Name: Il CYP2D6 modello animale: come indurre epatite autoimmune in topi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-02-03T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 3 s
Description: Scopri come indurre epatite autoimmune in topi usando un adenovirus che esprime CYP2D6. Questo modello animale replica l'infiammazione cronica del fegato e le risposte immunitarie osservate nei pazienti umani.

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Questo lavoro è supportato dall&#39;Università Goethe Hospital Francoforte e una sovvenzione della Fondazione tedesca per la ricerca di UC

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<li>Christen, U., Hintermann, E., Holdener, M., von Herrath, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+triggers+for+autoimmunity%3A+is+the+%27glass+of+molecular+mimicry%27+half+full+or+half+empty%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Autoimmun%22%5BJournal%5D)">Viral triggers for autoimmunity: is the 'glass of molecular mimicry' half full or half empty.</a> J. Autoimmun. 34, 38-44 (2010).</li>
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<li>Hintermann, E., Bayer, M., Pfeilschifter, J., Christen, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenoviral+delivery+of+the+liver+autoantigen+cytochrome+P450+2D6+chronically+activates+hepatic+stellate+cells+and+induces+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Manuscript+Submitted%22%5BJournal%5D)">Adenoviral delivery of the liver autoantigen cytochrome P450 2D6 chronically activates hepatic stellate cells and induces fibrosis.</a> Manuscript Submitted. , (2011).</li>
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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

