Metodi per lo studio della morfogenesi neuronale:

L'obiettivo generale del seguente esperimento è condurre una valutazione rapida della funzione genica nello sviluppo della corteccia cerebrale utilizzando fette organotipiche. Questo risultato si ottiene introducendo plasmidi, coex, un RNA esprimente e inibitorio e un marcatore GFP nella corteccia cerebrale murina. Vengono applicati brevi impulsi elettrici al cervello, consentendo al DNA plasmidico di trasfettare le cellule progenitrici neuronali.

Successivamente, i cervelli vengono dissecati, inclusi e sezionati per produrre fette organotipiche in grado di subire morfogenesi neuronale ex vivo. Le fette organotipiche possono essere analizzate per identificare sottopopolazioni di neuroni corticali con difetti migratori o morfologici, osservando direttamente le cellule marcate con GFP. Ciao, benvenuti nel mio laboratorio presso la Brown University, nel dipartimento di biologia molecolare. Oggi, la dottoressa Liza e due studentesse, Kat Zer e Mark Seba, illustreranno la tecnica di elettroporazione ex vivo e la coltura di fette organotipiche, una metodica molto utile per lo studio dello sviluppo neurologico.

Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali in diversi aspetti dello sviluppo neurologico, tra cui la neurogenesi, la migrazione neuronale e la morfogenesi neuronale. Poiché l'analisi viene eseguita in una condizione che approssima in modo ravvicinato l'ambiente IBU, rappresenta un'alternativa economica e rapida alla generazione di animali transgenici o knock-out per geni di funzione sconosciuta. Infine, rispetto alla tecnologia di elettroporazione in vivo, il successo di questi esperimenti di elettroporazione ex vivo non dipende da un'abilità chirurgica avanzata, richiede un periodo di formazione più breve e può essere realizzato con minori competenze tecniche.

Dopo l'eutanasia di un topo femmina gravida, dissezionare gli embrioni in HBSS completo freddo su ghiaccio, mantenendoli all'interno delle rispettive sacche placentarie. Successivamente, nella soluzione fredda di HBSS, liberare un embrione dalla sacca e rimuovere la testa dopo la prima vertebra per effettuare un'iniezione; posizionare la testa su un pezzo di carta paraform al di sopra di una piastra di Petri utilizzando una siringa Hamilton appositamente modificata. Iniettare sei-otto microlitri di soluzione di DNA con colorante verde brillante attraverso il terzo ventricolo.

Da lì, la miscela riempirà entrambi i ventricoli laterali nelle vescicole corticali. Per l'elettroporazione, si utilizzano elettrodi a pinzetta in platino BTX. Posizionare l'elettrodo positivo sul lato della corteccia che verrà elettroporato.

Ad esempio, l'elettrodo deve essere posizionato sulla sommità della testa per il cervello dorsale. Per un'alta efficienza di trasfezione, regolare sempre la concentrazione del DNA a un microgrammo per microlitro e utilizzare DNA isolato da una preparazione Maxi. Se necessario, utilizzare un kit privo di endotossine per purificare il DNA dopo l'elettroporazione.

Incubare la testa sul ghiaccio per almeno cinque minuti prima di procedere alla dissezione. È molto importante utilizzare la giusta quantità di impulsi elettrici e corrente durante l'elettroporazione per evitare di danneggiare i cervelli embrionali più giovani. Dopo l'elettroporazione, il tessuto diventa molto fragile.

È importante eseguire le dissezioni con molta attenzione poiché la pelle e il cranio possono esercitare trazione sulle meningi delle vescicole corticali, il che potrebbe danneggiarle durante il loro prelievo dal cranio. Dopo cinque minuti, dissezionare l'encefalo a freddo. HBSS iniziare praticando un piccolo taglio ai lati della testa e staccando la pelle dai lati della testa.

Successivamente, con pinzette fini, staccare delicatamente la pia dal cervello. Rimuovere il cervello integro dal cranio. Al termine, mantenere il cervello in HBSS ghiacciato e prepararsi a includere il tessuto.

Iniziare a riempire gli stampi con Agros al 3% a basso punto di fusione. Posizionare gli stampi sul ghiaccio in modo che l'Agros si solidifichi vicino al fondo dello stampo. Prima di tutto, assicurarsi che i cervelli rimangano sostenuti e centrati.

Ora, con pinzette fini, rimuovere delicatamente un cervello dal HBSS, assorbire il tampone in eccesso con un fazzoletto kim o carta da filtro e posizionare il cervello nell'agarosio a basso punto di fusione. Quindi utilizzare la punta di una pipetta per far ruotare il cervello all'interno dello stampo, massimizzando il contatto tra l'agarosio e il tessuto. Dopo aver trasferito tutti i cervelli, posizionare ciascun cervello in un'orientazione e profondità approssimativamente identica all'interno del proprio stampo.

I bastoncini si solidificheranno in circa cinque minuti. Lavorare quindi rapidamente. Lasciare solidificare completamente i bastoncini incubando per altri cinque minuti sul ghiaccio.

