Name: Espansione linfociti T citotossici da sangue del cordone ombelicale che Target Citomegalovirus, virus di Epstein-Barr virus, e Adenovirus (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-05-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 18 s
Description: Scopri come generare linfociti T citotossici specifici per virus da sangue del cordone ombelicale. Questo metodo GMP-compliant produce CTL multi-virus per applicazioni cliniche in immunoterapia antivirale.

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Questo lavoro è stato sostenuto da un L. Dan Duncan collaborativa assegno di ricerca (CMB e EJS), il National Heart, Lung, and Blood Institute (US4HL081007), un Leukemia and Lymphoma Society Clinical Research Scholar premio (CMB), e il National Cancer Institute (RO1 CA06150816; EJS).

1. Cella di isolamento mononucleare (giorno 0) <ol><li> Inserire spike di luer femmina nella porta di uscita della frazione 20% della unità di sangue cordonale, collegare la siringa e rimuovere il sangue. Trasferimento sangue scongelati a 20 ml di RPMI riscaldato in tubo da 50 ml per centrifuga. Risciacquare sangue borsa dei cavi con 5 ml di RPMI e trasferire al tubo da centrifuga stessa. </li><li> Centrifugare le cellule per 10 minuti a 400 x g. Aspirare il surnatante. </li><li> Risospendere le cellule in 20 ml di RPMI caldo. Cellule strato su 15 ml di Lymphoprep in tubo da 50 ml per centrifuga. Centrifugare 40 minuti a 400 x g. </li><li> Raccogliere l&#39;interfaccia contenente le cellule mononucleari e lavare in 20 ml di RPMI. Centrifugare per 10 minuti a 450 x g. </li><li> Aspirare il surnatante e lavare in 20 ml di RPMI. Contare le celle e girare per 5 minuti a 400 x g. </li><li> Aspirare il surnatante e risospendere le cellule a 5 x 10 6 cellule mononucleate / mL di Cellgenix DC media (privo di siero). Togliere 1 mL per EBV-LCL generazione e mettere in 15 mL centrifuge tubo. </li></ol> 2. Cellule dendritiche Generation (a partire dal giorno 0) <ol><li> Piastra 2 ml di cellule (sono già a 5 x 10 6 cellule / ml di DC media) per pozzetto in una piastra da 6 pozzetti. Lasciare in incubatore per 1-2 ore. </li><li> Dopo 1-2 ore, lavare le cellule non aderenti mediante lavaggio 3-4 volte con PBS. Raccogliere le cellule non aderenti e congelare. Aggiungere 2 mL / pozzetto di supporti contenenti CC 1000 U / ml di IL-4 e 800 U / ml di GM-CSF. </li><li> 3-4 giorni dopo DC iniziazione, rifornire di IL-4 e GM-CSF aggiungendo 100 pl / pozzetto di supporti contenenti una concentrazione finale di 1000U/mL IL-4 e 800 U / ml di GM-CSF. </li><li> Il giorno 5-6, raccolto la DC raschiando il bene con una pipetta di trasferimento. Contare le cellule grandi e centrifugare per 5 minuti a 400 x g. Aspirare media e risospendere CC a 2x10 6 cellule / ml di DC media. Aggiungere 0,5 ml / pozzetto di una piastra a 24 pozzetti. </li><li> Trasdurre la DC con il Ad5f35pp65 vettore in una cella per MOI di 10 unità infettive. Aggiungi vector a ciascun pozzetto in una piastra da 24 pozzetti. Incubare le cellule per 1,5 ore. Dopo 1,5 ore, aggiungere 1,5 mL / pozzetto di DC supporto contenente: 1000 U / ml di IL-4, 800 U / ml di GM-CSF, 10 ng / mL TNF-alfa, 1 pg / mL PGE-1, 100 ng / mL IL-6, e 10 ng / ml di IL-1beta. Queste citochine maturare i controller di dominio. </li></ol> 3. Generazione di EBV-LCL (a partire dal giorno 0) <ol><li> Centrifugare la provetta contenente le x 5 10 6 cellule mononucleate. Aggiungere 200 ml di concentrato EBV B95.8 surnatante e 1,8 ml di mezzo completo (RPMI + 10% FBS + 2 mM