Name: Isolamento ed espansione di cellule umane Glioblastoma Multiforme Tumore del saggio di neurosfere (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-10-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 24 s
Description: Scopri l'isolamento e l'espansione di cellule staminali da tessuto tumorale umano di glioblastoma multiforme utilizzando il metodo delle neurosfere. Questa tecnica consente di studiare la biologia tumorale e identificare potenziali bersagli terapeutici.

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Questo lavoro è stato supportato da sovvenzioni del Centro per la ricerca della Florida Brain Tumor; Preston A. Wells Jr. Center for Brain Tumor Therapy.

1. Raccolta di tessuto GBM primario <ol><li> Un mutliforme glioblastoma (GBM) tumore è ottenuto da un paziente diagnosticato con il cancro e sottoposti a intervento chirurgico. </li><li> Accordi deve essere fatta con il team di neurochirurgia. Il neurochirurgo metterà GBM il tumore asportato in un tubo di dimensioni adeguate contenente cellule staminali neurali (NSC) medio basale completato con 10-15% di antibiotici (Peniciline / streptomicina). Medium freddo devono essere fornite alla sala operatoria da laboratorio. In alternativa, freddo HEPES-buffered medio minimo indispensabile (HEM) o tampone fosfato (PBS) con elevata concentrazione di antibiotici può essere utilizzato anche per questo scopo. </li><li> Il tessuto tumorale asportato viene consegnato al laboratorio su ghiaccio e posto sotto il cofano. </li></ol> 2. Dissociazione del tumore primario in cella singola Sospensione <ol><li> Eccesso del mezzo originale / PBS è stato rimosso dal tubo falco e il campione viene lavato 2-3 volte con 5-10ml di PBS / NSC medio basale per rimuovere sangue e detriti. Il PBS / Medium è stato rimosso e il tessuto tumorale GBM è posto in una capsula di Petri. </li><li> Il tessuto viene tagliato in piccoli pezzi e macinata con una lama di 10 N. bisturi in piccoli pezzi per aumentare la superficie per il processo tripsinizzazione. Macinazione può richiedere 1-3 minuti a seconda delle dimensioni del tumore. </li><li> Il tessuto è trypsinized tritata in 3-5ml di pre-riscaldato 0,05% tripsina-EDTA per 10-15 minuti a bagnomaria a 37 ° C. Una pipetta elettronica è utilizzato per trasferire i pezzi tumore piccolo e tripsina in un tubo 15ml Falcon. </li><li> Un uguale volume di inibitore della tripsina di soia viene aggiunta per bloccare la reazione enzimatica tripsina dopo il periodo di incubazione. </li><li> Inattivazione della tripsina è assicurata pipettando la sospensione su e giù diverse volte. Poi, la sospensione è pellet dalla centrifugazione a 800 giri (110 g) per 5min. </li><li> Il supernatante viene scartato ed i pezzi di tessuto sono risospesi in 1 ml di soluzione sterile NSC basal media. Le macchie sono dissociate pipettando gentilmente su e giù (3-7 volte) fino a una superficie liscia sospensione lattiginosa singola cella è raggiunto. Il numero di passi pipettamento dipende direttamente dalla dimensione delle particelle nel tessuto tritato. Lungo e vigoroso dissociazione meccanica dovrebbe essere evitata in quanto potrebbe provocare la morte cellulare e una riduzione della formazione di sfera. </li><li> Per rimuovere un-dissociato pezzi e detriti, 10-15 ml di terreno di base viene aggiunto il tubo e la sospensione cellulare viene filtrata attraverso un filtro a 40 micron delle cellule in una provetta da 50 ml. </li><li> La sospensione è filtrata centrifugato a 800 giri (110 g) per 5min. Il supernatante viene scartato in seguito. </li><li> Pellettati cellule vengono poi risospeso in 1-2ml di completo supporto NSC per il conteggio delle cellule. </li></ol> 3. Conteggio delle cellule e placcatura <ol><li> 10 ml di sospensione cellulare viene aggiunto a 90 ml di 0,04% tripan blu in un tubo di 1 ml Eppendorf. Nota: altre appropriato delle cellule diluizionezioni possono anche essere utilizzati. </li><li> Pipetta su e giù per miscelare la sospensione. 