Tagliare l'eccesso di aros prima di montare i blocchi. Quindi attaccare i blocchi di agros l'uno all'altro utilizzando un adesivo plastico a rapida presa, posizionando ogni cervello in una pila con i bulbi olfattivi rivolti verso l'alto. Una volta fissati i blocchi, tagliare gli aros in modo da garantire che ogni cervello venga sezionato dal vibratomo.

Quindi immergerli immediatamente in HBSS ghiacciato. Per sezionare i blocchi, impostare la velocità del vibratome su una velocità bassa, circa la metà del massimo, e impostare la frequenza di vibrazione della lama sul valore più alto. Successivamente, generare sezioni coronali spesse 250 micron, recuperare le sezioni utilizzando una spatola fine piegata e trasferirle nei pozzetti per tessuti con un pennello fine o con pinze.

Se il tessuto cade dagli agaros, il contatto tra tessuto e agaros non si è formato in modo sufficiente in una cappa a flusso laminare; preparare una piastra a sei pozzetti con 1,8 millilitri di mezzo di coltura per fette per pozzetto e posizionare gli inserti organotipici con codice di lisina policlona di laminina in ciascun pozzetto. Aggiungere 500 microlitri di mezzo di coltura per fette sulla parte superiore degli inserti per fette organotipiche. Trasferire quindi fino a cinque fette in ciascun inserto.

Successivamente, rimuovere eventuali eccessi di mezzo dalla superficie delle sezioni per garantire che le sezioni mantengano la loro morfologia il più possibile e presentino un minimo di morte cellulare. È importante mantenere un'interfaccia aria-liquido sana e fare in modo che le sezioni non galleggino nel mezzo. Infine, incubare le sezioni a 37 gradi Celsius in un incubatore umidificato.

Sostituire ogni due giorni metà del volume di mezzo sotto la membrana. Le sezioni non devono galleggiare sul mezzo; i neuroni che esprimono costrutti elettroporati possono essere visualizzati già otto ore dopo l'elettroporazione, a seconda dei giorni desiderati di coltura. Fissare le sezioni sulla membrana per l'analisi.

Lavare ogni inserto organico tipico con PBS tiepido per cinque minuti. Eseguire un totale di tre lavaggi con PBS, quindi fissare il tessuto con paraformaldeide al 4% per un'ora a quattro gradi Celsius. Dopo la fissazione, i tessuti possono essere analizzati con marcatori cellulari o semplicemente colorati con la colorazione di hooks. Dopo un'ora, lavare le sezioni con tre lavaggi di 10 minuti ciascuno in 1x PBS.

Quindi permeabilizzare le sezioni per due ore a temperatura ambiente in una soluzione di siero di capra al 10% in 1x PBS con agitazione delicata. Successivamente, incubare i tessuti con gli anticorpi primari per un'ora a temperatura ambiente con agitazione delicata. Rimuovere l'anticorpo mediante tre lavaggi di 10 minuti ciascuno in 1x PBS con agitazione delicata, in attesa.

Posizionare i vetrini opachi in una camera d'acqua abbastanza profonda da immergere i tessuti dopo che sono stati posizionati sui vetrini. Per montare le sezioni, tagliare innanzitutto la membrana con un bisturi.

In secondo luogo, utilizzando pinzette fini, trasferire fino a cinque sezioni legate alla membrana su ciascun vetrino immerso in acqua. In terzo luogo, rimuovere l'acqua in eccesso da ciascun vetrino. In quarto luogo, applicare una goccia di soluzione per montaggio permanente su ciascuna sezione cerebrale.

Infine, posizionare delicatamente un coprioggetto sopra le sezioni e rimuovere eventuali bolle d'aria. Le sezioni sono quindi pronte per l'analisi al microscopio, a seconda della quantità di DNA elettroporato e dello stadio embrionale. Durante l'elettroporazione, si è osservata una variabilità nell'efficienza di trasfezione.

Otto ore dopo la trasfezione con un silenziatore P, le cellule vettore GFP hanno iniziato a esprimere GFP. Durante un periodo di coltura più lungo, le cellule attraversano una sequenza normale di eventi neurogenici, inclusi proliferazione, migrazione e differenziamento neuronale precoce. Queste sezioni hanno mantenuto la loro morfologia per cinque giorni, a condizione che l'interfaccia aria-mezzo fosse ben mantenuta durante l'esecuzione di questa procedura.

È importante eseguire l'intero esperimento, dal momento in cui l'animale viene soppresso fino al momento in cui le sezioni vengono posizionate negli inserti di membrana, entro due ore, al fine di minimizzare la morte cellulare successiva a questa procedura. È possibile effettuare altre aggiunte di fattori esogeni alla lisi organotipica per rispondere a domande come: qual è il ruolo di diversi fattori di crescita o agenti farmacologici nei vari meccanismi di neurosviluppo?