Name: Luso di interferone-γ Enzyme-linked Assay Immunospot per caratterizzare Nuovi epitopi T-cellulari di Papillomavirus Umano (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-08T12:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 41 s
Description: Scopri come isolare e caratterizzare cloni di cellule T specifiche per antigeni HPV utilizzando l'assay interferon-γ ELISpot. Questo metodo consente di identificare nuovi epitopi T-cellulari per lo sviluppo di vaccini e immunoterapie mirate.

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Questo studio è stato sostenuto da un American Cancer Society Scholars Award (RSG-06-180-01-MBC) e da sovvenzioni NIH (R01 CA143130 e UL1RR029884).

<ol><li>Nakagawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+favorable+clinical+trend+is+associated+with+CD8+T-cell+immune+responses+to+the+human+papillomavirus+type+16+e6+antigens+in+women+being+studied+for+abnormal+pap+smear+results%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Low.+Genit.+Tract+Dis%22%5BJournal%5D)">A favorable clinical trend is associated with CD8 T-cell immune responses to the human papillomavirus type 16 e6 antigens in women being studied for abnormal pap smear results.</a> J. Low. Genit. Tract Dis. 14, 124-129 (2010).</li>
<li>Walls, E., Crawford, L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWalls%2C+E+%22Lymphocytes%3A+A+practical+approach%22">Lymphocytes: A practical approach</a>. Klaus, G. G. B. , IRL Press. 149-149 (1987).</li>
<li>Nakagawa, M., Kim, K. H., Moscicki, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterns+of+CD8+T-cell+epitopes+within+the+human+papillomavirus+type+16+%28HPV+16%29+E6+protein+among+young+women+whose+HPV+16+infection+has+become+undetectable%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Diagn.+Lab+Immunol%22%5BJournal%5D)">Patterns of CD8 T-cell epitopes within the human papillomavirus type 16 (HPV 16) E6 protein among young women whose HPV 16 infection has become undetectable.</a> Clin. Diagn. Lab Immunol. 12, 1003-1005 (2005).</li>
<li>Wang, X., Santin, A. D., Bellone, S., Gupta, S., Nakagawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+CD4+T-cell+epitope+described+from+one+of+the+cervical+cancer+patients+vaccinated+with+HPV+16+or+18+E7-pulsed+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Immunol.+Immunother%22%5BJournal%5D)">A novel CD4 T-cell epitope described from one of the cervical cancer patients vaccinated with HPV 16 or 18 E7-pulsed dendritic cells.</a> Cancer Immunol. Immunother. 58, 301-308 (2009).</li>
<li>Larsson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+recombinant+vaccinia+virus+based+ELISPOT+assay+detects+high+frequencies+of+Pol-specific+CD8+T+cells+in+HIV-1-positive+individuals%5BTitle%5D)+AND+%22AIDS%22%5BJournal%5D)">A recombinant vaccinia virus based ELISPOT assay detects high frequencies of Pol-specific CD8 T cells in HIV-1-positive individuals.</a> AIDS. 13, 767-777 (1999).</li>
<li>Nakagawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytotoxic+T+lymphocyte+responses+to+E6+and+E7+proteins+of+human+papillomavirus+type+16%3A+relationship+to+cervical+intraepithelial+neoplasia%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Cytotoxic T lymphocyte responses to E6 and E7 proteins of human papillomavirus type 16: relationship to cervical intraepithelial neoplasia.</a> J. Infect. Dis. 175, 927-931 (1997).</li>
<li>Wang, X., Moscicki, A. B., Tsang, L., Brockman, A., Nakagawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Memory+T+cells+specific+for+novel+human+papillomavirus+type+16+%28HPV16%29+E6+epitopes+in+women+whose+HPV16+infection+has+become+undetectable%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Vaccine+Immunol%22%5BJournal%5D)">Memory T cells specific for novel human papillomavirus type 16 (HPV16) E6 epitopes in women whose HPV16 infection has become undetectable.</a> Clin. Vaccine Immunol. 15, 937-945 (2008).</li>
