Isolamento ed espansione di cellule umane Glioblastoma Multiforme Tumore del saggio di neurosfere
30 ottobre 2011
Questo protocollo video dimostra l'isolamento e l'espansione delle cellule staminali come da chirurgicamente asportato mutliforme glioblastoma umano (GBM) tessuti tumorali utilizzando il metodo neurosfere cultura test.
Lo scopo di questo protocollo è l'isolamento e l'espansione di cellule tumorali umane di glioblastoma multiforme mediante l'utilizzo del metodo delle neurosfere. Questo viene ottenuto prima tritando il tessuto tumorale raccolto, seguito da dissociazione meccanica, e infine piastrando le cellule risultanti per farle crescere in coltura di neurosfere. In questo video, mostreremo come isolare ed espandere cellule simili a cellule staminali da tessuto tumorale umano di glioblastoma utilizzando il metodo di coltura delle neurosfere.
Questo metodo può essere utilizzato anche per coltivare cellule provenienti da altri tumori cerebrali e da tumori solidi come quelli del seno, della prostata, del fegato e del polmone. Ok, iniziamo. Dopo aver ricevuto il tessuto tumorale di GBM resecato chirurgicamente, il mezzo viene rimosso.
Il tumore viene lavato due o tre volte utilizzando PBS sterile per rimuovere contaminanti come sangue e detriti. Dopo il lavaggio, posizionare il tumore resecato in una piastra di Petri sterile. Per prima cosa, tagliare il tumore in porzioni più piccole, quindi trasferire una porzione di tessuto tumorale in una piastra di Petri separata e tritare il tessuto usando un bisturi numero 10 in piccoli pezzi.
Questo aumenterà la superficie disponibile per la dissociazione enzimatica. Il tritamento può richiedere da uno a tre minuti, a seconda delle dimensioni del tumore. Aggiungere ora da tre a cinque ml di tripsina preriscaldata al tessuto tritato e trasferirlo in un tubo falcon sterile da 15 ml.
Posizionare il tubo da 15 ml in un bagno d'acqua a 37 gradi per 10-15 minuti. Agitare il tubo ogni cinque minuti. Per garantire una migliore digestione del tessuto, aggiungere un volume uguale di inibitore della tripsina per arrestare la reazione.
Per garantire l'attivazione della tripsina, pipettare su e giù diverse volte. Centrifugare la sospensione a 800 RRP M o 110 G per cinque minuti. Rimuovere il soprannatante, quindi risospendere il pellet in un ml di mezzo basale per cellule staminali neurali, appoggiando la punta contro il fondo del tubo.
Pipettare su e giù da tre a sette volte per rompere gli aggregati fino a ottenere una sospensione lattiginosa; un eccesso di pipettaggio potrebbe causare la morte cellulare. Posizionare un filtro da 40 micron su un tubo da 50 ml. Aggiungere ora 10-15 ml di mezzo basale alla sospensione cellulare e mescolare delicatamente, quindi far passare la sospensione cellulare attraverso il filtro da 40 micron per rimuovere detriti e aggregati non associati.
PT le cellule e aspirare il soprannatante. Ri-sospendere le cellule in uno o due ml di mezzo completo. Quindi pipettare delicatamente su e giù per omogeneizzare la sospensione.
Mescolare 10 microlitri di sospensione cellulare in 90 microlitri di blu di trian. Mescolare accuratamente la sospensione e trasferire 10 microlitri nel emocitometro. Eseguire un conteggio cellulare come mostrato qui.
È necessaria una sospensione di singole cellule senza grumi per ottenere un conteggio cellulare accurato. Non includere le cellule positive al trian blu. Durante il conteggio per la semina delle cellule in una fiasca T 80.
Aggiungere 20 ml di mezzo completo per cellule staminali neurali in un tubo da 50 ml. Aggiungere la quantità appropriata di sospensione cellulare per raggiungere una densità di 200.000 cellule per ml. Aggiungere ora EGF per ottenere una concentrazione finale di 20 nanogrammi per ml.
Aggiungere eparina 0,2% alla concentrazione di un microlitro per ml. Infine, aggiungere BFGF per raggiungere una concentrazione finale di 10 nanogrammi per ml. Mescolare le cellule in mezzo completo integrato con fattori di crescita.
Quindi trasferire la sospensione in un flacone T 80. Il flacone va poi trasferito nell'incubatrice a 37 gradi Celsius e 5%CO2 per sette-dieci giorni. Dopo otto giorni di coltura, le sfere sono completamente sviluppate e pronte per essere sottoposte a passaggio.
