Name: DII-Etichettatura di neuroni DRG per studiare Branching assonale in un monte intero Preparazione di Spinal Cord embrionali di topo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-12-13T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 14 s
Description: Impara a visualizzare i pattern di ramificazione assonale dei neuroni DRG in preparati di midollo spinale embrionale di topo. Questo metodo consente di studiare lo sviluppo neuronale e identificare molecole coinvolte nella biforcazione assonale.

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Gli autori desiderano ringraziare il Dr. Alistair Garratt (Max Delbrück Center di Berlino) per gli utili commenti. Questo lavoro è stato sostenuto dal centro di ricerca collaborativa (SFB665) del Consiglio di ricerca tedesco (DFG).

1. Dissezione procedura Nota: l&#39;uso sperimentale di topi dovrebbe seguire ufficialmente approvato le linee guida per la cura e l&#39;uso di animali da laboratorio. <ol><li> Prima della preparazione, impostare il microscopio da dissezione e disporre gli strumenti chirurgici necessari per la dissezione tra cui forbici grandi e piccole, grandi pinza dentata, pinze curve e quattro set di Dumont n.5 dissezione pinze (di cui due con dentro-lucido punte) ( Per i dettagli si veda la tabella di reagenti e attrezzature specifiche). Mettere un foglio di carta da filtro in un 100-mm Sylgard rivestite piastra di Petri. Versare PBS freddo nei pozzetti di una piastra ben 12, un 100-mm Petri e un tubo di 12 ml e lasciare sul ghiaccio. Pipettare 2 ml di tampone di fissaggio (4% paraformaldeide in PBS, pH 7,4) in ciascun pozzetto di secondo a 12 pozzetti e posto sul ghiaccio. </li><li> Dopo anestesia, il sacrificio della diga a tempo incinta E12.5 (rilevamento di plug vaginale è stato designato come E0.5), posizionare il mousecon il suo lato ventrale fino a tre fogli di carta assorbente e bagnare la zona addominale con etanolo al 70%. </li><li> Aprire la cavità addomino, isolare le corna bilaterale uterina e trasferirli in uno dei piatti da 100 mm con gelida PBS. </li><li> Sotto il controllo microscopico, fare una incisione longitudinale della parete uterina con le piccole, le forbici e tagliare subito via ogni sacco amniotico della placenta. </li><li> Sbucciare via il sacco amniotico da ciascun embrione e tagliare il cordone ombelicale. </li><li> Utilizzando piccole forbici, decapitare gli embrioni e mettere la testa o una parte di essi da parte per l&#39;isolamento di DNA genomico se la genotipizzazione dovrebbe essere richiesto. Successivamente, il trasferimento Torsi nei pozzetti rispettivi del 12-pozzetti con PBS freddo. </li><li> Bagnare la carta da filtro nel piatto Sylgard con qualche goccia di PBS e posizione di un torso embrionale con il suo lato dorsale fino sulla carta. Per una migliore stabilità, raddrizzare la coda e le estremità lontano dal corpo. </li><li> Lavorosotto un microscopio da dissezione con un ingrandimento di circa 16x, con attenzione pizzicare la pelle di un embrione al di sopra del midollo spinale con due paia di pinze a punta sottile e delicatamente a pezzi. A partire dalla metà, procedere in primo luogo verso la coda e poi ripresa dalla metà verso il lato anteriore. </li><li> Bagnato l&#39;embrione di volta in volta con due o tre gocce di PBS per evitare che si secchi. </li><li> Per evitare che DRG sono strappato fuori dal midollo spinale, quando viene rimosso dall&#39;embrione staccare il DRG e il midollo spinale dalla colonna circostante