<li>Evans, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigen+processing+defects+in+cervical+carcinomas+limit+the+presentation+of+a+CTL+epitope+from+human+papillomavirus+16+E6%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Antigen processing defects in cervical carcinomas limit the presentation of a CTL epitope from human papillomavirus 16 E6.</a> J. Immunol. 167, 5420-5428 (2001).</li>
<li>Shi, Y., Smith, K. D., Kurilla, M. G., Lutz, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytotoxic+CD8%2B+T+cells+recognize+EBV+antigen+but+poorly+kill+autologous+EBV-infected+B+lymphoblasts%3A+immunodominance+is+elicited+by+a+peptide+epitope+that+is+presented+at+low+levels+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cytotoxic CD8+ T cells recognize EBV antigen but poorly kill autologous EBV-infected B lymphoblasts: immunodominance is elicited by a peptide epitope that is presented at low levels in vitro.</a> J. Immunol. 159, 1844-1852 (1997).</li>
<li>Varadarajan, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+single-cell+analysis+of+human+CD8%2B+T+cell+functions+reveals+discordance+for+cytokine+secretion+and+cytolysis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">A high-throughput single-cell analysis of human CD8+ T cell functions reveals discordance for cytokine secretion and cytolysis.</a> The Journal of Clinical Investigation. , (2011).</li>
<li>Nakagawa, M., Kim, K. H., Moscicki, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+methods+of+identifying+new+antigenic+epitopes+of+human+papillomavirus+type+16+E6+and+E7+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Diagn.+Lab+Immunol%22%5BJournal%5D)">Different methods of identifying new antigenic epitopes of human papillomavirus type 16 E6 and E7 proteins.</a> Clin. Diagn. Lab Immunol. 11, 889-896 (2004).</li>
<li>Nakagawa, M., Kim, K. H., Gillam, T. M., Moscicki, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HLA+class+I+binding+promiscuity+of+the+CD8+T-cell+epitopes+of+human+papillomavirus+type+16+E6+protein%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">HLA class I binding promiscuity of the CD8 T-cell epitopes of human papillomavirus type 16 E6 protein.</a> J. Virol. 81, 1412-1423 (2007).</li>
<li>Brown, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell+epitope+%22hotspots%22+on+the+HIV+Type+1+gp120+envelope+protein+overlap+with+tryptic+fragments+displayed+by+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22AIDS+Res.+Hum.+Retroviruses%22%5BJournal%5D)">T cell epitope "hotspots" on the HIV Type 1 gp120 envelope protein overlap with tryptic fragments displayed by mass spectrometry.</a> AIDS Res. Hum. Retroviruses. 21, 165-170 (2005).</li>
<li>Masemola, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+and+promiscuous+CTL+epitopes+in+conserved+regions+of+Gag+targeted+by+individuals+with+early+subtype+C+HIV+type+1+infection+from+southern+Africa%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Novel and promiscuous CTL epitopes in conserved regions of Gag targeted by individuals with early subtype C HIV type 1 infection from southern Africa.</a> J. Immunol. 173, 4607-4617 (2004).</li>
<li>Walker, B. D., Korber, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+control+of+HIV%3A+the+obstacles+of+HLA+and+viral+diversity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Immune control of HIV: the obstacles of HLA and viral diversity.</a> Nat. Immunol. 2, 473-475 (2001).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da dichiarare.

Tradizionalmente, gli immunologi hanno cercato di caratterizzare nuovi epitopi per linfociti T stimolando in vitro i linfociti T di interesse e conducendo un esperimento di diluizione limite per isolare i cloni di linfociti T specifici per l'epitopo. Successivamente, i cloni di linfociti T venivano caratterizzati mediante un saggio di rilascio del cromo8,9. Tuttavia, molti tentativi non hanno avuto successo perché la frequenza dei linfociti T poteva essere troppo bassa per consentirne l'isolamento, op...