10 L delle cellule / trypan miscela blu è trasferito a emocitometro per contare la densità delle cellule. </li><li> Le cellule sono placcati in completo medio NSC (una miscela di media NSC basale e NSC supplemento di proliferazione nucleare in un rapporto 9:1) integrata con 20ng/ml EGF, bFGF 10ng/ml e 1μl/ml dello 0,2% eparina (2μg/ml) in appropriato tessuto cultura navi. Ml 5, 20 e 40 di media è utilizzato per fiaschi T25, T80 e T175, rispettivamente. Gli antibiotici possono essere aggiunti al mezzo ad una concentrazione di 1:100 per diminuire la possibilità di contaminazione. </li><li> Il pallone viene posto in un incubatore a 37 ° C e 5% di CO 2. </li></ol> 4. Passaging e l&#39;espansione del GBM sfere derivati: <ol><li> Quando il neurosfere raggiunto una dimensione media di 150-200 micron di diametro, la cultura è pronto per sottocultura. Il contenuto di ciascun pallone viene rimosso e collocato in una dimensione appropriata TISS steriletubo cultura ue, e centrifugati a 800 giri (110 g) per 5 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Il surnatante viene rimosso e il pellet viene risospeso in 1 ml di 0,05% tripsina-EDTA. </li><li> Per ottenere un tripsinizzazione ottimale, la sospensione cellulare viene incubato a 37 ° C a bagnomaria per 2-3 min. Per interrompere l&#39;attività tripsina un uguale volume di inibitore della tripsina di soia viene aggiunta alla sospensione cellulare e la sospensione cellulare viene delicatamente pipettato su e giù. </li><li> La sospensione cellulare viene centrifugata a 800 rpm (110g) per 5 min. Poi, il surnatante viene rimosso e le cellule sono risospese in 1 ml di terreno NSC. </li><li> Un conteggio delle cellule viene eseguita come descritto in precedenza. </li><li> Le cellule sono placcati in una concentrazione di 5x10 4 cellule / ml in totale medio NSC completato con fattori di crescita e placcato in vasi di dimensioni adeguate alla coltura di tessuti come descritto nella parte precedente. </li><li> Neurosfere secondarie si formano in 7-10 giorni, quando incubato a 37 ° C in ambienti umidiified incubatore con il 5% di CO 2. </li></ol> 5. Rappresentante dei risultati: Dopo la placcatura singole cellule raccolte dal tessuto tumorale GBM, tumore-come le cellule staminali proliferare e generare piccoli gruppi di cellule composto da poche cellule in 3-4 giorni (vedi il video e la Figura 1). Come questi gruppi crescono, acquisiscono una forma più sferica in modo che entro 7-8 giorni, sfere in fase corretta luminoso con un diametro medio di 150-200 micron forma (Guarda il video e la Figura 2). A maggiore ingrandimento, sfere sano di solito dimostrare microspikes alla loro periferia. Avendo grande sfera come grappoli in 1-2 giorni dopo l&#39;inizio della cultura è dovuta alla presenza di non dissociati aggregati al binging della cultura e non deve essere scambiato come sfere vero. La quantità di detriti nel campo del tumore primario cultura varia a seconda della fonte iniziale del tessuto e se non si include qualsiasi tessuto cerebrale circostante. La corretta tessuto tecniche di preparazionecompresi dissociazione enzimatica e meccanica, e successive di filtrazione del campione con una quantità sufficiente di media può portare a meno detriti nella cultura. <img src="/files/ftp_upload/3633/3633fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Primaria cultura sfera GBM 4 giorni dopo la placcatura. Tumore-come le cellule staminali proliferare e generare piccoli gruppi di cellule in 3-4 giorni. Ingrandimento originale; 20x. <img src="/files/ftp_upload/3633/3633fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Passage una cultura sfera GBM 8 giorni dopo placcatura. Ingrandimento originale; 20x.