Raccogliere il contenuto del matraccio e trasferirlo in una centrifuga da 50 ml. Centrifugare le cellule a 800 giri al minuto per cinque minuti. Aspirare il soprannatante, quindi risospendere il pellet in 1 ml di tripsina preriscaldata.
Incubare le cellule in bagnomaria a 37 gradi Celsius per due minuti. Aggiungere una quantità equimolare di inibitore della tripsina e mescolare accuratamente per assicurare un'attivazione. Successivamente, centrifugare le cellule per ottenere il pellet.
Rimuovere il soprannatante e risospendere le cellule in 1 ml di mezzo completo, pipettando delicatamente su e giù per omogeneizzare la sospensione cellulare. Eseguire un conteggio cellulare come descritto in precedenza per seminare le cellule in una fiasca T80 con 20 ml di mezzo completo in un tubo da 50 ml. Aggiungere una quantità appropriata di sospensione cellulare per raggiungere una densità di 50.000 cellule per ml.
Ora aggiungere i fattori di crescita, inclusi E-G-F-B-F-G-F e eparina, alla concentrazione descritta in precedenza. Mescolare delicatamente la sospensione cellulare ottenuta, quindi trasferire la sospensione in una fiasca T 80 e collocarla nell'incubatore per sette-dieci giorni. Ecco un esempio di coltura primaria di GBM.
Dopo quattro giorni a questo stadio, si possono osservare le cellule che proliferano e iniziano a formare sfere. A questo stadio non si dovrebbero osservare grandi aggregati sferici di cellule, che sarebbero il risultato di una preparazione inadeguata del tessuto.
Dopo essere stati coltivati per sette-dieci giorni, si sono formati sferoidi di dimensioni variabili; quando i sferoidi hanno raggiunto un diametro medio di 150-200 micron, sono pronti per essere sottoposti a passaggio. Questo è un esempio di coltura di passaggio di GBM dopo otto giorni. Ancora una volta, è possibile osservare sferoidi di dimensioni diverse; i sferoidi sani presentano microspine sulla loro periferia.
La preparazione di una sospensione di singole cellule è un aspetto molto importante in ogni coltura di sferoidi. In caso contrario, si potrebbero osservare aggregati cellulari già il giorno successivo al seeding delle cellule. Questi aggregati potrebbero essere considerati sferoidi, ma va precisato che sono necessarie almeno una settimana affinché le cellule formino veri e propri sferoidi.
La quantità di detriti nella coltura di sferoidi tumorali primari varia in base a molti fattori, come la provenienza del tessuto, la precisione con cui il tessuto è stato asportato e la tecnica di elaborazione del tessuto. Speriamo che questo video sia utile e vi auguriamo buona fortuna nei vostri esperimenti.
Panoramica
Questo protocollo video illustra l'isolamento e l'espansione di cellule simili a cellule staminali da tessuto tumorale di glioblastoma multiforme (GBM) umano, resecato chirurgicamente, mediante il metodo di coltura in neurosfere. Il protocollo descrive le fasi che vanno dalla preparazione del tessuto alla coltura cellulare, fornendo indicazioni sulle tecniche utilizzate per un'efficace espansione cellulare.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Biologia cellulare
- Oncologia
Sfondo
- Il glioblastoma multiforme (GBM) è un tumore cerebrale altamente aggressivo.
- L'isolamento di cellule con fenotipo staminale è fondamentale per lo studio della biologia tumorale.
- I metodi di coltura in neurosfere permettono la crescita di queste cellule in vitro.
- Questo protocollo può essere applicato anche ad altri tumori cerebrali e solidi.
Scopo dello studio
- Isolare ed espandere cellule con caratteristiche di cellule staminali da tessuto di GBM.
- Fornire un metodo affidabile per lo studio della biologia del glioblastoma.
- Facilitare la ricerca su potenziali bersagli terapeutici.
Metodi Utilizzati
- Prelevamento e lavaggio del tessuto tumorale.
- Taglio finemente e dissociazione enzimatica del tessuto.
- Conteggio cellulare e semina in coltura di neurosfere.
- Aggiunta di fattori di crescita per l'espansione cellulare.
Risultati principali
- Isolamento riuscito di cellule con caratteristiche di cellule staminali da tessuto di GBM.
- Formazione di neurosfere indicativa di una crescita cellulare sana.
- Dimostrazione dell'importanza della sospensione monocellulare per la coltura.
- Osservazione della morfologia delle sfere come indicatore dello stato di salute della coltura.
Conclusioni
- L'assay della neurosfera è efficace per la coltura delle cellule simili a cellule staminali del GBM.
- Una corretta preparazione del tessuto è fondamentale per ottenere risultati soddisfacenti.
