Isolamento ed espansione di cellule umane Glioblastoma Multiforme Tumore del saggio di neurosfere
30 ottobre 2011
Questo protocollo video dimostra l'isolamento e l'espansione delle cellule staminali come da chirurgicamente asportato mutliforme glioblastoma umano (GBM) tessuti tumorali utilizzando il metodo neurosfere cultura test.
L'obiettivo di questo protocollo è l'isolamento e l'espansione di cellule tumorali multiformi di glioblastoma umano utilizzando l'asset delle neurosfere. Ciò si ottiene macinando prima il tessuto tumorale raccolto, seguito dalla dissociazione meccanica di polarizzazione e infine dalla placcatura delle cellule risultanti per crescere nella coltura della neurosfera. In questo video, mostreremo come isolare ed espandere le cellule staminali dal tessuto tumorale del glioblastoma umano utilizzando il metodo di coltura della sfera neuronaria.
Questo metodo può essere utilizzato anche per coltivare cellule di altri tumori cerebrali e tumori solidi come seno, prostata, fegato e polmone. Ok, iniziamo. Dopo aver ricevuto il tessuto tumorale GBM resecato dall'intervento chirurgico, il terreno viene rimosso.
Il tumore viene lavato due o tre volte utilizzando PBS sterile per rimuovere contaminanti come sangue e detriti. Dopo il lavaggio, posizionare il tumore resecato in una capsula di Petri sterile. Per prima cosa, tagliare il tumore in porzioni più piccole, quindi trasferire una porzione di tessuto tumorale in una capsula di Petri separata, tritare il tessuto usando un bisturi numero 10 in piccoli pezzi.
Ciò aumenterà l'area superficiale disponibile per la dissociazione enzimatica. La macinazione può richiedere da uno a tre minuti a seconda delle dimensioni del tumore. Ora aggiungi da tre a cinque ml di tripsina preriscaldata al fazzoletto macinato e trasferiscilo in una provetta sterile da 15 ml.
Mettere il tubo da 15 ml in un bagnomaria a 37 gradi per 10-15 minuti. Agitare il tubo ogni cinque minuti. Per garantire una migliore digestione dei tessuti, aggiungere un volume uguale di inibitore della tripsina per fermare la reazione.
La tripsina in attivazione è assicurata mediante pipettaggio su e giù più volte. Centrifugare la sospensione a 800 RRP M o 110 G per cinque minuti. Rimuovere il surnatante, quindi risospendere il pallet in un ml di terreno basale di cellule staminali neuros, posizionando la punta contro il fondo della provetta.
Pipettare su e giù da tre a sette volte per rompere i grumi fino a ottenere una sospensione lattiginosa, il pipettaggio potrebbe provocare la morte cellulare. Posizionare un filtro da 40 micron su un tubo da 50 ml. Ora aggiungere da 10 a 15 ml di terreno basale alla sospensione cellulare e mescolarlo delicatamente, passando la sospensione cellulare attraverso il filtro da 40 micron in modo da rimuovere i detriti nei grumi non associati.
PT le celle E aspirare il supernat. Risospendere le cellule in uno o due ml di terreno completo. Quindi pipettare delicatamente su e giù per omogeneizzare la sospensione.
Mescolare 10 microlitri di sospensione cellulare in 90 microlitri di Trian blue. Mescolare bene la sospensione e trasferire 10 microlitri nell'emo. Citometro. Eseguire un conteggio delle celle come mostrato qui.
È necessaria una sospensione a cellula singola senza grumi per avere una conta cellulare accurata. Non includere celle trian blue positive. Durante il conteggio per piastrare, le celle in un matraccio T 80.
Aggiungere 20 ml di terreno completo di cellule staminali neuro in una provetta da 50 ml. Aggiungere una quantità appropriata di sospensione cellulare per raggiungere una densità di 200.000 cellule per ml. Ora aggiungi EGF per raggiungere una concentrazione finale di 20 nanogrammi per ml.
Aggiungere lo 0,2% di eparina alla concentrazione di un microlitro per ml. Infine, aggiungere BFGF per raggiungere una concentrazione finale di 10 nanogrammi per ml. Mescolare le cellule in terreni completi integrati con fattori di crescita.