<ol><li>Reynolds, B. A., Weiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+neurons+and+astrocytes+from+isolated+cells+of+the+adult+mammalian+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system.</a> Science. 255, 1707-1710 (1992).</li>
<li>Siebzehnrubl, F. A., Vedam-Mai, V., Azari, H., Reynolds, B. A., Deleyrolle, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+Characterization+of+Adult+Neural+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22+Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation and Characterization of Adult Neural Stem Cells.</a> Methods Mol Biol. 750, 61-77 (2011).</li>
<li>Azari, H., Rahman, M., Sharififar, S., Reynolds, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+Expansion+of+the+Adult+Mouse+Neural+Stem+Cells+Using+the+Neurosphere+Assay%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay.</a> J. Vis. Exp. (45), e2393-e2393 (2010).</li>
<li>Azari, H., Sharififar, S., Rahman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishing+Embryonic+Mouse+Neural+Stem+Cell+Culture+Using+the+Neurosphere+Assay%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Establishing Embryonic Mouse Neural Stem Cell Culture Using the Neurosphere Assay.</a> J. Vis. Exp. (47), e2457-e2457 (2011).</li>
<li>Eramo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+expansion+of+the+tumorigenic+lung+cancer+stem+cell+population%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Differ%22%5BJournal%5D)">Identification and expansion of the tumorigenic lung cancer stem cell population.</a> Cell Death Differ. 15, 504-514 (2008).</li>
<li>Patrawala, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+purified+CD44%2B+prostate+cancer+cells+from+xenograft+human+tumors+are+enriched+in+tumorigenic+and+metastatic+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Highly purified CD44+ prostate cancer cells from xenograft human tumors are enriched in tumorigenic and metastatic progenitor cells.</a> Oncogene. 25, 1696-1708 (2006).</li>
<li>Li, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrinsic+resistance+of+tumorigenic+breast+cancer+cells+to+chemotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Natl.+Cancer.+Inst%22%5BJournal%5D)">Intrinsic resistance of tumorigenic breast cancer cells to chemotherapy.</a> J Natl. Cancer. Inst. 100, 672-679 (2008).</li>
<li>Galli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+tumorigenic%2C+stem-like+neural+precursors+from+human+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of tumorigenic, stem-like neural precursors from human glioblastoma.</a> Cancer Res. 64, 7011-7021 (2004).</li>
<li>Deleyrolle, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+label-retaining+tumour-initiating+cells+in+human+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Evidence for label-retaining tumour-initiating cells in human glioblastoma.</a> Brain. 134, 1331-1343 (2011).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Per isolare staminali neurali e cellule progenitrici da adulto normale e il cervello del feto 1, 2, 3, 4 e anche tumore-come le cellule staminali dai tessuti tumorali come il polmone 5, 6 della prostata, della mammella e del cervello 7 8, 9 il test neurosfere è stato frequentemente utilizzati come metodo di scelta. Da questo test semplice e riproducibile, si può generare un numero indefinito di cellule dal tessuto tumorale asportato che mostrano caratteristiche simili a quelle delle cellule staminali