L-glutammina) contenente ciclosporina (1 pg / mL). </li><li> Aliquotare 100 ml di cellule in 10 pozzetti di una piastra a 96 pozzetti e 200 pl in 5 pozzetti. Aggiungere 100 ml di mezzi completi ciclosporina + ai pozzetti contenenti solo 100 ml di cellule. Riempire i pozzetti rimanenti con acqua sterile. </li><li> Alimentare il settimanale LCL ed espandere da una piastra a 96 pozzetti a un 24-pozzetti dopo ~ 2 settimane. Dopo un&#39;altra settimana, trasferire in un matraccio T25 ed il trasferimento settimana successivauna beuta T75. In questa fase si consiglia di congelare aliquote di LCL. Si richiede in genere 1 mese a generare un numero sufficiente di LCL. </li></ol> 4. CTL Initiation - 7 giorni dopo l&#39;inizio delle DC <ol><li> DC Harvest e irradiano a 30 Gy. Lavare 4 x e il conteggio. Risospendere DC in mezzi cellule T contenenti siero umano (45% RPMI, 45% CLICK, il 10% di siero umano, 2 mM L-glutammina) @ 1 x 10 5 cellule dendritiche / mL. </li><li> Scongelare le cellule non aderenti a partire dal punto 2.2. Lavare le cellule, e contare. Risospendere a 2 x 10 6 cellule non aderenti / ml in mezzi cellule T contenenti siero umano. Aggiungere 10 ng / ml di IL-7 e IL-12, e 5 ng / ml di IL-15. Aggiungere 1 ml di cellule per pozzetto in una piastra da 24 pozzetti. Aggiungere 1 ml di DC per pozzetto. Riempire i pozzetti vuoti di 24 pozzetti con acqua sterile. </li><li> 7 giorni dopo l&#39;inizio delle cellule T, mangimi e / o dividere le celle con i media delle cellule T contenenti siero umano. </li><li> 9-12 giorni dopo l&#39;inizio delle cellule T, congelare le cellule T fino a quando il LCL sono pronti. </li><li> Once LCL si sono ampliati e sono diversi passaggi in fiasche T75, trasdurre l&#39;LCL mediante centrifugazione per 5 minuti a 400 x g. Aggiungere il vettore al pellet cellulare ad una MOI di 100 unità infettive per cellula. Incubare per 1,5 ore. Dopo 1,5 ore, risospendere in mezzi completi a 5 x 10 5 LCL / ml e aggiungere 2 ml per pozzetto in una piastra a 24 pozzetti 12. </li><li> Dopo 2 giorni, raccogliere il LCL e irradiano a 40 Gy. Lavare 4 x e il conteggio. Risospendere il LCL in mezzi cellule T contenenti siero umano a 2,5 x 10 5 cellule / ml. Aggiungere 1 ml di LCL per pozzetto di una piastra a 24 pozzetti. Inoltre, aggiungere 5 x 10 6 LCL ad un dispositivo di coltura Grex40 e 5 ng / ml di IL-15. 13 </li><li> Raccogliere le cellule T. Centrifugare per 5 minuti a 400 xg, aspirare il surnatante, risospendere in mezzi e cellule T contenenti siero umano a 1 x 10 6 cellule T / mL. Aggiungere 5 ng / ml di IL-15 e di aggiungere 1 ml / pozzetto di cellule T (totale di 1 x 10 6 cellule T) al LCL che sono già in 24-pozzetti. Nel Grex40, portareil volume totale del supporto fino a 30 mL. </li><li> Il giorno 3-4 post-stimolazione, se le cellule confluenti sono poi divisi (nel piatto) 1:1 e aggiungere mezzo fresco contenente 50 U / ml IL-2. Se non sono confluenti poi semplicemente aspirare ½ media e sostituirlo con supporti contenenti 50 U / mL di IL-2. Nel Grex40, aspirare la metà dei mezzi di comunicazione, sostituire con mezzi freschi, e aggiungere 50 U / mL di IL-2. </li><li> Il giorno 7, ripetere come nel passo 4,6 ma utilizzare IL-2 nel giorno della stimolazione non, IL-15. </li></ol> 5. Risultati rappresentativi Uno schema del GMP approvato dalla FDA protocollo di fabbricazione è rappresentato in figura 1. Il processo dura circa 50 giorni. Metodi tipici di generazione di virus-specifiche cellule T espandere preesistenti cellule T di memoria, tuttavia, il sangue del cordone non ha virus