Riproducibile nervo sciatico Crush mouse e successiva valutazione da parte della Rigenerazione intera analisi Muscle Monte

L'obiettivo generale di questa procedura è dimostrare un metodo semplice e riproducibile di schiacciamento del nervo sciatico e di analisi in preparato intero della reinnervazione muscolare dopo lo schiacciamento del nervo sciatico. Questo viene ottenuto esponendo innanzitutto il nervo sciatico, includendo un corretto posizionamento dei retrattori chirurgici per garantire un buon accesso al nervo. Successivamente, si schiaccia il nervo con pinze emostatiche e lo si contrassegna con carbone.

Quindi rimuovere i singoli muscoli innervati dal nervo sciatico dall'arto posteriore. L'ultimo passaggio consiste nel dissezionare i singoli muscoli per l'analisi in preparato integrale dopo la colorazione immunoistochimica. In definitiva, i risultati dimostrano che una schiacciatura riproducibile del nervo sciatico può essere eseguita in modo semplice e che i preparati muscolari in toto possono essere utilizzati per analizzare la successiva rigenerazione.

Il principale vantaggio di questo procedimento è che fornisce una tecnica semplice e riproducibile per schiacciare il nervo sciatico e successivamente valutare la rigenerazione assonale. Iniziare questo procedimento anestetizzando il topo per l'intervento chirurgico mediante un cocktail di 100 milligrammi per chilogrammo di chetamina e 10 milligrammi per chilogrammo di xilazina, somministrato per via intraperitoneale al fine di ridurre il dolore postoperatorio. Al topo viene inoltre somministrata un'iniezione sottocutanea di 10 milligrammi per chilogrammo di meloxicam.

Successivamente, rasare con cura entrambe le cosce utilizzando un rasoio chirurgico. Poi applicare una crema depilatoria nasale per un'epilazione completa. Pulire la pelle con un applicatore sterile a punta di cotone e una soluzione antisettica a base di Betadine.

In seguito, applicare un unguento oftalmico agli occhi con un applicatore sterile a punta di cotone. Posizionare il mouse su una piastra in acciaio inox pulita posta sopra una coperta termica pre-riscaldata, e mantenere la temperatura dell'animale a 37 gradi Celsius. Quindi fissare tutti gli arti con del nastro adesivo.

Posizionare con attenzione l'arto posteriore in modo simmetrico, in modo che l'articolazione del ginocchio formi un angolo retto con il corpo. Successivamente, coprire il campo operatorio con un telo sterile sotto il microscopio. Eseguire un'incisione semicircolare lungo la linea mediana.

Staccare delicatamente la pelle dalla muscolatura sottostante e ripiegarla di tanto in tanto. Applicare circa 0,1 millilitri di soluzione salina sterile per mantenere l'area chirurgica umida durante l'intervento. Successivamente, aprire il piano fasciale tra il gluteo massimo e la testa anteriore del bicipite femorale.

Per esporre il nervo sciatico a scopo di controllo chirurgico. Il nervo sciatico controlaterale deve essere esposto e mobilizzato, ma lasciato integro. Successivamente, riposizionare e suturare la muscolatura glutea.

Esponi il nervo sciatico sperimentale nello stesso modo utilizzando dei retrattori. Per facilitare la visualizzazione, liberare delicatamente il nervo sciatico dal tessuto connettivo circostante usando un paio di forbici da iridectomia.

Quindi utilizzare la pinzetta fine 5 45 per posizionare il nervo nella parte inferiore della pinzetta emostatica super fine, allineando le tre fasce lateralmente una accanto all'altra, senza sovrapporle. La pinzetta emostatica è stata incisa con un segno a 1,5 millimetri dalla punta. Posizionare la porzione più esterna del nervo sciatico in corrispondenza di questo segno prima della schiacciatura.