somatiche; multipotenza ex vivo, la possibilità di creare nuovi tumori al momento dell&#39;impianto, e di auto-rinnovamento. Queste cellule potrebbero essere usate per studiare la biologia di base delle cellule tumorali tra cui cellula-cellula interazioni, e la differenziazione, migrazione, invasione e morte cellulare. Inoltre, isolato tumore-come le cellule staminali di fornire uno strumento prezioso per studiare come si formano i tumori, il progresso, e la ricaduta e anche per svelare i meccanismi alla base derivanti cellulari che alla fine potrebbe fornire spunti per terapeuticoopzioni.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente </td><td> Tipo </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Commenti </td></tr><tr><td> NeuroCult NSC medio basale (Human) </td><td> Medio </td><td> Stem Cell Technologies </td><td> 05750 </td><td></td></tr><tr><td> NeuroCult NSC Supplementi proliferazione (Human) </td><td> Supplemento media </td><td> Stem Cell Technologies </td><td> 05753 </td><td></td></tr><tr><td> 0,05% tripsina-EDTA </td><td> Reagente </td><td> Gibco </td><td> 25300-062 </td><td></td></tr><tr><td> * MEM </td><td> Reagente </td><td> Gibco </td><td> 41500-018 </td><td> HEM componente </td></tr><tr><td> * HEPES </td><td> Reagente </td><td> Sigma </td><td> H4034 </td><td> HEM componente </td></tr><tr><td> * Acqua distillata </td><td> Reagente </td><td&gt; Gibco </td><td> 15230-147 </td><td></td></tr><tr><td> ** DNasi I </td><td> Reagente </td><td> Roche </td><td> 104159 </td><td></td></tr><tr><td> ** Soia inibitore della tripsina </td><td> Reagente </td><td> Sigma </td><td> T6522 </td><td></td></tr><tr><td> Pen / Strep </td><td> Reagente </td><td> Gibco </td><td> 15140-122 </td><td></td></tr><tr><td> N. 10 lame bisturi </td><td> Strumento chirurgico </td><td> BD </td><td> 371610 </td><td></td></tr><tr><td> Petri Dish </td><td> Cultura software </td><td> BD Falcon </td><td> 353003 </td><td></td></tr><tr><td> Pinzetta </td><td> Strumenti chirurgici </td><td> Strumenti Scienza multa </td><td> 11050-10 </td><td></td></tr><tr><td> Cellulare filtro </td><td> Setaccio </td><td> BD Falcon </td><td> 352340 </td><td></td></tr><tr><td> T25 fiasco </td><td> Cultura software </td><td> Nalge Nunc internazionale </td><td> 136196 </td><td></td></tr><tr><td> T80 fiasco </td><td> Cultura software </td><td> Nalge Nunc internazionale </td><td> 178905 </td><td></td></tr><tr><td> Provette da 15 ml </td><td> Cultura software </td><td> BD Falcon </td><td> 352096 </td><td></td></tr><tr><td> 50 ml provette </td><td> Cultura software </td><td> BD Falcon </td><td> 352070 </td><td></td></tr><tr><td> FEG </td><td> Fattore di crescita </td><td> R &amp; S </td><td> 2028-EG </td><td></td></tr><tr><td> b-FGF </td><td> Fattore di crescita </td><td> R &amp; S </td><td> 3139-FB </td><td></td></tr><tr><td> Eparina </td><td> Fattore di crescita </td><td> Sigma </td><td> H4784 </td><td> Ricostituita in PBS </td></tr></tbody></table> * Per fare HEM, mescolare pacchetto 1x10L di MEM and160ml di HEPES 1M e portare il volume a 8,75 L con acqua distillata. Impostare il PH finale a 7,4 unod conservarlo a 4 ° C. ** Per preparare soluzione inibitore della tripsina, per prima cosa 10 ml di soluzione di DNasi I (100 mg DNasi sciolto in 100 ml di HEM) e aggiungere 0,14 g di inibitore della tripsina alla soluzione di DNasi e, infine, portare al volume di 1 litro con HEM. Mantenere aliquote dei prodotti finali in congelatore -20 ° C.