<table><tbody><tr><td>Kit per l'isolamento di cellule T CD8</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-094-156</td><td></td></tr><tr><td>Fitoemoagglutinina</td><td>Remel, Thermo Fisher Scientific</td><td>R-30852801</td><td>2 mg/vial</td></tr><tr><td>Mezzo di Yssel&amp;rsquo;s</td><td>Gemini Bio Products</td><td>400-102</td><td>1% siero umano poolato</td></tr><tr><td>Piastra a 96 pozzetti con fondo rotondo</td><td>BD Biosciences</td><td>08-772-17</td><td></td></tr><tr><td>IL-2 umana ricombinante</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>202-IL-050</td><td>50&amp;#x03BC;g</td></tr><tr><td>Piastra a 24 pozzetti</td><td>Corning</td><td>07-200-84</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata al fosfato</td><td>Cellgro</td><td>MT-21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo monoclonale primario anti-IFN-&amp;#947; (D1K)</td><td>Mabtech</td><td>3420-3-1000</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo monoclonale anti-IFN-&amp;#947; coniugato alla biotina (7B-6)</td><td>Mabtech</td><td>3420-6-1000</td><td></td></tr><tr><td>Piastra Multiscreen HA ELISPOT</td><td>EMD Millipore</td><td>MAHA S45 10</td><td></td></tr><tr><td>Dimetilsolfossido</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td>flacone da 100 ml</td></tr><tr><td>Siero umano poolato</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S40510H</td><td>Inattivare al calore</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Cellgro</td><td>MT-10-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2287-100ml</td><td></td></tr><tr><td>Kit Vectastain Elite ABC</td><td>Vector Laboratories</td><td>NC9313719</td><td></td></tr><tr><td>Diaminobenzidina stabile</td><td>Open Biosystems</td><td>MBI 1241</td><td></td></tr><tr><td>Lettore AID EliSpot Reader Classic</td><td>Autoimmun Diagnostika GmbH</td><td>ELR06</td><td></td></tr></tbody></table>

l&#39;uso di interferone-γ enzyme-linked assay immunospot per caratterizzare nuovi epitopi t-cellulari di papillomavirus umano

Use of Interferon-&gamma; Enzyme-linked Immunospot Assay to Characterize Novel T-cell Epitopes of Human Papillomavirus