- Questo metodo può contribuire alla comprensione del GBM e allo sviluppo di trattamenti.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
L'assay della neurosfera consente l'isolamento e l'espansione di cellule simili alle cellule staminali del glioblastoma, fornendo un sistema rilevante per la malattia utile alla validazione di bersagli e alla riduzione del rischio meccanicistico nella scoperta di farmaci oncologici. Questo approccio aumenta l'affidabilità predittiva modellando popolazioni di cellule iniziatrici del tumore fondamentali per comprendere la progressione del GBM e la resistenza terapeutica. Facilita i flussi di lavoro della fase iniziale della scoperta generando modelli cellulari scalabili e riproducibili per lo sviluppo di saggi e l'identificazione di composti promettenti.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Consente l'analisi delle popolazioni di cellule iniziatrici del tumore per chiarire ipotesi terapeutiche e dipendenze da percorsi molecolari nel GBM.
- Valore operativo: Fornisce un metodo riproducibile per isolare cellule con fenotipo staminale da tessuto umano resecato chirurgicamente, finalizzato alla validazione funzionale di bersagli.
- Valore predittivo: Supporta la riduzione del rischio preclinico modellando l'autorinnovamento e il potenziale tumorigenico delle cellule staminali tumorali.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Genera colture di neurosfere uniformi adatte allo screening ad alto contenuto di composti che bersagliano le vie di staminalità.
- Valore operativo: Stabilisce condizioni di coltura standardizzate con integrazione definita di fattori di crescita (EGF, bFGF, eparina) per garantire la riproducibilità del saggio.
- Scalabilità: Consente il passaggio e l'espansione di colture primarie, permettendo studi longitudinali sulla risposta ai farmaci.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Mantiene la rilevanza clinica preservando in vitro le caratteristiche genomiche e fenotipiche dei tumori primari di GBM.
- Valore operativo: Facilita l'allineamento dei biomarcatori attraverso parametri morfologici e dimensionali delle sferoidi (150-200 µm) come indicatori dello stato di salute della coltura.
- Mitigazione del rischio: Permette di valutare l'impatto terapeutico sulle capacità di autorenovamento delle cellule con fenotipo staminale, fornendo informazioni decisive per le scelte di avanzamento preclinico.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il saggio della neurosfera si inserisce nella fase iniziale della scoperta, supportando la validazione del bersaglio mediante saggi funzionali in modelli cellulari con caratteristiche staminali prima dell'identificazione del capostazione e dei test di efficacia preclinica.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi consentendo l'isolamento di cellule iniziatrici tumorali per indagare i fattori che guidano la progressione e la ricorrenza del GBM.
- Screening: Fornisce una formazione quantitativa e riproducibile di neurosfere come lettura funzionale per lo screening di composti e la modulazione di vie metaboliche.
- Analisi: Offre parametri misurabili, inclusi diametro, numero e morfologia delle sfere, per valutare l'integrità della coltura e la risposta ai farmaci.
- Ricerca traslazionale: Collega la scoperta al lavoro preclinico mantenendo le proprietà di tipo staminale essenziali per modellare l'eterogeneità tumorale.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una piattaforma riutilizzabile per lo studio di diversi tumori solidi, inclusi i tumori del seno, della prostata, del fegato e del polmone, come indicato nel protocollo.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia nei bersagli modellando la sottopopolazione cellulare responsabile dell'insorgenza, della progressione e della ricomparsa del tumore.
- Valore operativo: Garantisce la riproducibilità attraverso passaggi standardizzati di dissociazione, filtrazione e semina per ottenere sospensioni di singole cellule.
- Valore strategico: Migliora l'efficienza del capitale consentendo l'eliminazione precoce dei rischi associati ai bersagli mediante saggi funzionali delle cellule staminali.
- Impatto sul portafoglio: Orienta la priorizzazione corretta per rischio identificando composti che modulano l'auto-rinnovamento e la differenziazione delle cellule staminali tumorali.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nella manipolazione sterile dei tessuti, nella dissociazione enzimatica e nelle tecniche di coltura di neurosfere.
- È dipendente dall'accesso a incubatori sterili per colture cellulari, centrifughe ed emocitometri per il conteggio cellulare e la valutazione della vitalità.
- Necessita di protocolli standardizzati per l'elaborazione dei tessuti al fine di ridurre al minimo la formazione di detriti e aggregati, che compromettono la qualità delle sfere.
- Richiede l'adattamento delle concentrazioni dei fattori di crescita in base alla fonte tumorale e alla qualità del tessuto, poiché la variabilità influisce sulla formazione delle neurosfere.
- È limitato dalla necessità di tessuto tumorale fresco o adeguatamente conservato per garantire l'isolamento e l'espansione di cellule con caratteristiche staminali vitali.