isolamento ed espansione di cellule umane glioblastoma multiforme tumore del saggio di neurosfere

Isolation and Expansion of Human Glioblastoma Multiforme Tumor Cells Using the Neurosphere Assay

-Come le cellule staminali sono state isolate nei tumori come mammella, polmone, colon, prostata e cervello. Un problema critico in tutti questi tumori, soprattutto in mutliforme glioblastoma (GBM), è quello di identificare e isolare popolazione di cellule tumorali di iniziare (s) per studiare il loro ruolo nella formazione del tumore, la progressione e le recidive. Tumore comprensione iniziare popolazioni di cellule fornirà gli indizi per trovare approcci terapeutici efficaci per questi tumori. Il test neurosfere (NSA) per la sua semplicità e la riproducibilità è stata utilizzata come metodo di scelta per l&#39;isolamento e la propagazione di molte di queste cellule tumorali. Questo protocollo viene illustrato il metodo neurosfere cultura per isolare ed espandere cellule staminali, come in chirurgicamente asportato tessuto tumorale umano GBM. Le procedure comprendono una digestione iniziale dissociazione chimica e meccanica del tessuto tumorale e, successivamente, placcatura la sospensione risultante singola cellula in coltura NSA. Dopo 7-10 giorni, neurosfere primarie del 150-200 micron di diametro può essere osservato e sono pronti per un ulteriore passaging ed espansione.

Questo protocollo video dimostra l&#39;isolamento e l&#39;espansione delle cellule staminali come da chirurgicamente asportato mutliforme glioblastoma umano (GBM) tessuti tumorali utilizzando il metodo neurosfere cultura test.

Isolamento ed espansione di cellule umane Glioblastoma Multiforme Tumore del saggio di neurosfere

Cellule di tipo staminale sono state isolate in tumori quali quelli della mammella, del polmone, del colon, della prostata e del cervello. Una questione critica in tutti questi tumori, specialmente in...

