Metodologia Elastografia risonanza magnetica per la valutazione dei Tissue Engineered Construct crescita

Per esaminare costrutti di tessuto ingegnerizzato, i tradizionali test meccanici, che spesso comportano la distruzione del campione, non sono accettabili. Questo metodo utilizza l'elastografia microscopica mediante risonanza magnetica, o micro MRE, come tecnica non invasiva per misurare le proprietà meccaniche di piccoli tessuti molli. Inizialmente, le cellule vengono seminate su un impalcatura di biomateriale per generare il tessuto.

Il tessuto è sospeso in un gel aros e la punta di un attuatore viene inserita nel gel. Successivamente, per caratterizzare il movimento dell'attuatore, questo viene trasferito al campione e rilevato mediante un laser. Doppler viter.

Il campione e l'attuatore vengono trasferiti su un magnete per la risonanza magnetica. Vengono acquisite immagini di elastografia. L'analisi delle immagini risultanti mostra la variazione della rigidità al taglio sia per i costrutti osteogenici che adipogenici.

Abbiamo avuto inizialmente l'idea di questa tecnica osservando la fotografia della ritenzione magnetica per l'uso nella diagnosi delle malattie, rendendoci conto che poteva essere estesa all'ingegneria tissutale. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ad altre tecniche esistenti, come i test meccanici, è che applica la tecnologia non invasiva della risonanza magnetica per valutare le principali proprietà meccaniche dei tessuti. Le applicazioni di questa tecnica si estendono all'ingegneria tissutale poiché la conoscenza delle proprietà meccaniche garantirà l'idoneità del tessuto per gli usi previsti nell'ingegneria ossea e cartilaginea.

Sebbene questi metodi forniscano informazioni preziose nel campo dell'ingegneria tissutale, possono anche essere utilizzati per diagnosticare malattie in diversi organi, come ad esempio la fibrosi epatica, il trauma cranico o il cancro al cervello. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale poiché include passaggi difficili da apprendere e richiede una conoscenza preliminare dell'ingegneria tissutale e dell'imaging mediante ritmo di magnitudo.Gars. Il processo di preparazione del costrutto tissutale comprende tre fasi principali: espansione della popolazione cellulare, semina delle cellule su un impalcatura in materiale biomimetico e differenziazione mediante l'uso di molecole di segnalazione chimica.

Dopo la coltura e l'ampliamento della linea cellulare, seminare le cellule staminali mesenchimali umane o HMC su una spugna di gelatina a una densità di uno per 10 alla sesta cellule per millilitro per la formazione ossea. Circa tre giorni dopo, le cellule dovrebbero apparire confluenti sullo scaffold per indurre la differenziazione. Rimuovere il mezzo e sostituirlo con un mezzo di induzione adipogenica.

Quindi incubare le cellule a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica dopo tre giorni. Sostituire il mezzo con un mezzo di mantenimento, costituito da mezzo di espansione contenente 10 microgrammi per millilitro di insulina ricombinante umana. Dopo un'incubazione di 24 ore, sostituire il mezzo di mantenimento con il mezzo di induzione.

Ripetere questo ciclo per tre volte. Sostituire il mezzo di mantenimento ogni due giorni per quattro settimane al fine di indurre l'osteogenesi. Sostituire con mezzo osteogenico fresco ogni due giorni per tutta la durata dello studio.

Qui lo studio ha una durata di quattro settimane e la MRE viene eseguita ogni settimana. La elastografia mediante risonanza magnetica si basa sulla propagazione di onde di taglio meccaniche per valutare i valori locali delle proprietà meccaniche. Pertanto, queste vibrazioni meccaniche devono essere generate e caratterizzate all'interno del tessuto di interesse mediante un attuatore piezoelettrico. Per preparare il campione, trasferire la coltura tessutale in un tubo di prova di 10 millimetri di diametro contenente una base solida e uno strato di gel allo 0,5% AGROS.

Quindi aggiungere il gel acro caldo 0.5. Per racchiuderlo. Lasciare solidificare il gel di agarosio per cinque minuti.

A temperatura ambiente, inserire la punta del motore piezoelettrico nel piano superficiale del gel. Successivamente, fissare il tubo contenente il campione e l'attuatore a un supporto rigido. Orientare il fascio del barometro laser Doppler verso la punta dell'attuatore meccanico.

Regolare la posizione del sistema per ottimizzare l'intensità del segnale riflesso, che viene visualizzata sul barometro. Per massimizzare la riflessione, utilizzare se necessario del nastro riflettente per configurare l'attuatore in modo da generare onde di taglio innocue con ampiezze significative di circa 250 micron. Impostare il generatore di funzioni per scansionare l'intervallo di frequenze desiderato utilizzando una tensione operativa di 20 volt picco-picco con un segnale di rumore bianco.

Per questo esperimento, la gamma di frequenze desiderata è compresa tra 20 e 2000 hertz. Per visualizzare lo spettro caratterizzato nel programma Polytech Rsof, selezionare la velocità e la visualizzazione FFT. Iniziare l'acquisizione del segnale e identificare la frequenza di risonanza del sistema in base ai picchi dello spettro.

Successivamente, per misurare la deflessione dell'attuatore, impostare l'attuatore per erogare un segnale sinusoidale continuo alla frequenza di risonanza caratterizzata. Utilizzando una tensione operativa di 200 volt picco-picco, indicare lo spostamento generato erogato dall'attuatore alla superficie del gel; impostare la fibra morbida per visualizzare la FFT con lo spostamento sull'asse Y. Una volta che l'attuatore è stato caratterizzato, posizionare il tubo a saggio contenente il campione e l'attuatore in una fessura di una bobina RF da 10 millimetri, quindi posizionare il campione e l'attuatore al centro dello scanner MRI.

