Metodi per lo studio della morfogenesi neuronale: Ex vivo Elettroporazione RNAi in Embryonic Cerebral Cortex Murine

L'obiettivo generale del seguente esperimento è quello di condurre una rapida valutazione della funzione genica nello sviluppo della corteccia cerebrale utilizzando fette organotipiche. Ciò si ottiene introducendo plasmidi, coex, RNA esprimenti e inibitori e un marcatore GFP nella corteccia cerebrale murn. Brevi esplosioni elettriche vengono applicate al cervello, consentendo al DNA plasmidico di trasfettare le cellule progenitrici neuronali.

Successivamente, i cervelli vengono sezionati, incorporati e sezionati per produrre fette organotipiche che possono subire morfogenesi neuronale ex vivo. Le fette organotipiche possono essere ricercate alla ricerca di sottopopolazioni di neuroni corticali con difetti migratori o morfologici osservando direttamente le cellule marcate con GFP. Ciao, benvenuti nel mio laboratorio alla Brown University nel dipartimento di biologia molecolare oggi, la dottoressa Liza e due studenti, Kat Zer e Mark Seba, dimostreranno la tecnica di elettroporazione ex vivo e la coltura di fette organotipiche, che è una tecnica molto utile per gli studi sullo sviluppo neurologico.

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave in vari aspetti del neurosviluppo, tra cui la neurogenesi, la migrazione neuronale e la morfogenesi neuronale. Poiché questa analisi viene eseguita in una quasi approssimazione dell'ambiente IBU, fornisce un'alternativa rapida e a basso costo alla generazione di animali transgenici o knockout per geni di funzione sconosciuta. Infine, rispetto alla tecnologia elettrochirurgica in vivo, il successo di questi esperimenti elettrooperativi in vivo non dipende da una chirurgia competente, dallo sviluppo delle abilità e può essere eseguito con un tempo di formazione e un'abilità più brevi.

Dopo l'eutanasia di una femmina di topo incinta, sezionare gli embrioni in HBSS ghiacciato e completo, tenendoli nei loro sacchi placentari individuali. Successivamente, nella soluzione fredda di HBSS, rilasciare un embrione dal sacco e tagliargli la testa dopo la prima vertebra per un'iniezione, posizionare la testa su un pezzo di carta paraforma sopra una capsula di Petri utilizzando una siringa di Hamilton fatta su misura. Iniettare da sei a otto microlitri di miscela verde veloce di DNA attraverso il terzo ventricolo.

Da lì, la miscela riempirà entrambi i ventricoli laterali nelle vescicole corticali. Per l'elettroporazione vengono utilizzati elettrodi di platino pinzette BTX. Posizionare l'elettrodo positivo verso il lato della corteccia che verrà elettroporizzato.

Ad esempio, l'elettrodo dovrebbe essere sulla parte superiore della testa Per la corteccia dorsale. Per un'elevata efficienza di trasfezione, regolare sempre la concentrazione di DNA a un microgrammo per microlitro e utilizzare DNA isolato da un preparato Maxi. Se necessario, utilizzare un kit privo di endotossine per purificare il DNA Dopo l'elettroporazione.

Incubare la testa sul ghiaccio per almeno cinque minuti prima di sezionarla. È molto importante utilizzare la giusta quantità di impulsi elettrici e corrente quando si esegue l'elettroporazione per evitare di danneggiare i cervelli embrionali più giovani. Dopo l'elettroporazione, il tessuto diventa molto fragile.

È importante eseguire le dissezioni con molta attenzione poiché la pelle e la scuola possono tirare le meningi delle vescicole corticali e questo potrebbe danneggiare le vescicole corticali quando vengono rimosse dal cranio. Dopo cinque minuti, sezionare il cervello a freddo. L'HBSS inizia praticando una piccola incisione sul lato della testa e staccando la pelle dai lati della testa.

Quindi, con una pinza fine, staccare delicatamente la pia dal cervello. Rimuovere il cervello intatto dal cranio. Al termine, mantieni il cervello in HBSS ghiacciato e preparati a incorporare il tessuto.

Iniziare a riempire gli stampini con il 3% di punto di fusione basso. Agros. Metti gli stampini sul ghiaccio in modo che gli agro si solidifichino vicino al fondo dello stampo. In primo luogo, assicurarsi che il cervello rimanga supportato e centrato.

Ora con una pinza fine, rimuovere delicatamente un cervello dall'HBSS, assorbire il tampone in eccesso con una salvietta kim o carta da filtro e impostare il cervello nel punto di fusione basso. Agros. Quindi utilizzare la punta di una pipetta per far roteare il cervello all'interno dello stampo per massimizzare il contatto tra gli agrofarmaci e i tessuti. Con tutti i cervelli trasferiti, posiziona ogni cervello approssimativamente con lo stesso orientamento e profondità all'interno del suo stampo.