In studi precedenti, l&#39;epatite sperimentale è stato spesso segnalato per essere solo transitori e molti modelli attuali di una patologia epatica autoimmune dipende da una malattia piuttosto complessi protocolli di induzione (per una rassegna si veda 3,5). Ad esempio, parecchi modelli utilizzare topi transgenici esprimendo antigeni bersaglio specifici e adoptively trasferiti bersaglio antigene-specifici, per lo più TcR-transgenici, cellule T 14,15. Spesso un&#39;infezione supplementare con virus livertropic, batteri o parassiti è necessario di indurre la malattia 16-18. In alternativa, DNA-vaccinazione con plasmidi codificanti per antigeni bersaglio, compresi CYP2D6 19, viene usato per indurre epatite. Tuttavia, una vaccinazione supplementare con plasmidi codificano per pro-infiammatorie citochine, come IL-12, le è richiesto 20. Purtroppo, con poche eccezioni 15,20 epatite è solo transitoria. Il modello di CYP2D6 6,21 utilizza un metodo semplice tO indurre epatite autoimmune semplicemente infettando i topi con un adenovirus esprimere hCYP2D6, l&#39;autoantigene importante EAI-2 7,8. Consegna di CYP2D6 da uno costrutto adenovirus garantisce sia un targeting diretto del fegato nonché una infiammazione locale che promuove la ripartizione di tolleranza. È importante notare tuttavia che sia il titolo virus così come la via di somministrazione è fondamentale per questo modello. Da un lato, Ad-2D6 è un virus replicazione deficiente, così, un titolo sufficiente elevato di virus è richiesto per generare una quantità critica di antigene all&#39;interno del fegato. D&#39;altra parte, troppo alto un titolo potrebbe comportare una fatale insufficienza epatica acuta. Inoltre, è stato dimostrato precedentemente che infezione di topi da parte di alti titoli di adenovirus porta ad un esaurimento funzionale della risposta immunitaria 22. Nel nostro modello, abbiamo usato una combinazione di infezione endovenosa e intraperitoneale al fine di ottenere sia infiltrazione cronica cellulare nonché extfibrosi ensive. Abbiamo osservato che l&#39;infezione endovenosa sola provoca ancora massiccia infiltrazione cellulare, ma nessuna fibrosi della regione sottocapsulare, indicando che infiammazione peritoneale a causa dell&#39;iniezione intraperitoneale potessero essere coinvolti in il continuo accumulo sottocapsulare di collagene (Hintermann &amp; Christen, manoscritto in preparazione). Tuttavia, è importante notare che la fibrosi epatica osservata è antigene-specifica, poiché non abbiamo fatto rilevare attivazione delle cellule stellate epatiche e della deposizione collagene dopo infezione con pari virus dei titoli-di Ad-GFP o Ad-Control 23. Il CYP2D6 modello riflette molti aspetti della umana 1,2 AIH, come ad esempio l&#39;epatite cronica, caratterizzata da persistente infiltrazione cellulare e fibrosi epatica 6. Inoltre, la presenza di high-titoli anticorpali anti-CYP2D6 anticorpi con specificità di epitopo simili e diffondendo 13 a LKM-1 anticorpi trovati in AIH-2 pazienti indica la preza di una comune reattività cronica autoimmune. CYP2D6 è il principale antigene in AIH-2, ma esso non viene riconosciuto da pazienti diagnosticati con il più frequente tipo 1 AIH. Inoltre, i pazienti affetti da altre malattie del fegato ad eziologia autoimmune, come la cirrosi biliare primaria (PBC) o colangite sclerosante primaria (PSC), di generare caratteristici autoanticorpi con specificità per autoantigeni fegato distinte e il loro fegato mostrano differenti caratteristiche patologiche di centraggio sulle piccole (PBC ) o grande (PSC) dotti biliari. Tuttavia, i modelli CYP2D6 offre l&#39;opportunità di analizzare i meccanismi coinvolti nei processi di immunopathogenic epatiche infiammatorie croniche che si manifestano nel corso delle malattie autoimmuni del fegato, per identificare i giocatori chiave che guidano la distruzione autoimmune di epatociti e valutare possibili interventi terapeutici per curare la malattia.