esperti cellule T, e quindi abbiamo bisogno di prime ingenuo T cellule ex vivo. Per fare ciò, usiamo cellule dendritiche e le citochine IL-7, IL-12 e IL-15,necessaria per generare specificità virale. Dopo 3 stimolazioni, il rendimento deve essere superiore a 100x10 6 celle. Se le cellule non siano disponibili sufficienti, stimolazioni supplementari possono essere eseguite fino a quando il numero desiderato di CTL sono disponibili. La maggior parte di queste cellule dovrebbe essere CD3 + con una miscela di CD4 + e CD8 + T cellule. Ci dovrebbe essere inferiore a 15% delle cellule NK (CD3-/CD56 +) e meno di 1% di cellule B CD19 + (Figura 2). Il CTL estesa dovrebbe riconoscere l&#39;antigene pp65 da CMV, hexon e Penton da adenovirus, nonché numerosi antigeni EBV che sono espressi sulla EBV-LCL. Quando la prova è in un saggio ELISPOT, CTL dovrebbe secernere più IFN-? in risposta a questi antigeni di antigeni irrilevanti (Figura 3). Il CTL dovrebbe anche lisare virali peptide-pulsati tali obiettivi blasti PHA. In un saggio di rilascio Cr 51, CTL dovrebbe lisare LCL, CMVpp65-pulsato e Adenovirus esone-e /o Penton-pulsato obiettivi, ma non obiettivi pulsate con peptidi irrilevanti (Figura 4). <img src="/files/ftp_upload/3627/3627fig1.jpg" alt="Figura 1."/> Figura 1. Generazione di multi-virus CTL specifici dal cordone ombelicale. Schematico che mostra l&#39;intero processo di fabbricazione CTL da cordone ombelicale. Prima le cellule mononucleate del sangue del cordone sono isolati dalla frazione 20% della frazionato unità di sangue del cordone ombelicale. Con l&#39;eccezione di 5x10 6 cellule salvate per generazione LCL, tutte le cellule vengono quindi piastrate in mezzi cellule dendritiche per 1-2 ore, a questo punto le cellule non aderenti sono raccolte e congelate. La DC vengono poi alimentati DC supporti contenenti IL-4 e GM-CSF. Dopo 5 giorni di coltura, la DC sono maturato e trasdotte con un vettore adenovirale contenente l&#39;antigene immunodominante CMV pp65. All&#39;iniziazione DC questi sono combinati con le cellule non aderenti e le citochine IL-7, IL-12,e IL-15. A stimolazioni successive, lo stesso vettore adenovirale viene utilizzato per trasdurre EBV-LCL, che sono utilizzati come le cellule presentanti l&#39;antigene. IL-15 viene utilizzato al secondo stimolazione e IL-2 in seguito. <img src="/files/ftp_upload/3627/3627fig2.jpg" alt="Figura 2."/> Figura 2. Fenotipo delle cellule T risultante. Mostrata è la percentuale di cellule vive inclusi nel gate linfocitario. CTL sono CD3 + e CD4 + e CD8 +, ma in gran parte CD3-/CD56- e CD19-. <img src="/files/ftp_upload/3627/3627fig3.jpg" alt="Figura 3."/> Figura 3. Funzionalità delle cellule T. Specificità delle cellule T è stato testato da IFN-γELISPOT. Le cellule T sono state pulsate con peptidi sovrapposti copre l&#39;intera proteina di hexon, Penton, pp65, e l&#39;antigene irrilevante IE-1. CTL da solo indica un mezzo solo. Autologo LCL sono stati irradiati e ha aggiunto a 1x10 5 / bene. Viene mostrato il punto medio di formazione delle cellule cim porto di pozzetti in triplicato. <img src="/files/ftp_upload/3627/3627fig4.jpg" alt="Figura 4."/> Figura 4. Attività citolitica dei CTL. La capacità del CTL risultante per lisare bersagli esprimenti antigeni virali è stato testato in un saggio di 51 Cr. 51 Cr-etichettati blasti autologhe PHA sono state pulsate con peptidi sovrapposti copre l&#39;intera o antigene marcato con 51 Cr LCL autologhe sono stati co-coltivate con CTL. Dopo 4 ore, gamma di rilascio è stato contato in un contatore gamma.