È stato sviluppato un protocollo per superare le difficoltà legate all'isolamento e alla caratterizzazione di rari linfociti T specifici per patogeni, come il papillomavirus umano (HPV), che causano infezioni localizzate. I passaggi previsti comprendono l'identificazione della/delle regione/i delle proteine dell'HPV che contengono l'epitopo/i per linfociti T in un soggetto, la selezione dei linfociti T specifici per il peptide in base alla secrezione di interferone-γ (IFN-γ) e la coltivazione e caratterizzazione delle linee clonali di linfociti T (Fig. 1). Il soggetto 1 era un paziente recentemente diagnosticato con una lesione intraepiteliale squamosa di alto grado mediante biopsia e sottoposto nello stesso giorno della raccolta dei linfociti T a escissione chirurgica con anello diatermico come trattamento1. Una regione all'interno delle proteine E6 ed E7 del papillomavirus umano di tipo 16 (HPV 16) contenente un epitopo per linfociti T è stata identificata mediante un saggio enzimatico immunospot legato all'IFN-γ (ELISPOT) eseguito con peptide sintetici sovrapposti (Fig. 2). I dati ottenuti da questo saggio sono stati utilizzati non solo per identificare una regione contenente un epitopo per linfociti T, ma anche per stimare il numero di linfociti T specifici per l'epitopo e per isolare tali cellule in base alla secrezione di IFN-γ, impiegando microsfere magnetiche commerciali (kit per l'isolamento di linfociti T CD8, Miltenyi Biotec, Auburn CA). I linfociti T selezionati in base alla secrezione di IFN-γ sono stati diluiti e coltivati singolarmente in presenza di una miscela di cellule feeder irradiate, al fine di favorire la crescita di un singolo linfocita T per pozzetto. Queste linee clonali di linfociti T sono state sottoposte a screening mediante saggio ELISPOT per IFN-γ in presenza di peptide che coprono la regione identificata e di cellule B linfoblastoidi autologhe trasformate dal virus di Epstein-Barr (LCLs, ottenute come descritto da Walls e Crawford)2, al fine di ridurre al minimo il numero di cellule clonali di linfociti T necessarie. Invece di utilizzare le 1 x 105 cellule per pozzetto tipicamente impiegate nei saggi ELISPOT1,3, sono state utilizzate 1.000 cellule clonali di linfociti T in presenza di 1 x 105 LCLs autologhe, riducendo drasticamente il numero di cellule clonali necessarie. Le LCLs autologhe hanno svolto non solo la funzione di presentare antigeni peptidici alle cellule clonali di linfociti T, ma anche quella di mantenere un'elevata densità cellulare nei pozzetti, consentendo alle cellule clonali di linfociti T specifiche per l'epitopo di secernere IFN-γ. Ciò garantisce il corretto svolgimento del saggio ELISPOT per IFN-γ. Analogamente, saggi ELISPOT per IFN-γ sono stati impiegati per caratterizzare la sequenza amminoacidica minima e ottimale dell'epitopo per linfociti T CD8 (HPV 16 E6 52-61 FAFRDLCIVY) e il relativo elemento di restrizione HLA di classe I (B58). Il saggio ELISPOT per IFN-γ è stato inoltre eseguito utilizzando LCLs autologhe infettate con virus vaccinia esprimenti la proteina E6 o E7 dell'HPV 16. Il risultato ha dimostrato che l'epitopo per linfociti T E6 viene processato endogenamente. È stata inoltre evidenziata la riconoscibilità incrociata dell'epitopo omologo di altri tipi di HPV ad alto rischio. Questo metodo può essere utilizzato anche per descrivere epitopi per linfociti T CD44.

La caratterizzazione di epitopi per cellule T di patogeni che causano infezioni localizzate, come il papillomavirus umano, rappresenta una sfida a causa del numero limitato di cellule T in circolo. Viene descritto un metodo mediante il quale cellule T rare sono state isolate e caratterizzate a partire da un numero molto ridotto di cellule.

L&#39;uso di interferone-γ Enzyme-linked Assay Immunospot per caratterizzare Nuovi epitopi T-cellulari di Papillomavirus Umano

È stato sviluppato un protocollo per superare le difficoltà legate all'isolamento e alla caratterizzazione di rare cellule T specifiche per i patogeni, come l'umano...

