30 ottobre 2011
Questo protocollo video dimostra l'isolamento e l'espansione delle cellule staminali come da chirurgicamente asportato mutliforme glioblastoma umano (GBM) tessuti tumorali utilizzando il metodo neurosfere cultura test.
L'obiettivo di questo protocollo è l'isolamento e l'espansione di cellule tumorali multiformi di glioblastoma umano utilizzando l'asset delle neurosfere. Ciò si ottiene macinando prima il tessuto tumorale raccolto, seguito dalla dissociazione meccanica di polarizzazione e infine dalla placcatura delle cellule risultanti per crescere nella coltura della neurosfera. In questo video, mostreremo come isolare ed espandere le cellule staminali dal tessuto tumorale del glioblastoma umano utilizzando il metodo di coltura della sfera neuronaria.
Questo metodo può essere utilizzato anche per coltivare cellule di altri tumori cerebrali e tumori solidi come seno, prostata, fegato e polmone. Ok, iniziamo. Dopo aver ricevuto il tessuto tumorale GBM resecato dall'intervento chirurgico, il terreno viene rimosso.
Il tumore viene lavato due o tre volte utilizzando PBS sterile per rimuovere contaminanti come sangue e detriti. Dopo il lavaggio, posizionare il tumore resecato in una capsula di Petri sterile. Per prima cosa, tagliare il tumore in porzioni più piccole, quindi trasferire una porzione di tessuto tumorale in una capsula di Petri separata, tritare il tessuto usando un bisturi numero 10 in piccoli pezzi.
Ciò aumenterà l'area superficiale disponibile per la dissociazione enzimatica. La macinazione può richiedere da uno a tre minuti a seconda delle dimensioni del tumore. Ora aggiungi da tre a cinque ml di tripsina preriscaldata al fazzoletto macinato e trasferiscilo in una provetta sterile da 15 ml.
Mettere il tubo da 15 ml in un bagnomaria a 37 gradi per 10-15 minuti. Agitare il tubo ogni cinque minuti. Per garantire una migliore digestione dei tessuti, aggiungere un volume uguale di inibitore della tripsina per fermare la reazione.
La tripsina in attivazione è assicurata mediante pipettaggio su e giù più volte. Centrifugare la sospensione a 800 RRP M o 110 G per cinque minuti. Rimuovere il surnatante, quindi risospendere il pallet in un ml di terreno basale di cellule staminali neuros, posizionando la punta contro il fondo della provetta.
Pipettare su e giù da tre a sette volte per rompere i grumi fino a ottenere una sospensione lattiginosa, il pipettaggio potrebbe provocare la morte cellulare. Posizionare un filtro da 40 micron su un tubo da 50 ml. Ora aggiungere da 10 a 15 ml di terreno basale alla sospensione cellulare e mescolarlo delicatamente, passando la sospensione cellulare attraverso il filtro da 40 micron in modo da rimuovere i detriti nei grumi non associati.
PT le celle E aspirare il supernat. Risospendere le cellule in uno o due ml di terreno completo. Quindi pipettare delicatamente su e giù per omogeneizzare la sospensione.
Mescolare 10 microlitri di sospensione cellulare in 90 microlitri di Trian blue. Mescolare bene la sospensione e trasferire 10 microlitri nell'emo. Citometro. Eseguire un conteggio delle celle come mostrato qui.
È necessaria una sospensione a cellula singola senza grumi per avere una conta cellulare accurata. Non includere celle trian blue positive. Durante il conteggio per piastrare, le celle in un matraccio T 80.
Aggiungere 20 ml di terreno completo di cellule staminali neuro in una provetta da 50 ml. Aggiungere una quantità appropriata di sospensione cellulare per raggiungere una densità di 200.000 cellule per ml. Ora aggiungi EGF per raggiungere una concentrazione finale di 20 nanogrammi per ml.
Aggiungere lo 0,2% di eparina alla concentrazione di un microlitro per ml. Infine, aggiungere BFGF per raggiungere una concentrazione finale di 10 nanogrammi per ml. Mescolare le cellule in terreni completi integrati con fattori di crescita.