Questo garantisce una schiacciatura di larghezza uniforme e che il nervo non si estenda oltre le ganasce della pinza emostatica quando viene appiattito a causa della forza di schiacciamento. Se il nervo si estende oltre le punte della pinza, il nervo verrà schiacciato solo parzialmente. Utilizzare una seconda coppia di pinze emostatiche precedentemente immerse e cosparse di carbonio in polvere per marcare il sito di schiacciamento.

Schiacciare il nervo nello stesso punto di schiacciamento per 15 secondi con tre clic. Nessun segno di carbonio dovrebbe estendersi oltre il limite dello schiacciamento iniziale. Questo è particolarmente importante se è richiesta una marcatura precisa del punto di schiacciamento, per cui è necessario immergere preventivamente le pinze nel carbonio ed evitare la diffusione del carbonio nel sito chirurgico.

Aprire la pinza nel carbonio in polvere. Quindi chiuderla delicatamente. Utilizzare garza sterile per rimuovere il carbonio presente all'esterno degli emostatici.

Controllare la pinza con un ingrandimento di almeno tre volte per verificare che le superfici di compressione siano uniformemente ricoperte di carbonio in polvere. Se necessario, immergere nuovamente e asciugare ripetutamente. Richiudere i muscoli glutei nello stesso modo del lato controlaterale. Infine, chiudere l'incisione cutanea utilizzando clip riflessi da nove millimetri.

Se si riscontra che le clip riflesse da nove millimetri limitano i movimenti, è possibile utilizzare clip riflesse più piccole o sei suture aut. In alternativa, dopo l'eutanasia del topo, rimuovere quattro muscoli: il tibiale anteriore, l'estensore lungo delle dita, il peroneo lungo e il soleo dell'arto posteriore, fissandoli con puntine attraverso i loro tessuti connettivi a una piastra nera rivestita in Sylgard.

Quindi risciacquarli in PBS. Successivamente, fissarli in paraformaldeide al 4% per 30 minuti. Per dissezionare ciascun muscolo in una piastra di Petri nera rivestita con carta da filtro, rimuovere i tendini utilizzando le forbici da iridectomia.

In seguito, assottigliare i muscoli rimuovendo con cura le fibre muscolari interne. Preservare attentamente la superficie esterna del muscolo, comprese le bande della giunzione neuromuscolare. Quindi montare i muscoli ottenuti su vetrini con vettore schermante e coprioggetti di vetro di 22 per 40 millimetri, sigillando due lati con smalto trasparente. Una volta montati correttamente sul vetrino, le bande della giunzione neuromuscolare devono essere a contatto con i coprioggetti.

Di seguito è riportato un esempio di sito di schiacciamento in situ nell'arto posteriore sinistro. Il sito di schiacciamento è indicato dal carbonio nero. L'asterisco indica un ramo del nervo tibiale che innerva la muscolatura della coscia e rappresenta un utile punto di riferimento.

Durante l'intervento di schiacciamento, la divisione tibiale del nervo sciatico è delineata in blu, la peronea in verde e il srel in giallo. Questa sezione semipiena dimostra uno schiacciamento completo eseguito con pinze emostatiche. Le frecce indicano qui le fibre schiacciate.

Un'azione di schiacciamento incompleta eseguita con pinze angolate è indicata in un'altra sezione semi-finale. Le punte di freccia indicano nuovamente le fibre schiacciate, mentre le frecce indicano gli assoni preservati. Queste sono le immagini rese dai muscoli interi montati.

Dopo la rimozione del tessuto connettivo e un successivo assottigliamento, le bande della piastra motrice sono delineate su ciascun muscolo. Qui è mostrato il muscolo intero in preparazione "sous". 14 giorni dopo la schiacciatura del nervo sciatico.

Le frecce indicano le aree della giunzione neuromuscolare che sono state reinnervate da un assone. Qui è mostrata una giunzione neuromuscolare denervata. I prolungamenti delle cellule di Schwann positive per la GAP-43 sono indicati dalle teste di freccia.

Non si osservano assoni in questa giunzione neuromuscolare denervata. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come schiacciare riproducibilmente un nervo statico e preparare allestimenti muscolari per l'analisi della rigenerazione.