<ol><li>Kennedy-Nasser, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparable+outcome+of+alternative+donor+and+matched+sibling+donor+hematopoietic+stem+cell+transplant+for+children+with+acute+lymphoblastic+leukemia+in+first+or+second+remission+using+alemtuzumab+in+a+myeloablative+conditioning+regimen%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Blood+Marrow+Transplant%22%5BJournal%5D)">Comparable outcome of alternative donor and matched sibling donor hematopoietic stem cell transplant for children with acute lymphoblastic leukemia in first or second remission using alemtuzumab in a myeloablative conditioning regimen.</a> Biol. Blood Marrow Transplant. 14, 1245-1245 (2008).</li>
<li>Hanley, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+clinical+outcomes+using+adoptively+transferred+immune+cells+from+umbilical+cord+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Improving clinical outcomes using adoptively transferred immune cells from umbilical cord blood.</a> Cytotherapy. 12, 713(2010).</li>
<li>Szabolcs, P., Cairo, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unrelated+umbilical+cord+blood+transplantation+and+immune+reconstitution%5BTitle%5D)+AND+%22Semin.+Hematol%22%5BJournal%5D)">Unrelated umbilical cord blood transplantation and immune reconstitution.</a> Semin. Hematol. 47, 22(2010).</li>
<li>Canto, E., Rodriguez-Sanchez, J. L., Vidal, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinctive+response+of+naive+lymphocytes+from+cord+blood+to+primary+activation+via+TCR%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Leukoc.+Biol%22%5BJournal%5D)">Distinctive response of naive lymphocytes from cord blood to primary activation via TCR.</a> J. Leukoc. Biol. 74, 998-998 (2003).</li>
<li>Leen, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monoculture-derived+T+lymphocytes+specific+for+multiple+viruses+expand+and+produce+clinically+relevant+effects+in+immunocompromised+individuals%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Monoculture-derived T lymphocytes specific for multiple viruses expand and produce clinically relevant effects in immunocompromised individuals.</a> Nat. Med. 12, 1160-1160 (2006).</li>
<li>Riddell, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Restoration+of+viral+immunity+in+immunodeficient+humans+by+the+adoptive+transfer+of+T+cell+clones%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Restoration of viral immunity in immunodeficient humans by the adoptive transfer of T cell clones.</a> Science. 257, 238(1992).</li>
<li>O'Reilly, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adoptive+transfer+of+antigen-specific+T-cells+of+donor+type+for+immunotherapy+of+viral+infections+following+allogeneic+hematopoietic+cell+transplants%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol.+Res%22%5BJournal%5D)">Adoptive transfer of antigen-specific T-cells of donor type for immunotherapy of viral infections following allogeneic hematopoietic cell transplants.</a> Immunol. Res. 38, 237-237 (2007).</li>
<li>Peggs, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adoptive+cellular+therapy+for+early+cytomegalovirus+infection+after+allogeneic+stem-cell+transplantation+with+virus-specific+T-cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Adoptive cellular therapy for early cytomegalovirus infection after allogeneic stem-cell transplantation with virus-specific T-cell lines.</a> Lancet. 362, 1375-1375 (2003).</li>
<li>Sili, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+expansion+of+dendritic+cell-primed+polyclonal+human+cytotoxic+T-lymphocyte+lines+using+lymphoblastoid+cell+lines+for+adoptive+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunother%22%5BJournal%5D)">Large-scale expansion of dendritic cell-primed polyclonal human cytotoxic T-lymphocyte lines using lymphoblastoid cell lines for adoptive immunotherapy.</a> J. Immunother. 26, 241(2003).</li>
<li>Bollard, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Good+manufacturing+practice-grade+cytotoxic+T+lymphocytes+specific+for+latent+membrane+proteins+%28LMP%29-1+and+LMP2+for+patients+with+Epstein-Barr+virus-associated+lymphoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Good manufacturing practice-grade cytotoxic T lymphocytes specific for latent membrane proteins (LMP)-1 and LMP2 for patients with Epstein-Barr virus-associated lymphoma.</a> Cytotherapy. 13, 518(2011).</li>
<li>Hanley, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functionally+active+virus-specific+T+cells+that+target+CMV%2C+adenovirus%2C+and+EBV+can+be+expanded+from+naive+T-cell+populations+in+cord+blood+and+will+target+a+range+of+viral+epitopes%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Functionally active virus-specific T cells that target CMV, adenovirus, and EBV can be expanded from naive T-cell populations in cord blood and will target a range of viral epitopes.</a> Blood. 114, 1958(1958).</li>
<li>Hanley, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expansion+of+T+cells+targeting+multiple+antigens+of+cytomegalovirus%2C+Epstein-Barr+virus+and+adenovirus+to+provide+broad+antiviral+specificity+after+stem+cell+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Expansion of T cells targeting multiple antigens of cytomegalovirus, Epstein-Barr virus and adenovirus to provide broad antiviral specificity after stem cell transplantation.</a> Cytotherapy. , (2011).</li>
<li>Gerdemann, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+Multivirus-specific+T+Cells+to+Prevent%2Ftreat+Viral+Infections+after+Allogeneic+Hematopoietic+Stem+Cell+Transplant%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Generation of Multivirus-specific T Cells to Prevent/treat Viral Infections after Allogeneic Hematopoietic Stem Cell Transplant.</a> J. Vis. Exp. (51), e2736(2011).</li>
<li>Mori, T., Kato, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytomegalovirus+infection%2Fdisease+after+hematopoietic+stem+cell+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Hematol%22%5BJournal%5D)">Cytomegalovirus infection/disease after hematopoietic stem cell transplantation.</a> Int. J. Hematol. 91, 588(2010).</li>
<li>Einsele, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infusion+of+cytomegalovirus+%28CMV%29-specific+T+cells+for+the+treatment+of+CMV+infection+not+responding+to+antiviral+chemotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Infusion of cytomegalovirus (CMV)-specific T cells for the treatment of CMV infection not responding to antiviral chemotherapy.</a> Blood. 99, 3916(2002).</li>
<li>Bao, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expansion+of+cytomegalovirus+pp65+and+IE-1+specific+cytotoxic+T+lymphocytes+for+cytomegalovirus-specific+immunotherapy+following+allogeneic+stem+cell+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Blood+Marrow+Transplant%22%5BJournal%5D)">Expansion of cytomegalovirus pp65 and IE-1 specific cytotoxic T lymphocytes for cytomegalovirus-specific immunotherapy following allogeneic stem cell transplantation.</a> Biol. Blood Marrow Transplant. 14, 1156(2008).</li>
<li>Shpall, E. J., Bollard, C. M., Brunstein, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+cord+blood+transplant+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Blood+Marrow+Transplant%22%5BJournal%5D)">Novel cord blood transplant therapies.</a> Biol. Blood Marrow Transplant. 17, Suppl 1. S39-S45 (2011).</li>
<li>Vera, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accelerated+production+of+antigen-specific+T+cells+for+preclinical+and+clinical+applications+using+gas-permeable+rapid+expansion+cultureware+%28G-Rex%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunother%22%5BJournal%5D)">Accelerated production of antigen-specific T cells for preclinical and clinical applications using gas-permeable rapid expansion cultureware (G-Rex.</a> J. Immunother. 33, 305(2010).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

