatografia liquida e le istruzioni per l'analisi dei dati. Il protocollo è stato progettato per il completamento entro 2 - 3 giorni.

Flusso di lavoro completo per l&#39;analisi dell&#39;istone modificazioni post-traduzionali Utilizzando Bottom-up Spettrometria di Massa: Da istone estrazione all&#39;analisi dei dati

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Presentiamo un metodo efficace e riproducibile per isolare e coltura di cellule progenitrici neurali dal tessuto di cervello embrionale e postnatale per immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) di istone 3 lisina 79 dimethylation (H3K79me2) - un contrassegno dell'istone si trova all'interno del dominio globulare dell'istone 3.

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Gli inibitori dei l'acetiltransferasi dell'istone (HAT, noto anche come lisina acetiltransferasi), come CBP/p300, sono potenziali terapie per il trattamento del cancro. Tuttavia, sono necessari metodi rigorosi per convalidare questi inibitori. Tre metodi in vitro per la convalida includono i saggi HAT con acetiltransferasi ricombinanti, l'immunoblotting per l'acetilazione degli istoni nella coltura cellulare e ChIP-qPCR.

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DNA curtain, una tecnica di imaging ad alto rendimento di una singola molecola, fornisce una piattaforma per la visualizzazione in tempo reale di diverse interazioni proteina-DNA. Il presente protocollo utilizza la tecnica della cortina del DNA per studiare il ruolo biologico e il meccanismo molecolare di Abo1, una ATPasi AAA+ contenente bromodominio pombe di Schizosaccharomyces .

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Scopri come analizzare l'espressione degli istoni linker H1 in mammiferi mediante PCR in tempo reale e cromatografia HPLC. Questo metodo quantifica i livelli di mRNA e proteine per studiare la dinamica della cromatina.

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