Lo scopo di questo protocollo è l'isolamento e l'espansione di cellule tumorali umane di glioblastoma multiforme mediante l'utilizzo del metodo delle neurosfere. Questo viene ottenuto prima tritando il tessuto tumorale raccolto, seguito da dissociazione meccanica, e infine piastrando le cellule risultanti per farle crescere in coltura di neurosfere. In questo video, mostreremo come isolare ed espandere cellule simili a cellule staminali da tessuto tumorale umano di glioblastoma utilizzando il metodo di coltura delle neurosfere.Questo metodo può essere utilizzato anche per coltivare cellule provenienti da altri tumori cerebrali e da tumori solidi come quelli del seno, della prostata, del fegato e del polmone. Ok, iniziamo. Dopo aver ricevuto il tessuto tumorale di GBM resecato chirurgicamente, il mezzo viene rimosso.Il tumore viene lavato due o tre volte utilizzando PBS sterile per rimuovere contaminanti come sangue e detriti. Dopo il lavaggio, posizionare il tumore resecato in una piastra di Petri sterile. Per prima cosa, tagliare il tumore in porzioni più piccole, quindi trasferire una porzione di tessuto tumorale in una piastra di Petri separata e tritare il tessuto usando un bisturi numero 10 in piccoli pezzi.Questo aumenterà la superficie disponibile per la dissociazione enzimatica. Il tritamento può richiedere da uno a tre minuti, a seconda delle dimensioni del tumore. Aggiungere ora da tre a cinque ml di tripsina preriscaldata al tessuto tritato e trasferirlo in un tubo falcon sterile da 15 ml.Posizionare il tubo da 15 ml in un bagno d'acqua a 37 gradi per 10-15 minuti. Agitare il tubo ogni cinque minuti. Per garantire una migliore digestione del tessuto, aggiungere un volume uguale di inibitore della tripsina per arrestare la reazione.Per garantire l'attivazione della tripsina, pipettare su e gi&ugrave; diverse volte. Centrifugare la sospensione a 800 RRP M o 110 G per cinque minuti. Rimuovere il soprannatante, quindi risospendere il pellet in un ml di mezzo basale per cellule staminali neurali, appoggiando la punta contro il fondo del tubo.Pipettare su e gi&ugrave; da tre a sette volte per rompere gli aggregati fino a ottenere una sospensione lattiginosa; un eccesso di pipettaggio potrebbe causare la morte cellulare. Posizionare un filtro da 40 micron su un tubo da 50 ml. Aggiungere ora 10-15 ml di mezzo basale alla sospensione cellulare e mescolare delicatamente, quindi far passare la sospensione cellulare attraverso il filtro da 40 micron per rimuovere detriti e aggregati non associati.PT le cellule e aspirare il soprannatante. Ri-sospendere le cellule in uno o due ml di mezzo completo. Quindi pipettare delicatamente su e gi&ugrave; per omogeneizzare la sospensione.Mescolare 10 microlitri di sospensione cellulare in 90 microlitri di blu di trian. Mescolare accuratamente la sospensione e trasferire 10 microlitri nel emocitometro. Eseguire un conteggio cellulare come mostrato qui.È necessaria una sospensione di singole cellule senza grumi per ottenere un conteggio cellulare accurato. Non includere le cellule positive al trian blu. Durante il conteggio per la semina delle cellule in una fiasca T 80.Aggiungere 20 ml di mezzo completo per cellule staminali neurali in un tubo da 50 ml. Aggiungere la quantità appropriata di sospensione cellulare per raggiungere una densità di 200.000 cellule per ml. Aggiungere ora EGF per ottenere una concentrazione finale di 20 nanogrammi per ml.Aggiungere eparina 0,2% alla concentrazione di un microlitro per ml. Infine, aggiungere BFGF per raggiungere una concentrazione finale di 10 nanogrammi per ml. Mescolare le cellule in mezzo completo integrato con fattori di crescita.Quindi trasferire la sospensione in un flacone T 80. Il flacone va poi trasferito nell'incubatrice a 37 gradi Celsius e 5%CO2 per sette-dieci giorni. Dopo otto giorni di coltura, le sfere sono completamente sviluppate e pronte per essere sottoposte a passaggio.Raccogliere il contenuto del matraccio e trasferirlo in una centrifuga da 50 ml. Centrifugare le cellule a 800 giri al minuto per cinque minuti. Aspirare il soprannatante, quindi risospendere il pellet in 1 ml di tripsina preriscaldata.Incubare le cellule in bagnomaria a 37 gradi Celsius per due minuti. Aggiungere una quantità equimolare di inibitore della tripsina e mescolare accuratamente per assicurare un'attivazione. Successivamente, centrifugare le cellule per ottenere il pellet.Rimuovere il soprannatante e risospendere le cellule in 1 ml di mezzo completo, pipettando delicatamente su e giù per omogeneizzare la sospensione cellulare. Eseguire un conteggio cellulare come descritto in precedenza per seminare le cellule in una fiasca T80 con 20 ml di mezzo completo in un tubo da 50 ml. Aggiungere una quantità appropriata di sospensione cellulare per raggiungere una densità di 50.000 cellule per ml.Ora aggiungere i fattori di crescita, inclusi E-G-F-B-F-G-F e eparina, alla concentrazione descritta in precedenza. Mescolare delicatamente la sospensione cellulare ottenuta, quindi trasferire la sospensione in una fiasca T 80 e collocarla nell'incubatore per sette-dieci giorni. Ecco un esempio di coltura primaria di GBM.Dopo quattro giorni a questo stadio, si possono osservare le cellule che proliferano e iniziano a formare sfere. A questo stadio non si dovrebbero osservare grandi aggregati sferici di cellule, che sarebbero il risultato di una preparazione inadeguata del tessuto.Dopo essere stati coltivati per sette-dieci giorni, si sono formati sferoidi di dimensioni variabili; quando i sferoidi hanno raggiunto un diametro medio di 150-200 micron, sono pronti per essere sottoposti a passaggio. Questo è un esempio di coltura di passaggio di GBM dopo otto giorni. Ancora una volta, è possibile osservare sferoidi di dimensioni diverse; i sferoidi sani presentano microspine sulla loro periferia.La preparazione di una sospensione di singole cellule è un aspetto molto importante in ogni coltura di sferoidi. In caso contrario, si potrebbero osservare aggregati cellulari già il giorno successivo al seeding delle cellule. Questi aggregati potrebbero essere considerati sferoidi, ma va precisato che sono necessarie almeno una settimana affinché le cellule formino veri e propri sferoidi.La quantità di detriti nella coltura di sferoidi tumorali primari varia in base a molti fattori, come la provenienza del tessuto, la precisione con cui il tessuto è stato asportato e la tecnica di elaborazione del tessuto. Speriamo che questo video sia utile e vi auguriamo buona fortuna nei vostri esperimenti.