L'obiettivo generale di questa procedura è isolare, coltivare e analizzare cloni di cellule T specifiche per l'antigene del virus del papilloma umano (HPV) provenienti da pazienti. Innanzitutto, stabilire una linea di cellule T CD8, eseguire un saggio SBOT e stimare la frequenza di cellule T specifiche per l'antigene. Dopo aver isolato i cloni di cellule T specifiche per l'antigene in base alla secrezione di interferone gamma, effettuare un saggio SBOT ad alto rendimento per l'interferone gamma al fine di identificare i cloni di cellule T specifici per l'epitopo.Continuare a caratterizzare le linee cellulari di linfociti T per il peptide ottimale minimo. Le sequenze degli epitopi determinano anche se l'epitopo viene processato endogenamente. Identificare l'elemento di restrizione HLA e valutare le reazioni incrociate con altri tipi di HPV ad alto rischio.In definitiva, l'obiettivo è descrivere nuovi epitopi virali dell'HPV rilevanti dal punto di vista clinico attraverso lo screening e la caratterizzazione di linfociti T specifici per l'antigene provenienti da pazienti. Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come l'utilizzo del saggio LY per identificare linfociti T specifici per l'antigene, è che la probabilità di successo è molto più elevata. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo dell'immunologia, ad esempio quali porzioni dell'HPV vengono riconosciute dai linfociti T. Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla terapia o alla diagnosi del cancro della cervice, poiché vaccini e immunoterapie possono essere sviluppati sulla base delle conoscenze riguardanti le specificità dei linfociti T.Questo metodo può fornire informazioni sugli epitopi delle cellule T CD8 e può essere applicato anche ad altri sistemi, come gli epitopi delle cellule T CD4. Un saggio SPO per l'interferone gamma con una linea di cellule T CD8 stabilita dal soggetto uno ha determinato che la regione E6 46-70 di HPV6/16 conteneva un epitopo per cellule T. Queste cellule T specifiche per l'epitopo sono state selezionate in base alla secrezione di interferone gamma. Preparare la miscela di cellule accessorie composta da cellule mononucleate del sangue periferico allogene irradiate, cellule linfoblastoidi e fitoemagglutinina in mezzo completo per cellule E.Ora, mediante diluizione seriale delle cellule T specifiche per l'epitopo isolate nella miscela di cellule feeder, preparare una concentrazione di cinque cellule per millilitro utilizzando una piastra per pipetta multicanale. Aggiungere 100 microlitri per pozzetto di cellule T specifiche per l'epitopo diluite in piastre a 96 pozzetti con fondo rotondo. Colture per cinque giorni a 37 gradi Celsius e 5% CO2; stimolare le cellule con interleuchina umana ricombinante due dal giorno 11 al giorno 14.Identificare visivamente le colonie di linfociti T in crescita come pellet di grandi dimensioni sul fondo delle pozzette della piastra. A volte il mezzo diventa giallo. Preparare una nuova miscela di cellule feeder e un'aliquote di mezzo ecel completo da un millilitro per pozzetta in una piastra a 24 pozzette.Un esperimento di successo dipende dalla capacità di isolare e coltivare cloni di linfociti T con la micropipetta da 200 microlitri. Trasferire i cloni di linfociti T singolarmente in pozzetti separati contenenti le cellule ad alimento piegate. Ripetere fino a quando tutti i cloni di linfociti T sono stati trasferiti.Rivestire le pozzette di piastre sbot sterili con 50 microlitri di anticorpo monoclonale primario anti-interferone gamma a cinque microgrammi per millilitro dopo un'incubazione di un'ora a quattro gradi Celsius. Lavare tre volte con 200 microlitri di PBS.Quindi bloccare il legame non specifico con 50 microlitri di siero umano polivalente al 5% in RPMI 1640. Rimuovere sempre eventuali bolle di grandi dimensioni forandole con un ago sterile. Incubare per un'ora a 37 gradi Celsius e 5% di CO2.Successivamente, aggiungere 