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome dell&#39;apparecchiatura </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Comments </td></tr><tr><td> Ago 23G </td><td> BD Biosciences </td><td> 300800 </td><td></td></tr><tr><td> 27 ½ G ago </td><td> VWR </td><td> 612-0151 </td><td></td></tr><tr><td> 30 ago ½ G </td><td> BD Biosciences </td><td> 304000 </td><td></td></tr><tr><td> Strisce reattive alanina aminotransferasi (GPT / ALT) </td><td> Roche Diagnostics </td><td> 10 745 138 202 </td><td></td></tr><tr><td> Strisce reattive aspartato aminotransferasi (GOT / AST) </td><td> Roche Diagnostics </td><td> 10 745 120 202 </td><td></td></tr><tr><td> Anestesia Unità Univentor 400 </td><td> <a href="http://www.agnthos.se" target="_blank" >AgnTho di</a> </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Stampi di base, 37x24x10 mm e getta </td><td> VWR </td><td> 720-0208 </td><td></td></tr><tr><td> Cella filtro 70 millimetri </td><td> VWR </td><td> 734-0003 </td><td></td></tr><tr><td> Criostato </td><td> Leica </td><td> CM1850 UV </td><td></td></tr><tr><td> Eparinizzati tubi capillari </td><td> Pescatore </td><td> 3123987 </td><td></td></tr><tr><td> Vetrini SuperFrost Plus </td><td> Menzel Gläser </td><td> J1800AMNZ </td><td></td></tr><tr><td> Microtainer SST tubi </td><td> BD Biosciences </td><td> 365951 </td><td></td></tr><tr><td> Micropiastre, V-fondo </td><td> VWR </td><td> 391-1924 </td><td></td></tr><tr><td> Reflotron Plus. </td><td> Roche Diagnostics </td><td></td><td> Determiniation di siero AST / ALT </td></tr><tr><td colspan="4"></td></tr><tr><td> Nome of il reagente </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Comments </td></tr><tr><td> Coniglio anti-topo anti-Collagene di tipo I IgG, </td><td> Chemicon </td><td> AB765P </td><td></td></tr><tr><td> Biotinilato di capra anti-IgG di coniglio </td><td> Vector (AXXORA) </td><td> VC-BA-1000-MC15 </td><td></td></tr><tr><td> FITC-coniugato anticorpo anti topo CD8a </td><td> Southern Biotech </td><td> 1550-1502 </td><td></td></tr><tr><td> PE-coniugato anti topo IFNy </td><td> BD Biosciences </td><td> 554412 </td><td></td></tr><tr><td> PE-coniugato anti-topo CD16/CD32 anticorpo (FcR blocco) </td><td> BD Biosciences </td><td> 553141 </td><td></td></tr><tr><td> Aquatex </td><td> VWR </td><td> 1.08562.0050 </td><td></td></tr><tr><td> Avidina / biotina Blocco kit </td><td&gt; Vettore (AXXORA) </td><td> VC-SP-2001-KI01 </td><td></td></tr><tr><td> A brefeldina </td><td> Sigma </td><td> B6542 </td><td></td></tr><tr><td> Collagenasi IV </td><td> Sigma </td><td> C5138-100mg </td><td></td></tr><tr><td> DAB substrato kit 3&#39;3&#39;diaminobenzidine </td><td> Vector (AXXORA) </td><td> VC-SK-4100-KI01 </td><td></td></tr><tr><td> DNasi </td><td> Sigma </td><td> DN-25 </td><td></td></tr><tr><td> Elite ABC reagente </td><td> Vector (AXXORA) </td><td> VC-PK-7100-L050 </td><td></td></tr><tr><td> Eosina G / G soluzione </td><td> Roth </td><td> X883.1 </td><td></td></tr><tr><td> Siero fetale bovino (FCS) </td><td> Biochrom AG </td><td> S 0115 </td><td></td></tr><tr><td> Isofluran </td><td> Forene </td><td> B506 </td><td></td></tr><tr><td> Meyer Ematossilina soluzione </td><td> Industry </td><td> A4840, 1000 </td><td></td></tr><tr><td> Ottobre Compound </td><td> Sakura Finetek Europa </td><td> 4583 </td><td></td></tr><tr><td> PBS-tamponata formaldeide 10% </td><td> Roth </td><td> A146.3 </td><td></td></tr><tr><td> Percoll </td><td> Amersham </td><td> 17-0891-01 </td><td></td></tr><tr><td> Roti-Histokit </td><td> Roth </td><td> 6.638,1 </td><td></td></tr><tr><td> RPMI </td><td> Invitrogen </td><td> 61870 </td><td></td></tr><tr><td> Saponina dalla corteccia Quillaja </td><td> Sigma </td><td> S7900 </td><td></td></tr></tbody></table>