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Questo protocollo video viene illustrato il metodo di analisi per generare neurosfere ed espandere le cellule staminali neurali adulte provenienti dalla regione periventricolare del mouse, e fornisce approfondimenti tecnici per garantire la si può raggiungere culture neurosfere riproducibile.

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Questo video dimostra il test di invasione delle cellule staminali tumorali cerebrali (BTSC) in vitro per determinare l'effetto del trattamento farmacologico sulla capacità di invasione delle BTSC dalla neurosfera tramite la tecnica di imaging di cellule vive.

Saggio di invasione della neurosfera con cellule staminali tumorali cerebrali (BTSC): un test in vitro per analizzare l'effetto del trattamento farmacologico sull'invasione di BTSC dalla neurosfera

Protocollo per la propagazione di campioni chirurgici di glioma dissociati di alta qualità nel mezzo della neurosfera privo di siero da selezionare per le cellule con fenotipo delle cellule staminali tumorali. Per gli esemplari che non riescono a crescere come neurosfere, viene suggerito un protocollo alternativo. Viene descritta una tecnica di incorporamento della paraffina per mantenere l'architettura della neurosfera 3D per l'immunocitochimica.

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Qui presentiamo un sistema di coltura motrice mista ex-vivo per lo studio della migrazione delle cellule glioma umane (hGC) in tempo reale. Questo modello fornisce la capacità di osservare le interazioni tra hGC e assoni mielinati e non mielinati all'interno di una camera compartimentata.

Monitoraggio in tempo reale della migrazione delle cellule del Glioma umano sulle coculture di Asse-Olgon-Oligodendroce

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Isolamento ed espansione delle neurosfere dalle nicchie neurogeniche del topo postnatali (P1-3)

La microdissezione laser (LMD) è una tecnica sensibile e altamente riproducibile che può essere utilizzata per scoprire percorsi che mediano l'eterogeneità e l'invasione del glioma. Qui, descriviamo un protocollo ottimizzato per isolare le aree discrete dal tessuto glioma utilizzando LMD laser seguito da analisi trascrittomica.

Microdissezione di cattura laser delle sottoregioni del Glioma per la caratterizzazione spaziale e molecolare dell'eterogeneità intratutuale, dell'Oncoflusso e dell'invasione

Qui, descriviamo un assaggio di invasione facile da usare per il glioblastoma. Questo test è adatto per cellule staminali del glioblastoma. Viene descritta anche una macro Fiji per una facile quantificazione dell'invasione, della migrazione e della proliferazione.

Un modello spheroid 3D per Glioblastoma

Presentiamo un modello di migrazione del glioblastoma 3D utilizzando gliomasfere magnetiche derivate dal paziente generate da tumori appena diagnosticati e ricorrenti. Questa piattaforma consente la visualizzazione delle dinamiche migratorie specifiche del paziente e la valutazione dell'efficacia terapeutica. Il saggio può essere multiplexato dopo la migrazione per valutare la localizzazione e i modelli di espressione delle proteine.

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Isolamento ed espansione di cellule umane Glioblastoma Multiforme Tumore del saggio di neurosfere

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