1 × 10⁵ LCL autologhe in 50 microlitri di RPMI 1640 con 5% di siero umano. Procedere mescolando le cellule di ciascun clone di linfociti T con una pipetta da un millilitro e trasferire 100 microlitri in un tubo Eppendorf sterile. Diluire con 500 microlitri di RPMI 1640 contenente 5% di siero umano pool.Quindi, centrifugare le cellule per formare il pellet, decantare il soprannatante e risospendere le cellule in 110 microlitri di RPMI 1640 contenente siero umano al 5%. Piastrare ora 50 microlitri di ciascuna sospensione cellulare clonale per un'analisi rapida in pozzetti corrispondenti delle due piastre per spot di Ellis, destinati ai pozzetti di controllo positivo con PHA. Combinare il mezzo rimanente di diversi tubi einor e piastrare 50 microlitri ciascuno nei successivi pozzetti corrispondenti.Preparare anche pozzetti di controllo negativo con 50 microlitri di mezzo. Per la piastra di prova, aggiungere 50 microlitri di peptidi contenuti nella regione positiva ai pozzetti di controllo positivo. Aggiungere 10 microlitri di soluzione madre di PHA e 40 microlitri di RPMI 1640 alla piastra contenente solo mezzo.Aggiungere 50 microlitri di RPMI 1640 con 5% di siero umano poolato e incubare le piastre per il test di Ellis tutta la notte a 37 gradi Celsius in atmosfera di 5% CO2. Non spostare le piastre durante l'intero periodo di incubazione. Decantare il mezzo, quindi lavare i pozzetti tre volte con 200 microlitri di PBS contenente 0,05% di tween 20.Successivamente, aggiungere 50 microlitri dell'anticorpo monoclonale biotinilato anti interferone gamma e incubare per due ore. Lavare tre volte con 200 microlitri di PBS contenente 0,1% di Tween 20. Quindi aggiungere 50 microlitri di avidina appena preparata e perossidasi di rafano dolce biotinilata, incubare le piastre a 37 gradi Celsius e 5% di CO2 per un'ora; dopo tre lavaggi con PBS contenente 0,1% di Tween 20, aggiungere 50 microlitri di substrato stabile.Incubare le piastre Dino benzine per cinque minuti a temperatura ambiente per consentire lo sviluppo del colore. Lavare ora tre volte con 200 microlitri di acqua deionizzata. Lasciare asciugare completamente la piastra.Contare le macchie utilizzando un lettore automatico di macchie Ellis. Selezionare i cloni di linfociti T per la conferma della specificità verso l'epitopo. Quindi eseguire il saggio di Ellis con 10 alla terza cellule T clonali per valutarne la reattività verso ciascuno dei tre peptidi contenuti nella regione dell'epitopo.Preparare LCL autologhe infettate con il virus vaccinia ricombinante di tipo selvaggio e anche LCL autologhe infettate con il virus vaccinia ricombinante che esprime la proteina E6 o E7 del VPH 16. Nuovamente, utilizzare il saggio Ellis bot su cellule T clonali selezionate per confrontare la reattività verso LCL autologhe infettate con il virus vaccinia ricombinante di tipo selvaggio e la reattività verso LCL autologhe infettate con il virus vaccinia ricombinante che esprime la proteina E6 o E7 del VPH 16, usando cloni selezionati di linfociti T. In primo luogo, eseguire un saggio Ellis Spott utilizzando una serie di peptidi sovrapposti di nove amminoacidi (nine MER) che coprono la regione dell'epitopo.Quindi eseguire un saggio di spot LY per verificare la reattività verso una serie di peptidi di lunghezza variabile. Procedere con un saggio di spot lie con un intervallo di concentrazioni di alcuni peptidi, molto probabilmente contenenti la sequenza minima e ottimale di aminoacidi.Preparare LCL allogenici isolati dal soggetto umano di interesse che condividono una o due molecole HLA di classe I. Selezionare cloni di cellule T in buona proliferazione. Eseguire un saggio Ellie spot utilizzando 10 alla quinta di LCL allogenici e 10 alla terza di cellule clonali di linfociti T, con il peptide minimo e ottimale a 10 micromolari.Dopo aver caratterizzato i cloni di cellule T specifici per l'epitopo, è possibile verificarne la