<html> Attuali strategie volte a controllare le infezioni virali dopo CBT può essere efficace, ma sono associati a tossicità significative, sono costosi, e non conferiscono protezione a lungo termine contro l&#39;infezione in seguito. In effetti, l&#39;uso di alcuni farmaci antivirali possono limitare l&#39;espansione del virus-specifiche cellule T che altrimenti sarebbero protettivo. 14 Un&#39;altra opzione è l&#39;infusione di donatore-derivati ​​virus-cellule T specifiche. Noi e altri hanno dimostrato che t...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td></tr><tr><td> RPMI 1640 </td><td> Invitrogen </td><td> 21870-076 </td></tr><tr><td> DC supporti </td><td> CellGenix </td><td> 20801-0500 </td></tr><tr><td> EHAA (Medium Click di) </td><td> Irvine Scientific </td><td> 9195 </td></tr><tr><td> Siero umano </td><td> Gemini Bio Prodotti </td><td> 100-110 </td></tr><tr><td> Gas Permeabile Cultureware 18 </td><td> Wilson-Wolf </td><td> 80040S </td></tr><tr><td> IL-2 </td><td> Chirone (TCH Farmacia) </td><td></td></tr><tr><td> IL-12 </td><td> NCI / CTEP </td><td></td></tr><tr><td> IL-15 </td><td> CellGenix </td><td> 1013-050 </td></tr><tr><td> IL-7 </td><td> R &amp; S </td><td> AFL207 </td></tr><tr><td> IL-1beta </td><td> R &amp; S </td><td> AFL201 </td></tr><tr><td> IL-6 </td><td> CellaGenix </td><td> 1004-050 </td></tr><tr><td> GM-CSF </td><td> TCH Farmacia </td><td></td></tr><tr><td> IL-4 </td><td> R &amp; S </td><td> <a href="http://www.rndsystems.com/pdf/AFL204.pdf" target="_blank">AFL204</a> </td></tr><tr><td> TNF-alfa </td><td> R &amp; S </td><td> AFL210 </td></tr><tr><td> Ad5f35pp65 </td><td> BCM CAGT Vector Production Facility </td><td></td></tr><tr><td> Trasferimento al plasma con adattatore femmina luer </td><td> Carta Medical </td><td> 89-550-66J </td></tr><tr><td> Lymphoprep </td><td> Nycomed </td><td> 1114550 </td></tr></tbody></table>