il cyp2d6 modello animale: come indurre epatite autoimmune in topi

The CYP2D6 Animal Model: How to Induce Autoimmune Hepatitis in Mice

L&#39;epatite autoimmune è una malattia rara ma pericolosa per la vita autoimmune del fegato di 1,2 eziologia sconosciuta. In passato, i tentativi numerosi sono stati fatti per generare un modello animale che riflette le caratteristiche della malattia umana 3-5. Tuttavia, in vari modelli la induzione di malattia era piuttosto complessa e spesso epatite era solo transitoria 3-5. Pertanto, abbiamo sviluppato un modello semplice topo che utilizza l&#39;autoantigene maggiore umano in tipo 2 epatite autoimmune (AIH-2), cioè hCYP2D6, come un trigger 6. Di tipo 1 di fegato e rene anticorpi microsomiali (LKM-1) anticorpi che riconoscono hCYP2D6 sono il segno distintivo di EAI-2 7,8. Consegna di tipo selvatico hCYP2D6 in FVB o C57BL / 6 topi era da un costrutto Adenovirus (Ad-2D6) che assicura una consegna diretta dell&#39;antigene di attivazione al fegato. Così, l&#39;infiammazione conseguente locale genera un campo fertile 9 per il successivo sviluppo di autoimmunità. A combination di iniezione endovenosa e intraperitoneale di Ad-2D6 è la via più efficace per indurre un danno a lungo termine autoimmune al fegato (sezione 1). Qui forniamo un protocollo dettagliato su come autoimmune malattia epatica viene indotta nel modello CYP2D6 e come i differenti aspetti di danno epatico può essere valutata. In primo luogo, i livelli sierici di markers che indicano distruzione epatociti, come aminotransferasi, nonché i titoli di hCYP2D6 anticorpi sono determinate campionando sangue retroorbitaly (sezione 2). In secondo luogo, il hCYP2D6-specifica risposta di cellule T è caratterizzata da raccogliendo linfociti dalla milza e il fegato. Al fine di ottenere linfociti fegato puri, i fegatini sono perfusi dalla PBS attraverso la vena portale (sezione 3), digerito in collagene e purificato su un gradiente di Percoll (sezione 4). La frequenza di hCYP2D6 specifiche cellule T viene analizzato dalla stimolazione con hCYP2D6 peptidi e l&#39;identificazione delle cellule che producono IFN-mediante citometria di flusso (sezione 5). Terzo,infiltrazione cellulare e fibrosi è determinata dalla immunoistochimica su sezioni di fegato (sezione 6). Regime Tale analisi dovrà essere condotta in diversi momenti dopo l&#39;inizio della malattia al fine di dimostrare la natura cronica del modello. La grandezza della risposta immunitaria caratterizzata dalla frequenza e l&#39;attività di hCYP2D6-specifici T e / o cellule B e il grado del danno epatico e fibrosi devono essere valutati per una successiva valutazione di possibili trattamenti per prevenire, ritardare o abrogare la autodestructive processo del fegato.