Gli aros si solidificheranno in circa cinque minuti. Quindi lavora velocemente. Lasciare che gli aro si solidifichino completamente incubando altri cinque minuti sul ghiaccio.

Tagliare gli aros in eccesso prima di montare i blocchi. Quindi attacca i blocchi agros l'uno all'altro usando un adesivo plastico a fissaggio rapido, ogni cervello in una pila dovrebbe essere posizionato con i suoi bulbi olfattivi verso l'alto. Una volta attaccati i blocchi, taglia gli aros per assicurarti che ogni cervello venga tagliato dal vibrato.

Quindi immergerli immediatamente in HBSS ghiacciato. Per affettare i blocchi, impostare la velocità del vibrato su una velocità bassa, circa la metà del massimo, e impostare la frequenza di vibrazione della lama al massimo. Quindi generare fette coronali spesse 250 micron, recuperare le fette utilizzando una spatola fine piegata e trasferirle nei pozzetti dei tessuti con un pennello sottile o una pinza.

Se il tessuto cade dall'agros, il contatto con l'agros tissutale non è stato sufficientemente formato in una cappa di coltura tissutale, preparare una piastra a sei pozzetti con 1,8 millilitri di terreno di coltura a fette per pozzetto e posizionare inserti organotipici codice di lisina politica lamininica in ciascuna. Aggiungere 500 microlitri di terreno di coltura per fette alla parte superiore degli inserti organotipici per fette. Quindi trasferire fino a cinque fette su ciascun inserto.

Quindi, rimuovere il terreno in eccesso dalla parte superiore delle fette Per garantire che le fette conservino il più possibile la loro morfologia e abbiano una morte cellulare minima. È importante che venga mantenuta un'interfaccia sana tra aria liquida e che le fette non galleggino nel mezzo. Infine, incubare le fette a 37 gradi Celsius in un'incubatrice umidificata.

Sostituire metà del volume del terreno sotto la membrana a giorni alterni. Le fette non devono galleggiare sui media, i neuroni che esprimono costrutti elettroporati possono essere visualizzati già otto ore dopo l'elettroporazione, dopo i giorni desiderati di coltivazione. Fissare le fette nella membrana per l'analisi.

Lavare ogni inserto tipico organico con PBS caldo per cinque minuti. Eseguire tre lavaggi PBS in totale, quindi fissare il tessuto con aldeide paraforme al 4% per un'ora a quattro gradi Celsius. Dopo la fissazione, i tessuti possono essere analizzati con marcatori cellulari o semplicemente colorati con una macchia a uncino Dopo un'ora, lavare le fette con tre lavaggi di 10 minuti in un XPBS.

Quindi permeare le fette per due ore a temperatura ambiente in una soluzione di siero di capra al 10% in un XPBS con agitazione delicata. Quindi colorare i fazzoletti con ganci per un'ora a temperatura ambiente agitando delicatamente. Rimuovere la macchia con tre lavaggi di 10 minuti in un XPBS con una leggera agitazione durante l'attesa.

Posiziona i vetrini in vetro smerigliato in una camera d'acqua abbastanza profonda da bagnare i fazzoletti dopo che sono stati posizionati sui vetrini. Per montare le fette. Per prima cosa, taglia la membrana con un bisturi.

In secondo luogo, utilizzando una pinza fine, trasferire fino a cinque fette legate alla membrana su ciascun vetrino immerso in acqua. Terzo, rimuovi l'acqua in eccesso da ogni scivolo. In quarto luogo, applicare una goccia di soluzione per montaggio a pavimento su ciascuna fetta di cervello.

Infine, posiziona delicatamente un vetrino coprioggetti sopra le fette e rimuovi eventuali bolle d'aria. Le fette sono quindi pronte per la microscopia a seconda della quantità di DNA elettroporata e dello stadio embrionale. All'elettroporazione, l'efficienza di trasfezione è risultata variare.

Otto ore dopo la trasfezione con un silenziatore P, le cellule vettoriali GFP hanno iniziato ad esprimere GFP. Durante un periodo di coltura più lungo, le cellule subiscono una normale sequenza di eventi neurogeni tra cui la proliferazione, la migrazione e la differenziazione neuronale precoce. Queste fette hanno mantenuto la loro morfologia per cinque giorni, a condizione che l'interfaccia dell'aria del supporto fosse ben mantenuta durante il tentativo di questa procedura.

È importante condurre l'intero esperimento dal momento in cui l'animale viene soppresso al momento in cui le fette vengono posizionate negli inserti della membrana in meno di due ore per ridurre al minimo la morte cellulare dopo questa procedura. Altri fattori esogeni possono essere eseguiti per rispondere a domande come: qual è il ruolo dei diversi fattori di crescita o agenti farmacologici nei vari meccanismi di sviluppo neurologico?