espansione linfociti t citotossici da sangue del cordone ombelicale che target citomegalovirus, virus di epstein-barr virus, e adenovirus

Expanding Cytotoxic T Lymphocytes from Umbilical Cord Blood that Target Cytomegalovirus, Epstein-Barr Virus, and Adenovirus

Infezione da virus dopo il trapianto di cellule staminali sono tra le cause più comuni di morte, specialmente dopo sangue cordonale (CB) trapianto (CBT) in cui l&#39;organismo di certificazione non contiene numeri notevoli di virus-esperti cellule T in grado di proteggere il destinatario dalle infezioni 1. - 4 Noi e altri hanno dimostrato che virus specifica CTL generati da donatori sieropositivi e infuso al destinatario sono sicuri e protettivi. 5-8 Tuttavia, fino a poco tempo, virus-specifiche cellule T non può essere generato dal sangue del cordone ombelicale, probabilmente a causa del assenza di celle di memoria virus-T specifiche. Nel tentativo di imitare il meglio in condizioni di innesco in vivo di cellule T naive, abbiamo stabilito un metodo utilizzato CB derivate da cellule dendritiche (DC) trasdotte con un vettore adenovirale (Ad5f35pp65) contenente l&#39;antigene immunodominante CMV pp65, quindi guidare specificità delle cellule T verso CMV e adenovirus. 9 Alla iniziazione, usiamo queste macchineDCs strutturati come anche cellule T CB-derivato in presenza delle citochine IL-7, IL-12 e IL-15. 10 Alla stimolazione secondo abbiamo usato EBV-trasformate cellule B, o EBV-LCL, che esprimono sia latente e litiche antigeni EBV. Ad5f35pp65-trasdotte EBV-LCL sono usati per stimolare le cellule T in presenza di IL-15 alla seconda stimolazione. Stimoli successivi utilizzano Ad5f35pp65-trasdotte EBV-LCL e IL-2. Da 50x10 6 cellule mononucleate CB siamo in grado di generare l&#39;alto di 150 x 10 6 cellule T virus-specifici che lisare antigene-pulsate obiettivi e citochine rilascio in risposta alla stimolazione antigenica. 11 Queste cellule sono state prodotte in un modo conforme GMP utilizzando solo la frazione al 20% di una unità di sangue del cordone frazionato e tradotti per l&#39;uso clinico.