Infezione di topi con uno Adenovirus che esprime il autoantigene maggiore umano citocromo P450 2D6 (hCYP2D6) riconosciuti da sieri di pazienti affetti da di tipo 2 risultati epatite autoimmune in una forma persistente di autoimmune-mediata malattia epatica caratterizzata da estensiva epatite, fibrosi e la generazione di uno CYP2D6 -specifica risposta immunitaria.

Il CYP2D6 modello animale: come indurre epatite autoimmune in topi

L'epatite autoimmune è una malattia autoimmune del fegato rara ma potenzialmente letale, di eziologia sconosciuta1,2. In passato sono stati fatti numerosi tentativi per...

L'obiettivo generale dei seguenti esperimenti è generare e verificare un modello murino di epatite autoimmune, una malattia epatica autoimmune umana caratterizzata da un'infiammazione cronica dell'interfaccia epatica, epatite, ipergammaglobulinemia e produzione di autoanticorpi distintivi. Gli animali vengono innanzitutto infettati con un costrutto adenovirale che esprime l'autoantigene responsabile della malattia, CYP2D6, per indurre un'infiammazione locale all'interno del fegato. Successivamente, i linfociti epatici vengono isolati mediante perfusione epatica e centrifugazione su gradiente di densità differenziale. Infine, il danno epatico e l'identificazione dei linfociti T specifici per l'autoantigene possono essere valutati rispettivamente mediante immunoistochimica e colorazione intracellulare per citochine.Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti è che il nostro modello di epatite autoimmune è caratterizzato da un'infiammazione cronica del fegato e da una risposta immunitaria specifica per l'antigene autoimmunitario quasi identica a quella osservata in individui umani affetti da epatite autoimmune di tipo due. Il nostro modello può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo delle malattie epatiche autoimmuni, come ad esempio in che modo si determina la distruzione progressiva del fegato nei pazienti con epatite autoimmune. Generalmente, con il metodo delle provette, incontriamo difficoltà nell'eseguire infezioni endovenose e prelievi ematici attraverso il seno venoso oftalmico, nonché nella perfusione del fegato, attività che richiedono una buona pratica da parte dell'operatore.Dopo aver anestetizzato, tenere il topo per la nuca e tendere la pelle lenta della testa con il pollice e il dito medio. Osservare come, in questa posizione, l'occhio sporga leggermente a causa della trazione della pelle adiacente all'occhio. Posizionare ora l'ago al cantus mediale, all'innesto di una delle palpebre più vicina al naso dell'animale, e iniettare lentamente 100 microlitri della soluzione virale 80 2D six.Quindi ritirare leggermente l'ago e chiudere le palpebre. Iniziare riempiendo una siringa da cinque millilitri con PBS freddo e applicando un ago da 27 gauge alla siringa. Successivamente, dopo l'eutanasia del topo, praticare un'incisione con le forbici a circa un centimetro dalle zampe posteriori dell'animale, tagliando attraverso i tessuti cutanei e muscolari su entrambi i lati dell'animale fino al diaframma.Quando si raggiunge il diaframma, tirare indietro la pelle e recidere il diaframma dai margini costali con le forbici, quindi dissezionare la vena cava. A questo punto della dissezione, spostare lo stomaco e gli intestini di lato, esponendo la vena porta. La perfusione del fegato è la parte più delicata della procedura, specialmente quando il fegato è cronologicamente infiammato o addirittura fibrotico. Il topo è molto piccolo, quindi è necessaria una mano ferma per pungere con precisione la vena porta.Inoltre, è importante applicare il PBS lentamente, altrimenti il tessuto potrebbe danneggiarsi. Inserire l'ago precedentemente preparato nella vena porta e quindi applicare delicatamente pressione sullo stantuffo della siringa per permettere al PBS di lavare lentamente il sangue dal fegato. Al termine della perfusione, rimuovere il fegato afferrando il diaframma con una pinza e utilizzando le forbici per staccare il diaframma dal corpo.Infine, trasferire l'organo in una piastra di Petri e rimuovere il diaframma, la cistifellea e qualsiasi altro tessuto ancora collegato al fegato. Si noti che il fegato dell'animale affetto da epatite autoimmune è fibrotico e i singoli lobi sono fusi. Iniziare riempiendo una piastra di Petri con 10 millilitri di PPS fresco e ponendola sul ghiaccio.Trasferire il fegato perfuso nella piastra e, utilizzando le forbici, tagliare il tessuto in piccoli pezzi. Successivamente, versare il tessuto e il PBS in un filtro cellulare da 70 micrometri e, usando una pestella di vetro, spingere i pezzi di fegato attraverso il filtro. Versare ora con attenzione 10 millilitri di buffer al collagenasi freddo sui pezzi di tessuto, continuando a utilizzare la pestella secondo necessità.Centrifugare le cellule a 30 ×g per tre minuti a quattro gradi Celsius. Trasferire il soprannatante in una provetta nuova, lasciando cinque millimetri di liquido sopra il pellet; centrifugare a 650 ×g per 10 minuti a quattro gradi Celsius. Scartare tutto tranne gli ultimi tre millimetri del soprannatante.Risospendere il pellet in 20 millilitri di buffer per cellule, quindi dopo aver centrifugato le cellule a 600 ×g per 20 minuti a quattro gradi Celsius, eliminare il soprannatante e risospendere il pellet agitando il tubo, in seguito allo sviluppo di epatite autoimmune persistente dopo l'infezione da adenovirus 2D sei in topi di tipo selvaggio nel modello CYP 2D sei. Il fegato mostra una morfologia apparentemente alterata, come osservato nella figura a destra. In particolare, i lobi epatici sono fusi, come indicato dalle frecce nere, e noduli iperfagici indicati da frecce nere appaiono disseminati su tutto il fegato; è inoltre visibile una massiccia fibrosi capsulare a seguito di infezione con un controllo.L'adenovirus che non esprime la CYP umana 2D sei non ha alcun effetto sulla morfologia epatica, come mostrato nella figura a sinistra. Infiltrazioni cellulari estese e persistenti si osservano nelle regioni periportali e parenchimali del fegato di topi infettati con l'adenovirus 2D sei, ma non in quelli infettati con l'adenovirus di controllo. Si noti la significativa infiltrazione di cellule mononucleate presente soltanto nei topi infettati con l'adenovirus 2D sei, indicata dalle singole frecce nere. Qui.Le triple frecce indicano infiltrazioni cellulari più estese nel parenchima epatico che collegano tratti portali adiacenti. In questa figura si può osservare come la fibrosi si sviluppi prevalentemente nella regione sottocapsulare, con alcuni fasci di collagene che si estendono nel parenchima. Si notino i multipli strati di deposito di collagene al di sotto della capsula epatica, indicati dalle triple frecce nere, con alcuni fasci che si protrudono nel parenchima, come indicato dalle singole frecce, nonché la presenza di grandi aggregati di cellule infiltranti, indicati dalle teste di freccia nere.Una terza caratteristica dell'epatite autoimmune persistente nei topi infettati da adenovirus 2D six è la generazione predominante di linfociti T umani CD4 e CD8 specifici per CYP 2D six con tropismo epatico, come osservato in questi diagrammi a dispersione rappresentativi di colorazione intracellulare per citochine. La stimolazione notturna di linfociti epatic游戏副本Questo modello animale dovrebbe aprire la strada ai ricercatori nel campo delle malattie epatiche autoimmuni per esplorare i fattori chiave che guidano l'infiammazione cronica del fegato e per valutare possibili trattamenti per i pazienti.

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