reattività incrociata con altri tipi di HPV ad alto rischio. È sufficiente sottoporre a screening i cloni di cellule T di interesse mediante un saggio Ellie spot per rilevare la reattività con peptidi contenenti sequenze aminoacidiche omologhe provenienti da altri tipi di HPV ad alto rischio. Il soggetto uno è una donna afroamericana di 22 anni con anamnesi recente di lesione intraepiteliale squamosa di alto grado, diagnosticata mediante biopsia.Nel giorno del trattamento mediante escissione elettrica LU, i linfociti T sono stati prelevati dal paziente. I risultati del saggio di Ellis spot della sua linea di linfociti T CD8 indicano che la regione HPV 16, E6 46-70 conteneva un epitopo per linfociti T in base ai livelli di secrezione di interferone gamma pari a 1,2 volte 10 alla quinta. I linfociti T specifici per l'epitopo sono stati selezionati dopo diluizione limite su un quinto delle cellule selezionate.Sono stati raccolti 262 cloni di cellule T. Le cellule selezionate rimanenti non sono state utilizzate poiché il primo tentativo di clonazione delle cellule T è stato efficace. Il saggio di screening Hiro put Ellis spot eseguito su 94 di questi cloni ha identificato 62 cloni positivi allo screening.I cloni di cellule T rimanenti non sono stati testati poiché il primo saggio Ellis Spott ha identificato cloni di cellule T specifici per il peptide. La natura specifica per l'epitopo di otto cloni positivi allo screening con buona crescita è stata confermata mediante i tre peptide 15 MER che coprono individualmente la regione.Tutti i cloni di linfociti T hanno mostrato un risultato positivo con i peptidi HPV 16, E6 51-65. Sei degli otto cloni sono risultati positivi con il peptide E6 46-60 e nessun clone è risultato positivo con il peptide E6 56-70. Qui sono mostrati saggi Ellis spot con LCL autologhi infettati da un virus vaccinia ricombinante che esprime la proteina E6 o la proteina E7 dell'HPV 16.Questi risultati dimostrano che i cloni di cellule T riconoscono un epitopo E6 processato endogenamente; una serie di peptidi sovrapposti di nove amminoacidi che coprono la regione H PV 1646-65 ha facilitato la caratterizzazione della sequenza minima e ottimale dell'epitopo per le cellule T. La risposta migliore è stata ottenuta con il peptide E 6 53-61; gli epitopi peptidici sovrapposti hanno identificato il peptide di dieci amminoacidi E 6 52-61 come sequenza minima e ottimale in modo più coerente. Curiosamente, il peptide E 6 53-61 ha indotto una risposta altrettanto intensa con il clone di cellule T.Le curve di dose-risposta del numero 79 indicano che il peptide E 6 52-61 mantiene la positività in modo molto più efficace rispetto al peptide E 6 53-61 a concentrazioni più basse di peptide. In questo esempio, il soggetto A, nel quale è stata riscontrata la rilevazione della sequenza minima e ottimale dell'E 6 75-83, è stato analizzato per la restrizione della molecola HLA di classe I dell'epitopo T CD8. Si osserva una forte positività con un LCL che esprime le molecole B 62 e CW 3, mentre una positività di fondo è mostrata da un LCL che esprime CW 3; alcune regioni del genoma del VPH sono ben conservate.Ad esempio, sequenze omologhe alle regioni HPV 16, E 6 da 52 a 61 identificate nel soggetto uno erano presenti in altri 13 tipi di HPV ad alto rischio. In accordo con ciò, è stata dimostrata una forte riconoscibilità incrociata per otto dei 13 tipi di HPV ad alto rischio; una volta acquisita, questa tecnica può essere eseguita in sette settimane a partire dal giorno del prelievo del sangue, se eseguita correttamente. Ricordarsi di utilizzare sempre la tecnica asettica durante tutta la procedura.Ricordare che il lavoro con qualsiasi virus può essere pericoloso e che è sempre necessario adottare precauzioni, come indossare indumenti protettivi, durante l'esecuzione della procedura. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come caratterizzare nuove Es di cellule T.