Qui si descrive la prima pratica di fabbricazione (GMP) conforme metodo per produrre virus-specifici linfociti T citotossici (CTL) da sangue del cordone ombelicale, fonte di cellule T prevalentemente ingenuo.

Espansione linfociti T citotossici da sangue del cordone ombelicale che Target Citomegalovirus, virus di Epstein-Barr virus, e Adenovirus

Le infezioni virali dopo il trapianto di cellule staminali sono tra le cause di morte più comuni, specialmente dopo il trapianto di sangue cordonale (CBT), dove...

L'obiettivo generale di questa procedura è generare linfociti T citotossici, o CTL, derivati dal sangue del cordone ombelicale che riconoscono antigeni di più virus. Questo risultato si ottiene innanzitutto isolando le cellule mononucleate del sangue del cordone ombelicale dalla frazione 20% dell'unità di sangue del cordone ombelicale. Il secondo passaggio consiste nell'utilizzare le cellule mononucleate per generare cellule dendritiche, linee cellulari di linfoblasti infettate dal virus di Epstein-Barr, o EBV-LCL, e CTL specifici per i virus.Le cellule mononucleate, che contengono i linfociti T, vengono stimolate con cellule che sono state trasdotte con il vettore A five F 35 PP 65. L'ultimo passaggio consiste nel confermare la specificità dei CTL specifici per più virus e nel congelare i CTL. Infine, la specificità dell'espansione dei CTL per almeno un antigene virale può essere valutata mediante analisi Ellie SPA e saggi di citotossicità.Generalmente, le persone nuove a questo metodo incontrano difficoltà perché il volume di sangue periferico disponibile nella frazione al 20% è molto ridotto, il che significa che ci sono pochissime cellule su cui lavorare. La procedura è inoltre

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Immunologia e Infezioni

Un rapido, protocollo semplice e conveniente per la generazione di donatore-derivati ​​multivirus specifici CTL (RCtl) per infusione a trapianto allogenico di cellule staminali emopoietiche (HSCT) a rischio di sviluppare infezioni da CMV, EBV o Adv. Questo processo di fabbricazione è GMP e deve assicurare l'applicazione più ampia di cellule T immunoterapia al di là di centri specializzati.

Generazione di Multivirus-cellule T specifiche per prevenire / curare infezioni virali dopo trapianto allogenico di cellule staminali ematopoietiche

Un nuovo metodo DC indipendente per l'induzione e l'espansione di antigene-specifica delle cellule T è descritta. HLA-A2 Ig Cellule artificiali basati Antigen Presenting (aAPC) vengono caricati con HLA-A2 peptidi limitato ad ampliare in modo efficace CTL di specificità antigenica diversi. Questa tecnologia ha un grande potenziale per CTL-immunoterapia adottiva.

HLA-Ig celle in base Antigen Presenting artificiale per Efficiente Ex vivo Estensione dei diritti dell&#39;uomo e CTL

CD4+ Le cellule T regolatorie sono potenti immunomodulatori e svolgono importanti funzioni nell'omeostasi immunitaria. La scarsità di queste cellule nel sangue periferico rende difficili gli studi funzionali, in particolare nel contesto dell'infezione da HIV-1. Qui descriviamo un metodo per isolare ed espandere le Treg CD4+ funzionali dal sangue periferico di individui con infezione da HIV-1.

Nuovi strumenti per espandere cellule T regolatorie di individui HIV-1-infetti

Generazioni di nuovi saggi funzionali quali interferone gamma (IFN-γ) ELISpot, che rilevano la produzione di citochine a livello di singola cellula e forniscono sia la caratterizzazione quantitativa e qualitativa delle risposte delle cellule T possono essere utilizzati per valutare la risposta immunitaria cellulo-mediata contro varicella zoster virus (VZV).