Bene, quindi trasferisci la sospensione su un'etichetta T 80. Il pallone viene quindi trasferito nell'incubatore a 37 gradi Celsius e al 5% di CO2 per sette-10 giorni. Dopo otto giorni di cultura, le sfere sono completamente cresciute e pronte per essere attraversate.
Raccogliere il contenuto del matraccio e trasferirlo in una centrifuga da 50 ml. Le celle a 800 giri/min per cinque minuti. Aspirare il supernat, quindi risospendere il pallet in un ml di tripsina preriscaldata.
Incubare le cellule a bagnomaria a 37 gradi Celsius per due minuti. Aggiungere una quantità uguale di inibitore della tripsina e mescolare accuratamente per garantire un'attivazione. Quindi pellettare le celle.
Rimuovere il supernat e risospendere le cellule in un ml di terreno completo, pipettare delicatamente su e giù per omogeneizzare la sospensione cellulare. Eseguire una conta delle cellule come descritto in precedenza per piastrarle in un matraccio T 80 a 20 ml di terreno completo in una provetta da 50 ml. Aggiungere una quantità appropriata di sospensione cellulare per raggiungere una densità di 50.000 cellule per ml.
Ora aggiungi i fattori di crescita tra cui E-G-F-B-F-G-F e l'eparina alla concentrazione descritta in precedenza. Miscelare delicatamente la sospensione cellulare risultante, quindi trasferire la sospensione in un T 80 e porre nell'incubatore per sette-10 giorni. Di seguito è riportato un esempio di impostazioni cultura GBM primarie.
Dopo quattro giorni in questa fase, si può vedere che le cellule stanno proliferando e iniziano a formare sfere. In questa fase non si dovrebbero osservare grandi ammassi sferici di cellule. Ciò sarebbe dovuto a una preparazione inappropriata dei tessuti.
Dopo essere state in coltura da sette a 10 giorni, si sono formate sfere di varie dimensioni quando le sfere hanno raggiunto un diametro medio da 150 a 200 micron, sono pronte per essere attraversate. Questo è un esempio di passaggio della cultura GBM dopo otto giorni. Ancora una volta, si possono vedere le sfere di varie dimensioni, sfere sane, che mostrano micro punte alla loro periferia.
La preparazione di una sospensione a cellula singola è una questione molto importante in qualsiasi coltura di sfere. In caso contrario, si potrebbe finire per osservare gli aggregati cellulari anche il giorno dopo la placcatura delle cellule. Questi aggregati possono essere assunti come sfere, ma va notato che ci vuole almeno una settimana perché le cellule perforanti formino vere sfere.
La quantità di detriti nella coltura della sfera tumorale primaria varia a seconda di molti fattori come la fonte del tessuto e la precisione con cui il tessuto è stato rimosso e anche la tecnica di lavorazione dei tessuti. Ci auguriamo che questo video ti sia utile e ti auguriamo buona fortuna per i tuoi esperimenti.
Questo protocollo video dimostra l'isolamento e l'espansione di cellule simili a staminali da tessuto tumorale di glioblastoma multiforme (GBM) umano chirurgicamente asportato utilizzando il metodo di coltura del saggio delle neurosfere. Il protocollo delinea i passaggi dalla preparazione del tessuto alla coltura cellulare, fornendo informazioni sulle tecniche utilizzate per una riuscita espansione cellulare.
The neurosphere assay enables isolation and expansion of glioblastoma stem-like cells, providing a disease-relevant system for target validation and mechanistic de-risking in oncology drug discovery. This approach supports predictive confidence by modeling tumor-initiating cell populations critical to understanding GBM progression and therapeutic resistance. It facilitates early discovery workflows by generating scalable, reproducible cellular models for assay development and lead identification.
The neurosphere assay fits within the early discovery continuum, supporting target validation through functional assays in stem-like cell models prior to lead identification and preclinical efficacy testing.