In Assemblea in vitro di semi-artificiale della macchina molecolare e il suo utilizzo per il rilevamento del danno al DNA

L'obiettivo generale di questa procedura è dimostrare come assemblare e utilizzare un sensore di danno al DNA a doppia marcatura che etichetta due tipi principali di rotture del DNA in sezioni di tessuto. Il sensore è composto da un oligonucleotide tumorale 30 marcato in modo doppio con ZI e Rumine e da un enzima, la vaccinia topo isomerasi uno o vac topo, che si assembla autonomamente. Quando la vac topo si lega al tumore 30, il funzionamento del sistema inizia quando la topo isomerasi scinde l'oligonucleotide all'estremità tre prime della sequenza di riconoscimento, generando un'unità attivata di vac topo marcata con fitzy e un'elica libera marcata con ammina.

Con un idrossile terminale in posizione tre-primo, le unità hanno vita breve e vengono rapidamente riassemblate nella costruzione originale, che successivamente viene scissa. In assenza di ulteriori rotture del DNA di tipo extramolecolare, queste due unità si separano e si riassemblano in modo ciclico. Quando il sensore molecolare viene applicato a sezioni di tessuto con danni al DNA, l'unità rivelatrice marcata con Fitz si lega selettivamente alle rotture del DNA a estremità ottuse con idrossile in posizione cinque-primo.

L'unità rivelatrice contrassegnata con il dominio R si lega a un'estremità ottusa dotata di fosfato in posizione cinque-primo. Se è presente la DNA ligasi T4, i risultati ottenuti mostrano la presenza e distribuzione delle rotture del DNA di tipo uno e due nelle cellule, in base alla microscopia a fluorescenza. Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti per il rilevamento delle HESIs, come il test TUNEL, è la maggiore specificità e la fornitura di informazioni aggiuntive, grazie all'etichettatura sia delle fasi autonomo-apoptotiche sia di quelle fagocitiche dell'apoptosi.

Da un punto di vista della nanotecnologia, il sensore rappresenta un approccio basato sulla biologia che adatta strutture e architetture biologiche reali alla costruzione di dispositivi su scala molecolare non tossici. In generale, le persone nuove rispetto a questo metodo potrebbero incontrare difficoltà poiché il suo successo dipende dall'utilizzo di una preparazione altamente attiva di Toro SOM e da un corretto trattamento dei campioni per evitare un'eccessiva digestione da parte della proteinasi K. I tagli istologici per questa procedura devono essere preparati prima dell'assemblaggio del dispositivo molecolare. Sezioni spesse da cinque a sei micron ottenute da paraformaldeide.

Si raccomandano blocchi di tessuto fissati in paraffina. Posizionare il vetrino con la sezione di tessuto su un portavetrini e rimuovere la paraffina con xilolo per 15 minuti. Dopo 15 minuti, trasferire in un bagno fresco di xilolo per altri cinque minuti.

Ridratare il campione passando il vetrino attraverso queste concentrazioni graduate di etanolo: 96% etanolo due volte per cinque minuti ciascuna, 80% etanolo per cinque minuti, seguito da acqua.

Due volte per cinque minuti ciascuna. Dopo la reidratazione, digerire il campione con proteinasi K. Utilizzando 100 microlitri di una soluzione da 50 microgrammi per millilitro per sezione, incubare per 15 minuti a temperatura ambiente in una camera umidificata. A seconda del tipo di tessuto, potrebbe essere necessario regolare il tempo di digestione, ma prestare attenzione a non eccedere nella digestione poiché provoca la scomparsa del segnale e il danneggiamento del campione al termine della digestione.

Sciacquare il vetrino due volte con acqua distillata, per 10 minuti ciascuna. Applicare BSA al 2% per il pre-bloccaggio e incubare per 15 minuti a temperatura ambiente in una camera umidificata. Durante questo periodo, assemblare la macchina molecolare come mostrato successivamente in questo video.

Tutti i reagenti per l'assemblaggio della macchina molecolare sono dosati per un volume totale di 25 microlitri, sufficiente per un singolo rilevamento in una sezione di tessuto di dimensioni medie. Il volume può essere aumentato secondo necessità in un piccolo tubo di plastica. Combinare i seguenti reagenti in questo ordine aggiungendo acqua distillata.