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Un rapido, protocollo semplice e conveniente per la generazione di donatore-derivati ​​multivirus specifici CTL (RCtl) per infusione a trapianto allogenico di cellule staminali emopoietiche (HSCT) a rischio di sviluppare infezioni da CMV, EBV o Adv. Questo processo di fabbricazione è GMP e deve assicurare l'applicazione più ampia di cellule T immunoterapia al di là di centri specializzati.

Generazione di Multivirus-cellule T specifiche per prevenire / curare infezioni virali dopo trapianto allogenico di cellule staminali ematopoietiche

Abbiamo sviluppato un test in vitro per studiare il ruolo delle vie immunomodulanti nella regolazione della secrezione di citochine da HIV-specifiche cellule T CD4.

In vitro per valutare l&#39;impatto di immunoregolatorio Pathways su HIV-specifica CD4 T effettrici delle cellule di funzione

La capacità di monitorare le risposte delle cellule T in dettaglio in vivo è importante per lo sviluppo della nostra comprensione della risposta immunitaria. Qui si descrive l'uso di array di destinazione fluorescenti (ALS) in un test in vivo di cellule T in che valuta&gt; 250 parametri contemporaneamente mediante citometria a flusso.

L&#39;uso di fluorescenti target matrici per la valutazione delle cellule T risposte<em&gt; In vivo</em

Generazioni di nuovi saggi funzionali quali interferone gamma (IFN-γ) ELISpot, che rilevano la produzione di citochine a livello di singola cellula e forniscono sia la caratterizzazione quantitativa e qualitativa delle risposte delle cellule T possono essere utilizzati per valutare la risposta immunitaria cellulo-mediata contro varicella zoster virus (VZV).

Sviluppo di un Varicella-Zoster immunità cellulo-mediata specifica-Virus-IFN γ ELISpot test per valutare seguito cordone ombelicale trapianto di sangue

A lungo termine colta interferone-γ enzimatico test immunospot viene usato come misura di risposte di memoria centrale e correla con le risposte vaccino anti-micobatteri protettivi. Con questo test, le cellule mononucleari del sangue periferico sono stimolati con antigeni micobatterici e interleuchina-2 per 14 giorni, differenziazione e consentendo l'espansione delle cellule T di memoria centrale.

Applicazione di lungo termine colta interferone-γ Enzyme Linked immunospot Assay per la valutazione effettori e memoria delle cellule T risposte a Bovino

L'obiettivo del presente protocollo è quello di consentire il rilevamento in vivo di uccisione di una cella di destinazione in un modello murino di antigene-specifiche.

In Vivo Test per la determinazione della funzione citolitica di cellule T antigene-specifiche utilizzando un modello di vaccinazione

Qui presentiamo un protocollo per descrivere lo sviluppo e la convalida di una singola molecola matrice digitale analisi di ELISA, che consente la rilevazione ultra-sensibile di tutti i sottotipi di IFN-α in campioni umani.

Sviluppo e validazione di una singola molecola ultrasensibile di matrice digitale analisi enzima-collegata dell'immunosorbente per umana dell'interferone-α

Lo sviluppo del test ELISpot interferone per la cavia PBMCs permette la caratterizzazione delle risposte delle cellule T in questo modello altamente rilevante per lo studio delle malattie infettive. Abbiamo applicato il test per misurare le risposte delle cellule T associate intradermica consegna di vaccini a DNA.

Ottimizzazione del interferone-gamma ELISpot analisi di risposte a cellula T misura nel modello cavia dopo la vaccinazione

Questo protocollo descrive un flusso di lavoro dettagliato per la generazione ed ex vivo caratterizzazione dei virus oncolytic per espressione di immunomodulatori, usando i virus di morbillo codifica anticorpo cellula T ager come esempio. Applicazione e adattamento ad altre piattaforme di vettore e transgeni accelererà lo sviluppo di nuovi immunovirotherapeutics per la traduzione clinica.

Paramyxoviruses per l'immunomodulazione mirata tumore: progettazione e valutazione Ex Vivo

Questo manoscritto descrive come valutare l'immunogenicità in vivo delle vescicole extracellulari derivate dalle cellule tumorali (EV) utilizzando la citometria a flusso. Gli EV derivati da tumori sottoposti a morte cellulare immunogenica indotta dal trattamento sembrano particolarmente rilevanti nell'immunosorveglianza tumorale. Questo protocollo esemplifica la valutazione dei veicoli elettrici immunostimolatori del tumore indotti da oxaliplatino, ma può essere adattato a varie impostazioni.

In vivo Screening di immunogenicità delle vescicole extracellulari derivate dal tumore mediante citometria a flusso delle cellule T della milza

Scopri come isolare e caratterizzare cloni di cellule T specifiche per antigeni HPV utilizzando l'assay interferon-γ ELISpot. Questo metodo consente di identificare nuovi epitopi T-cellulari per lo sviluppo di vaccini e immunoterapie mirate.

L'uso di interferone-γ Enzyme-linked Assay Immunospot per caratterizzare Nuovi epitopi T-cellulari di Papillomavirus Umano

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