cartilagineo vertebrale del movimento a scorrimento orizzontale con la lama di una pinza sottile con dentro-lucido punte. A partire dalla metà del lato destro dell&#39;embrione, il lavoro la strada verso la coda e poi alla fine anteriore. In seguito, ripetere la procedura sul lato opposto. Fare attenzione a non strappare il DRG associati. </li><li> Per staccare completamente il midollo spinale allentato dall&#39;embrione, sollevare la sua cervicoAl parte con una pinza sottile ed estrarlo in un unico pezzo verso il suo fine caudale. </li><li> Immergere il midollo spinale isolato con DRG attaccato in un pozzo di 12-pozzetti riempiti con tampone di fissaggio e procedere con la preparazione del midollo spinale da embrioni restanti. </li><li> Fissare midollo spinale almeno due ore sul ghiaccio. </li></ol> 2. DII-etichettatura dei neuroni DRG <ol><li> Per ogni midollo spinale di essere etichettati, preparare due aghi di vetro con un estrattore micropipetta. Noi utilizziamo un modello di Sutter P-97 elettrodo estrattore (impostazione di programma: 1 CALORE = 625, VEL = 35, TEMPO = 175, 2 CALORE = 600, VEL = 25, TEMPO = 175, 3 CALORE = 630, VEL =... 30, TEMPO = 150). </li><li> Sotto il controllo microscopico intingere nell&#39;acqua la punta di ogni ago di vetro tre a cinque volte in un (w / v) di soluzione al 5% del DII in etanolo. Evaporazione dell&#39;etanolo crea un sottile strato di cristalli Dii sul ferro. </li><li> Lavorando sotto un microscopio da dissezione con un ingrandimento di circa 40x, mettere un midollo spinale con la sua vlato entral su una diapositiva. Utilizzando forbici primavera, aprire il cordone sul lato ventrale in tutta la sua lunghezza, tagliando attraverso il fondello per consentire il successivo montaggio della preparazione di un libro aperto rovesciato modalità (vedi sezione C). </li><li> Posizionare il midollo spinale con la parte dorsale su una diapositiva. Poi manualmente il cavo di approccio con il DII coperte punta dell&#39;ago di vetro sotto la visualizzazione microscopica e con attenzione perforare ogni DRG secondo su un lato del midollo spinale. Quasi nessuna traccia di Dii dovrebbe essere visibile nella DRG trafitto per assicurare l&#39;etichettatura di solo un piccolo numero di neuroni. Prendete un secondo ago per l&#39;altro lato del cavo. Mirando solo ogni DRG secondo evita una sovrapposizione di proiezioni etichettati assonale da DRG vicini che potrebbero complicare la differenziazione dei singoli assoni. </li><li> Ritorno il midollo spinale al buffer fissazione e incubare al buio per almeno sei ore a temperatura ambiente o notte a 4 ° C per dare tempo per la tintura di diffuse lungo l&#39;assone all&#39;interno della membrana plasmatica. Lasciare per un periodo di incubazione più lungo (fino a due giorni a 4 ° C) se l&#39;analisi della crescita collaterali nel midollo spinale è voluta. </li></ol> 3. Analisi di montaggio e microscopiche <ol><li> A seguito di tintura diffusione, la posizione di una sola corda spinale con il suo lato dorsale verso il basso su un vetrino in una goccia di PBS. Fare attenzione che i DRG collegati siano correttamente orientati lateralmente e non si mescolano. Aspirare il liquido in eccesso e appiattire il cavo in un libro aperto rovesciato modalità con pinze. </li><li> Montare la preparazione su un vetrino da microscopio utilizzando PBS. </li><li> Per evitare l&#39;aumento della colorazione di fondo indesiderati analisi microscopica di fluorescenza etichettati proiezioni assonale deve