Acquisire un'immagine preliminare per identificare la posizione del costrutto. Una volta localizzato il costrutto tessutale, impostare i parametri per l'acquisizione. Una scansione sagittale in vitro tipica avrà un tempo di ripetizione di 1000 millisecondi.

Un tempo d'eco compreso tra 20 e 40 millisecondi, uno spessore della sezione da 0,5 a un millimetro e un campo visivo di 12 per 10 millimetri quadrati, con una dimensione della matrice di 128 per 128 pixel. Per i parametri di elastografia, impostare la frequenza dell'attuatore sul valore determinato dalla caratterizzazione laser Doppler vibrometer. Per questo campione, è necessaria una sola coppia bi con un'ampiezza del gradiente di 50 gauss per centimetro e un ritardo MRE impostato a zero.

Impostare il generatore di funzioni sulla modalità burst e regolare i parametri del generatore in modo che corrispondano ai parametri di acquisizione dell'elastografia, inclusi la frequenza e il numero di cicli. Impostare inoltre il generatore di funzioni in modo che sia attivato esternamente. Per ottenere un'immagine sagittale, impostare la sensibilizzazione al movimento nella direzione positiva della sezione e avviare la scansione seguendo l'acquisizione.

Controllare l'immagine per valutare la qualità del segnale nel costrutto tessutale. Se l'immagine appare troppo scura, regolare i parametri di risonanza magnetica e acquisire una nuova scansione. Successivamente, modificare la sensibilizzazione nella direzione negativa della fetta.

Trasferire i file dallo scanner MRI a un altro computer dotato di MATLAB ed eseguire il programma MATLAB che effettuerà una divisione complessa per la generazione di un'immagine che rappresenti la propagazione delle onde di taglio. Valutare l'immagine per la presenza di onde di taglio e possibili artefatti; è possibile tracciare profili di linea di fase per valutare meglio la qualità e l'ampiezza dell'onda. Se si verifica un ripiegamento (wrapping), ridurre l'ampiezza del gradiente ed eseguire una nuova scansione.

Se non sono necessari aggiustamenti all'immagine. Regolare la dimensione dell'array dei parametri a otto valori equidistanti compresi tra zero secondi e un periodo completo della frequenza di risonanza caratterizzata. Acquisire una scansione sia nelle orientazioni della fetta positiva che negativa una volta acquisite le immagini.

Utilizzare un programma MATLAB progettato per generare i dati dell'onda di taglio e il filmato corrispondente della propagazione dell'onda nel campione. Questo è il file necessario per stimare le proprietà meccaniche. L'ultimo passaggio della MRE consiste nel calcolare la rigidità al taglio a partire dalle immagini dell'onda di taglio.

Iniziare inserendo i dati nel programma MATLAB che valuterà il set di dati tridimensionale, specificando i parametri di imaging, inclusi campo visivo, gradiente, ampiezza e numero di coppie bipolari, ed eseguire il codice. L'algoritmo consente la selezione di regioni di interesse per le quali vengono calcolati la media e la deviazione standard di ciascun parametro. Disegnare i contorni del costrutto tessutale per selezionare la regione di interesse.

Viene visualizzata la media e la deviazione standard della rigidità, del modulo di conservazione e del modulo di perdita all'interno della regione di interesse selezionata. Il programma fornisce inoltre risultati intermedi, tra cui l'onda dopo i filtri, l'onda dopo il filtraggio direzionale e i profili lungo le linee, che aiutano a stimare la fedeltà del recupero. Per una stima accurata, l'onda filtrata deve essere regolare.

La deviazione standard di un parametro in una specifica regione di interesse è anche un indicatore della qualità del calcolo; se necessario, regolare altri parametri per ottenere valori accurati delle proprietà meccaniche al fine di osservare i cambiamenti nelle proprietà meccaniche dei costrutti ingegnerizzati durante il loro sviluppo. Il test MRE è stato applicato nell'arco di un periodo di quattro settimane. Questa mappa di sviluppo dei costrutti mostra costrutti adipogenici, indicati dalla lettera A, e costrutti osteogenici, indicati dalla lettera O, con le corrispondenti immagini di magnitudine, immagini di onde di taglio, ELAs e valori medi di rigidità al taglio visualizzati.

La mappa colori per le ELAs corrisponde allo schema cromatico della barra. Il grafico e le barre di errore rappresentano la deviazione standard all'interno di ciascuna regione di interesse dei costrutti. Nel tempo, i costrutti adipogenici sono diventati meno rigidi, indicando proprietà simili a quelle del tessuto adiposo.

Allo stesso modo, i costrutti osteogenici sono diventati più rigidi nel corso del periodo di quattro settimane, indicando una differenziazione simile a quella ossea. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in circa due ore se svolta correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante caratterizzare completamente l'attuatore seguendo questa procedura. Metodi come l'analisi biochimica e l'istologia possono essere utilizzati per rispondere a domande come la conferma del deposito di minerali.

Ricordare che quando si lavora con materiale cellulare umano e con risonanza magnetica, si può essere esposti a rischi estremamente elevati, ed è fondamentale conoscere le corrette precauzioni di biosicurezza di livello due e quelle relative alla risonanza magnetica. È necessario adottare adeguate misure di sicurezza durante l'esecuzione di queste procedure.