Sviluppo di un Varicella-Zoster immunità cellulo-mediata specifica-Virus-IFN γ ELISpot test per valutare seguito cordone ombelicale trapianto di sangue

L'obiettivo di questo protocollo è produrre cellule T di grado clinico specifiche per i patogeni utilizzando un dispositivo di arricchimento cellulare di seconda generazione automatizzato da banco che incorpora un sistema chiuso di cattura delle citochine e non richiede personale dedicato o l'uso di una struttura GMP. Le cellule T specifiche per il citomegalovirus pp65 generate possono essere somministrate direttamente ai pazienti.

Arricchimento cellulare automatizzata di Citomegalovirus specifici linfociti T per le applicazioni cliniche che utilizzano il sistema di citochine cattura

Qui, dimostriamo come i monociti vengono isolati mediante separazione di biglie magnetiche dalle cellule mononucleate del sangue periferico dopo la centrifugazione in gradiente di densità del sangue umano anticoagulato. Dopo un'incubazione di 5 giorni, i monociti umani vengono differenziati in cellule dendritiche immature e sono pronti per le procedure sperimentali in un contesto non clinico.

Generazione di derivate da monociti cellule dendritiche umane da sangue intero

Qui presentiamo un'applicazione per una tecnica immunologica standard (CFSE macchiato OT-ho proliferazione) destinato a monitorare rapidamente adiuvante-mediata di linfociti T citotossici (CTL) generazione in vivo. Questa veloce stima delle capacità CTL è utile per lo sviluppo di vaccini profilattici contro patogeni intracellulari, come pure i vaccini terapeutici del cancro.

Rapida In Vivo valutazione della funzionalità di generazione i linfociti T citotossici di adiuvante per lo sviluppo di vaccini

Qui, presentiamo un protocollo per la preparazione e la somministrazione stereotassica di linfociti umani allogenici in topi immunodeficienti portatori di tumori cerebrali primari umano ortotopico. Questo studio fornisce un proof-of-concept per sia la fattibilità e l'efficacia antitumorale di immunoterapie cellulari intrabrain-consegnato.

Trasferimento adottivo stereotactic di citotossici cellule immunitarie nei modelli murini di xenotrapianti Multiforme di Glioblastoma umano ortotopico

Presentato qui è un protocollo per l'effettiva soppressione della replicazione del virus dell'epatite B (HBV) nei topi utilizzando il trasferimento di cellule adottive (ACT) di antigeni virali (Ag) specifici di cellule staminali. Questa procedura può essere adattata per una potenziale immunoterapia basata su ACT dell'infezione da HBV.

Le cellule staminali derivate dall'ag virale specifico t linfociti sopprimeno la replica HBV nei topi

Illustreremo un protocollo di 9 giorni per la trasduzione e l'espansione delle cellule mononucleari periferiche del macaco rhesus che produce cellule con un'eccellente co-espressione dei geni di interesse in numero sufficiente per gli studi di infusione dell'efficacia cellulare.

Trasduzione ed espansione delle cellule T primarie in nove giorni con manutenzione del fenotipo della memoria centrale

Presentato è un protocollo per l'espansione del prodotto farmaceutico a cellule T Gamma-Delta (γδ). I linfociti sono isolati per elutriazione e arricchiti con acido zoledronico e interleuchina-2. Le cellule T alfa-beta vengono esaurite utilizzando un dispositivo di separazione magnetica di grado clinico. Le cellule γδ sono co-coltivate con cellule derivate da K562, che presentano antigeni artificiali ed espanse.

Espansione e arricchimento di cellule T Gamma-Delta (γδ) da prodotto umano afereso

Scopri come generare linfociti T citotossici specifici per virus da sangue del cordone ombelicale. Questo metodo GMP-compliant produce CTL multi-virus per applicazioni cliniche in immunoterapia antivirale.

Espansione linfociti T citotossici da sangue del cordone ombelicale che Target Citomegalovirus, virus di Epstein-Barr virus, e Adenovirus (Video) | JoVE Journal

Espansione linfociti T citotossici da sangue del cordone ombelicale che Target Citomegalovirus, virus di Epstein-Barr virus, e Adenovirus

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