Bene, quindi trasferisci la sospensione su un'etichetta T 80. Il pallone viene quindi trasferito nell'incubatore a 37 gradi Celsius e al 5% di CO2 per sette-10 giorni. Dopo otto giorni di cultura, le sfere sono completamente cresciute e pronte per essere attraversate.
Raccogliere il contenuto del matraccio e trasferirlo in una centrifuga da 50 ml. Le celle a 800 giri/min per cinque minuti. Aspirare il supernat, quindi risospendere il pallet in un ml di tripsina preriscaldata.
Incubare le cellule a bagnomaria a 37 gradi Celsius per due minuti. Aggiungere una quantità uguale di inibitore della tripsina e mescolare accuratamente per garantire un'attivazione. Quindi pellettare le celle.
Rimuovere il supernat e risospendere le cellule in un ml di terreno completo, pipettare delicatamente su e giù per omogeneizzare la sospensione cellulare. Eseguire una conta delle cellule come descritto in precedenza per piastrarle in un matraccio T 80 a 20 ml di terreno completo in una provetta da 50 ml. Aggiungere una quantità appropriata di sospensione cellulare per raggiungere una densità di 50.000 cellule per ml.
Ora aggiungi i fattori di crescita tra cui E-G-F-B-F-G-F e l'eparina alla concentrazione descritta in precedenza. Miscelare delicatamente la sospensione cellulare risultante, quindi trasferire la sospensione in un T 80 e porre nell'incubatore per sette-10 giorni. Di seguito è riportato un esempio di impostazioni cultura GBM primarie.
Dopo quattro giorni in questa fase, si può vedere che le cellule stanno proliferando e iniziano a formare sfere. In questa fase non si dovrebbero osservare grandi ammassi sferici di cellule. Ciò sarebbe dovuto a una preparazione inappropriata dei tessuti.
Dopo essere state in coltura da sette a 10 giorni, si sono formate sfere di varie dimensioni quando le sfere hanno raggiunto un diametro medio da 150 a 200 micron, sono pronte per essere attraversate. Questo è un esempio di passaggio della cultura GBM dopo otto giorni. Ancora una volta, si possono vedere le sfere di varie dimensioni, sfere sane, che mostrano micro punte alla loro periferia.
La preparazione di una sospensione a cellula singola è una questione molto importante in qualsiasi coltura di sfere. In caso contrario, si potrebbe finire per osservare gli aggregati cellulari anche il giorno dopo la placcatura delle cellule. Questi aggregati possono essere assunti come sfere, ma va notato che ci vuole almeno una settimana perché le cellule perforanti formino vere sfere.
La quantità di detriti nella coltura della sfera tumorale primaria varia a seconda di molti fattori come la fonte del tessuto e la precisione con cui il tessuto è stato rimosso e anche la tecnica di lavorazione dei tessuti. Ci auguriamo che questo video ti sia utile e ti auguriamo buona fortuna per i tuoi esperimenti.
Panoramica
Questo protocollo video dimostra l'isolamento e l'espansione di cellule simili a staminali da tessuto tumorale di glioblastoma multiforme (GBM) umano chirurgicamente asportato utilizzando il metodo di coltura del saggio delle neurosfere. Il protocollo delinea i passaggi dalla preparazione del tessuto alla coltura cellulare, fornendo informazioni sulle tecniche utilizzate per una riuscita espansione cellulare.
Componenti chiave dello studio
Area di Scienza
- Neuroscienza
- Biologia Cellulare
- Oncologia
Sfondo
- Il glioblastoma multiforme (GBM) è un tumore cerebrale altamente aggressivo.
- L'isolamento di cellule simili a staminali è cruciale per studiare la biologia del tumore.
- I metodi di coltura delle neurosfere permettono la crescita di queste cellule in vitro.
- Questo protocollo può essere applicato anche ad altri tumori cerebrali e solidi.
Scopo dello studio
- Isolare ed espandere cellule simili a staminali dal tessuto GBM.