Tampone della DNA ligasi al 15% di polietilene glicole 8.000, oligonucleotide bifunzionale etichettato vaccinia topoisomerasi I e DNA ligasi T4 mescolati delicatamente mediante pipettaggio. La costruzione molecolare si autoassemblerà quasi istantaneamente in questa soluzione e può essere utilizzata immediatamente a temperatura ambiente. Per iniziare la procedura di etichettatura delle interruzioni del DNA, aspirare la soluzione di pre-bloccaggio dal vetrino.

Applicare 25 microlitri della miscela di reazione completa su ciascuna sezione. Posizionare una lamella di plastica sulla sezione e inserire il vetrino in una camera umidificata. Proteggere dalla luce avvolgendo la camera con carta d'alluminio e incubare per un'ora a temperatura ambiente.

Sebbene entrambi i segnali della ligasi e della topo possano essere osservati dopo l'incubazione di un'ora, in molti casi il segnale della ligasi può essere ulteriormente potenziato. Per potenziare il segnale, riapplicare la miscela di reazione senza vac topo e oligonucleotide uno, ma con oligonucleotide tre e T four DNA Ligasi, posizionare una lamella di plastica sul campione e incubare in una camera umidificata per 18 ore. Il giorno seguente, a temperatura ambiente, immergere delicatamente il vetrino verticalmente in un contenitore tipo coplan jar contenente acqua a temperatura ambiente per rimuovere la lamella.

Quindi lavare il campione con acqua distillata tre volte, per 10 minuti ciascuna. Risciacquare il campione con tampone di bicarbonato di sodio. Questo risciacquo con soluzione alcalina potenzia la fluorescenza di fitzina, che è sensibile al pH ed è notevolmente ridotta a un pH inferiore a sette.

Infine, coprire il campione con una soluzione antigiallimento che contiene anche DPI per la colorazione dei nuclei e applicare un coprioggetto. I campioni sono ora pronti per la microscopia a fluorescenza. Nella presente figura è mostrata una sezione di timo trattato con desametasone in cui la macchina molecolare ha rilevato frammenti di DNA di tipo DNA uno e DNA due con estremità ottuse, rotture del DNA nelle aree corticali timiche in fase di apoptosi, una fluorescenza citoplasmatica verde che indica rotture di tipo DNA due e macrofagi corticali di Marx che digeriscono il materiale nucleare dei timociti apoptotici.

Questo segnale è prodotto da vac topo e si localizza nei lisosomi FGA con DNA contenente idrossile in posizione cinque prime. Interruzioni a doppio filamento con fluorescenza rossa indicano tipi di rottura del DNA; etichettano nuclei di timociti apoptotici non fagocitati dai macrofagi. Un numero massiccio di timociti subisce contemporaneamente apoptosi.

Accompagnato dalla generazione di rotture a doppio filamento con fosfato in posizione 5' visualizzate mediante etichettatura basata su ligasi. Queste rotture si trovano alla periferia nucleare e formano schemi a forma di anello. Tutti i nuclei cellulari sono visualizzati in blu mediante colorazione di contrasto con dpi.

Nel tentativo di eseguire questa procedura, è importante ricordare di non far mai asciugare i campioni tra l'aggiunta di diverse soluzioni. Mantenere inoltre tutte le preparazioni enzimatiche sul ghiaccio prima di aggiungere i campioni e proteggere le sonde fluorescenti dalla luce durante la reazione di marcatura dopo lo sviluppo. La tecnica ha permesso la visualizzazione di tutte le fasi della disassemblaggio delle cellule heto.

Questo sensore rappresenta di per sé un esempio dell'approccio della nanotecnologia verde alla progettazione di particelle, sonde e macchine su scala nanometrica. Tale approccio combina componenti artificiali con parti di macchine molecolari presenti in natura. L'obiettivo è eliminare la tossicità e le reazioni biologiche avverse di questi materiali nanostrutturati altamente dispersi.