Semplice e robusta In vivo E In vitro per lo Studio Assemblea Virus

L'obiettivo generale di questa procedura è studiare l'assemblaggio virale in vivo e in vitro. Questo viene ottenuto esprimendo innanzitutto gli RNA del virus della mosaico del malto in batteri ed esponendo questi ultimi a cellule vegetali mediante infiltrazione agroindotta. Successivamente, i virioni del BMV vengono purificati dalle foglie infiltrate.

Quindi vengono preparate le subunità proteiche del capside per l'assemblaggio in vitro. Infine, i Varians del BMV vengono assemblati in vitro utilizzando la proteina del capside e il colorante indocianina verde. In definitiva, i risultati mostrano i Varians del mosaico del malto assemblati in vitro mediante la formazione di fantasmi ottici, che possono essere determinati mediante assorbanza ed emissione di fluorescenza.

Oggi illustreremo una tecnica nota come filtrazione, utile per consegnare componenti virali alle piante. Il principale vantaggio di questa tecnica consiste nell'eliminare la necessità di produrre trascritti in vitro e, al contempo, permette di consegnare più componenti alla stessa cellula, consentendo un'infezione sincronizzata. Il lavoro che stiamo attualmente portando avanti riguarda l'utilizzo del virus del mosaico del broccolo in combinazione con un cromoforo approvato dalla FDA, il verde cianuro, per realizzare un nuovo tipo di nanoparticella per applicazioni biomediche.

E in particolare, il nostro obiettivo è utilizzare questi costrutti, che definiamo fantasmi di filo ottico o OB gs, per modalità di imaging ottico, inclusi imaging fluorescente e imaging fotoacustico, e anche come veicolo per la terapia laser. Un'applicazione clinica specifica che stiamo attualmente perseguendo è l'utilizzo di questi costrutti per l'imaging del cancro ovarico in associazione con procedure intraoperatorie. L'idea è che possiamo funzionalizzare questi costrutti.

Il GOB con il motivo di indirizzamento specifico che può riconoscere le cellule tumorali residue, che nel caso del cancro ovarico possono trovarsi soprattutto nella cavità peritoneale. Da una piastra di agrobatterio precedentemente preparato contenente l'RNA del virus del mosaico bruno uno, due o tre, scegliere una singola colonia per inoculare due millilitri di LB contenenti 50 microgrammi per millilitro di canamicina e 100 microgrammi per millilitro di rifampicina. Incubare la coltura per un giorno a 28 gradi Celsius in un agitatore orbitale a 250 giri al minuto; inoculare 50 millilitri di LB in un matraccio Erlenmeyer da 500 millilitri con un millilitro di coltura e incubare per 16 ore a 28 gradi Celsius in un agitatore orbitale a 250 giri al minuto il giorno successivo. Quando le colture avranno raggiunto un OD 600 di 1,0, trasferirle in provette sterili da 30 millilitri e centrifugare per 10 minuti.

A 5.000 giri/min e quattro gradi Celsius, sciogliere i pellet in 10 millilitri di cloruro di magnesio 10 millimolare e centrifugare per 10 minuti a 5.000 giri/min e quattro gradi Celsius. Ripetere questo passaggio un’altra volta per assicurare la completa rimozione dell'antibiotico. Successivamente, sospendere i pellet in 10 millilitri di tampone contenente MES 10 millimolare e cloruro di magnesio 10 millimolare.

Misurare l'OD a 600 nm per ogni coltura e aggiustare a un OD a 600 nm di 0,1 utilizzando cloruro di magnesio 10 millimolare e MES 10 millimolare. Successivamente, combinare 10 millilitri di ciascuna delle tre sospensioni cellulari con OD 600 pari a 0,1. Aggiungere acetofenone a una concentrazione finale di 100 millimolare.

Mescolare delicatamente e lasciare il composto indisturbato a temperatura ambiente per tre ore. Al termine dell'incubazione, aspirare la coltura in una siringa da un millilitro senza ago. Infiltrare la sospensione della coltura nel lato assiale di due o tre foglie ben espanse di N. benthamiana premendo delicatamente la siringa su metà della superficie abassiale di ciascuna foglia.

Mantenere le piante infiltrate in serra a 24 gradi Celsius per tre o quattro giorni prima della raccolta delle foglie. Dopo aver purificato i virioni del BMV, preparare un litro di buffer di dissociazione del virus 1x. Successivamente, preparare la membrana per dialisi.

Secondo il metodo di Sambrook et al., distribuire da cinque a 10 milligrammi per millilitro di virus purificato in un sacchetto da dialisi e immergere il sacchetto in un matraccio contenente un x virus. Buffer di dissociazione. Eseguire la dialisi del virus per 24 ore a quattro gradi Celsius sotto agitazione.

Raccogliere la soluzione dalla borsa da dialisi e centrifugare a 30.000 giri/min per 30 minuti a quattro gradi Celsius per ottenere un pellet di eventuali particelle virali non associate. Centrifugare il sopranatante a 30.000 giri/min per tre ore a quattro gradi Celsius. Dopo aver preparato i trascritti di RNA da riassociare in virioni, mescolare le subunità della proteina del capside e i trascritti di RNA in un rapporto di uno a cinque.

Distribuire la miscela in un sacchetto da dialisi e chiuderlo accuratamente per evitare perdite. Dopo aver preparato un litro di buffer di assemblaggio dell'RNA 1X, dializzare la miscela della reazione di riasssemblaggio nel buffer a quattro gradi Celsius per 24 ore; il giorno successivo, rimuovere la miscela dal sacchetto da dialisi e aggiungere 1,5 millilitri di buffer di assemblaggio dell'RNA; quindi centrifugare nuovamente a 30.000 giri al minuto per tre ore a quattro gradi Celsius. Successivamente, rimuovere il soprannatante e risospendere il pellet.

Successivamente, stimare la concentrazione di virioni a 260 nanometri di OD. Quindi determinare la concentrazione delle subunità proteiche del capside a 280 nanometri di OD o mediante altri metodi, come il saggio di Bradford, per valutare l'integrità delle subunità proteiche del capside dissociate. Eseguire una SDS-PAGE dal 12 al 15% seguita da western blotting. Infine, seguire la procedura descritta nel protocollo scritto per generare ghost virali ottici o ov cheese.

Qui è mostrata un'immagine al microscopio elettronico a trasmissione di BMV Varion purificato da piante di end hamana agroinfiltrate con una miscela dei tre costrutti agri di tipo selvaggio di BMV, sottoposto a colorazione negativa. Questa immagine TEM mostra virus fantasma ottici contenenti verde indocianina, sottoposti a colorazione negativa. Qui vengono mostrati gli spettri di assorbanza e di fluorescenza dei virus fantasma ottici una volta acquisiti.

Questa tecnica può essere eseguita in cinque minuti per campione. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe essere in grado di comprendere bene come incapsulare componenti virali o non virali all'interno di subunità proteiche del capside.