essere effettuata il giorno del montaggio. Fino ad allora tenere le diapositive al buio a 4 ° C. </li></ol> 4. Rappresentante dei risultati: Il midollo spinale del mouse riceve afferente projections da 8 coppie di cervicale, 13 paia di toracici, 5 paia di paia lombare e 4 del DRG sacrale per un totale di 60 gangli spinali. Dopo un po &#39;la formazione di un midollo spinale con la maggior parte DRG ancora attaccato può essere isolato da un embrione in meno di cinque minuti. Questa procedura è adatta per l&#39;isolamento di midollo spinale con DRG attaccato da E11.5 E13.5 a embrioni di topo. Tuttavia, i risultati migliori sono ottenuti da E12.5. Risultati esemplare della procedura di etichettatura descritti qui sono mostrati in Figura 3. L&#39;etichettatura dei DRG su tutta la lunghezza del midollo spinale può quindi essere utilizzato per quantificare il comportamento ramificazione degli assoni a diversi livelli vertebrali (Fig. 4). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3667/3667fig1.jpg" /> Figura 1. Schema raffigurante le due principali modalità di diramazione assonale. (A) Branching dalle attività del cono di crescita che potrebbe portare a una biforcazione - come indicato qui - così come pergole terminale complessi o(B) formazione collaterale all&#39;albero assone (interstiziale ramificazione). Quest&#39;ultima modalità è il tipo dominante ramificazione di proiettare assoni corticali e talamocorticale 6,7. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3667/3667fig2.jpg" /> Figura 2 proiezioni afferenti di neuroni DRG nel midollo spinale embrionale visualizzare entrambi i tipi di ramificazione assonale:. Ramo assoni prima volta al DREZ di biforcazione (1) e dalla risultante figlia forma rami collaterali dopo un periodo di attesa di interstiziale ramificazione (2). <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3667/3667fig3.jpg" /> Figura 3. Visualizzazione di singole traiettorie degli assoni dei neuroni embrionali DRG del mouse. (A) del midollo spinale con DRG allegato preparato da un embrione E12.5 mouse. (Bar Scala, 1 mm.) (BD) viste dorsali di DII marcato DRG di topi wild-type con un ingrandimento maggiore sono mostrati. In B ogni DRG secondo è labeled di DII. Immagini di fluorescenza sono invertite, caudale è a sinistra e in C e D, laterale è in fondo. In C un piccolo numero di assoni è etichettato e ad un maggiore ingrandimento la presenza di T-come i rami possono essere identificati nel DREZ del midollo spinale. (Bar Scala, 250 micron (B), 100 micron (C) e 50 micron (D).) <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/3667/3667fig4.jpg" /> Figura 4. Quantificazione dei rami a forma di T, singolo turno rostrale o caudale nel wild-type e C-peptide natriuretico di tipo (CNP) topi con deficit a E13.5. Il numero di assoni singolo contati sono riportati tra parentesi per i livelli di tronco diverso per ogni genotipo. C-o-R si trasforma - la crescita solo in direzione caudale e rostrale, rispettivamente. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/3667/3667fig5.jpg" /> Figura 5. Un cGMP segnalazione innesca biforcazione sensoriale assone al DREZ del midollo spinale. (A) Schema divia di segnalazione cGMP composto da CNP ligando, il recettore guanylyl ciclasi Npr2 e la serina / treonina chinasi cGKIα nei neuroni DRG embrionale. Npr2 genera cGMP dal GTP su stimolazione da parte di CNP. (B) DII tracciamento degli assoni dei singoli DRG neuroni nei topi wild-type e CNP-carenti. (Bar Scala, 25 micron).