- Fornire un metodo affidabile per studiare la biologia del glioblastoma.
- Facilitare la ricerca su potenziali bersagli terapeutici.
Metodi utilizzati
- Raccolta e lavaggio del tessuto tumorale.
- Tagliare e dissociazione enzimatica del tessuto.
- Conteggio delle cellule e messa in piastra nella coltura delle neurosfere.
- Supplemento con fattori di crescita per l'espansione cellulare.
Principali risultati
- Isolamento riuscito di cellule simili a staminali dal tessuto GBM.
- Formazione di neurosfere che indicano una crescita cellulare sana.
- Dimostrazione dell'importanza della sospensione di cellule singole per la coltura.
- Osservazione della morfologia della sfera come indicatore della salute della coltura.
Conclusioni
- Il saggio delle neurosfere è efficace per la coltura di cellule simili a staminali GBM.
- Una corretta preparazione del tessuto è fondamentale per risultati di successo.
- Questo metodo può aiutare a comprendere il GBM e sviluppare trattamenti.
Domande Frequenti
Executive Industry Relevance
The neurosphere assay enables isolation and expansion of glioblastoma stem-like cells, providing a disease-relevant system for target validation and mechanistic de-risking in oncology drug discovery. This approach supports predictive confidence by modeling tumor-initiating cell populations critical to understanding GBM progression and therapeutic resistance. It facilitates early discovery workflows by generating scalable, reproducible cellular models for assay development and lead identification.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of tumor-initiating cell populations to clarify therapeutic hypotheses and pathway dependencies in GBM.
- Operational Value: Provides a reproducible method to isolate stem-like cells from surgically resected human tissue for functional target validation.
- Predictive Value: Supports preclinical de-risking by modeling self-renewal and tumorigenic potential of cancer stem cells.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates uniform neurosphere cultures suitable for high-content screening of compounds targeting stemness pathways.
- Operational Value: Establishes standardized culture conditions with defined growth factor supplementation (EGF, bFGF, heparin) for assay reproducibility.
- Scalability: Supports passaging and expansion of primary cultures, enabling longitudinal drug response studies.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Maintains disease relevance by preserving genomic and phenotypic characteristics of primary GBM tumors in vitro.
- Operational Value: Facilitates biomarker alignment through sphere morphology and size metrics (150-200 µm) as culture health indicators.
- Risk Mitigation: Enables evaluation of therapeutic impact on stem-like cell self-renewal, informing go/no-go decisions in preclinical advancement.
Pipeline & Workflow Integration
The neurosphere assay fits within the early discovery continuum, supporting target validation through functional assays in stem-like cell models prior to lead identification and preclinical efficacy testing.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by enabling isolation of tumor-initiating cells to investigate drivers of GBM progression and recurrence.
- Screening: Delivers quantitative, reproducible neurosphere formation as a functional readout for compound screening and pathway modulation.
- Analytics: Provides measurable outputs including sphere diameter, count, and morphology for assessing culture integrity and drug response.
- Translational Research: Connects discovery to preclinical work by maintaining stem-like cell properties essential for modeling tumor heterogeneity.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for studying multiple solid tumors, including breast, prostate, liver, and lung cancers, as noted in the protocol.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Enhances target confidence by modeling the cellular subpopulation responsible for tumor initiation, progression, and recurrence.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized dissociation, filtration, and plating steps to achieve single-cell suspensions.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early de-risking of targets through functional stem cell assays.
- Portfolio Impact: Informs risk-adjusted prioritization by identifying compounds that modulate cancer stem cell self-renewal and differentiation.
Implementation Considerations
- Requires expertise in sterile tissue handling, enzymatic dissociation, and neurosphere culture techniques.
- Dependent on access to sterile cell culture incubators, centrifuges, and hemocytometers for cell counting and viability assessment.
- Necessitates standardized protocols for tissue processing to minimize debris and clump formation that compromise sphere quality.
- Requires adaptation of growth factor concentrations based on tumor source and tissue quality, as variability affects neurosphere formation.
- Limited by the need for fresh or properly preserved tumor tissue to ensure viable stem-like cell isolation and expansion.