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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Modelli stereotipati di proiezione che comprende entrambi i tipi di formazione ramo assonale insieme a facilità di preparazione, in combinazione con l&#39;uso di tessuto fissato per Dii etichette rende il midollo spinale embrionale con allegato un modello DRG favorevole per lo studio assonale ramificazione. L&#39;applicazione di piccole quantità di Dii con aghi di vetro rivestito permette - in contrasto con l&#39;etichettatura maggior parte dei DRG - la visualizzazione di piccoli gruppi di neuroni DRG e quindi l&#39;ana...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Commenti (opzionale) </td></tr><tr><td> Stereomicroscopio Stemi RDC </td><td> Zeiss </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Soluzione tampone fosfato (PBS) </td><td> Biochrom AG </td><td> L182-50 </td><td></td></tr><tr><td> Paraformaldeide </td><td> Merck </td><td> 8.18715.1000 </td><td></td></tr><tr><td> Standard di forbici chirurgiche </td><td> Strumenti Scienza multa </td><td> 14001-13 </td><td></td></tr><tr><td> Dentata pinze di serie </td><td> Strumenti Scienza multa </td><td> 11021-14 </td><td></td></tr><tr><td> Extra forbici iris multa </td><td> Strumenti Scienza multa </td><td> 14088-10 </td><td></td></tr><tr><td> Pinze curve </td><td> Strumenti Scienza multa </td><td> 11003-13 </td><td></td></tr><tr><td> Dumont No.5 multa suggerimenti pinze </td><td> Strumenti Scienza multa </td><td> 11254-20 </td><td></td></tr><tr><td> Dumont No.5 finitura a specchio forcipe </td><td> Strumenti Scienza multa </td><td> 11252-23 </td><td></td></tr><tr><td> Vännäs-Tübingen primavera forbici </td><td> Strumenti Scienza multa </td><td> 15008-08 </td><td></td></tr><tr><td> Filtro di carta </td><td> Fisher Scientific </td><td> FB59041 </td><td></td></tr><tr><td> Sylgard 184 </td><td> Mondo precission Instruments </td><td> SYLG184 </td><td></td></tr><tr><td> 100-mm Petri </td><td> Greiner </td><td> 663102 </td><td></td></tr><tr><td> 12 ml di tubo in polipropilene </td><td> Carl Roth GmbH </td><td> ECO3.1 &lt;/ Td&gt; <td></td></tr><tr><td> 12-lastra e cultura </td><td> Becton Dickinson </td><td> 35-3043 </td><td></td></tr><tr><td> Etanolo </td><td> Merck </td><td> 1.00983.2500 </td><td></td></tr><tr><td> Flaming / Brown micropipetta estrattore P-97 </td><td> Sutter Instrument Co. </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Vetro borosilicato capillari </td><td> Harvard Apparatus </td><td> 30-0066 </td><td></td></tr><tr><td> DII (1,1 &#39;-Dioctadecyl-3, 3,3&#39;, 3&#39;-tetrametil - indocarbocyanine perclorato) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 468495 </td><td></td></tr><tr><td> Microscopio diapositive SuperFrost Plus. </td><td> Carl Roth GmbH </td><td> H867.1 </td><td></td></tr><tr><td> Vetro di copertura scivola </td><td> Carl Roth GmbH </td><td> 1870,2 </td><td></td&gt; </tr></tbody></table>

dii-etichettatura di neuroni drg per studiare branching assonale in un monte intero preparazione di spinal cord embrionali di topo

DiI-Labeling of DRG Neurons to Study Axonal Branching in a Whole Mount Preparation of Mouse Embryonic Spinal Cord

Qui vi presentiamo una tecnica per etichettare le traiettorie di piccoli gruppi di neuroni DRG nel midollo spinale embrionale dalla colorazione diffusivo utilizzando il tracciante lipofilo 1,1 &#39;-dioctadecyl-3, 3,3&#39;, 3&#39;-tetramethylindocarbocyanine perclorato (DII) 1 . Il confronto di percorsi assonale di wild-type con quelli di topi in cui sono mutati i geni consente di testare per un ruolo funzionale delle proteine ​​candidato nel controllo della ramificazione degli assoni che è un meccanismo essenziale per il cablaggio del sistema nervoso. Assonale ramificazione permette ad un singolo neurone per connettersi con bersagli multipli, fornendo così le basi fisiche per l&#39;elaborazione parallela di informazioni. Ramificazioni in regioni obiettivo intermedio di crescita assonale può essere distinto da arborizzazione terminale. Inoltre, diverse modalità di formazione ramo assonale possono essere classificati a seconda che i risultati ramificazione delle attività del cono di crescita (splitting o reggiseno in ritardonching) o lo sbocciare di collaterali dal pozzo assone in un processo chiamato interstiziale ramificazione 2 (Fig. 1). Le proiezioni centrali dei neuroni dal DRG offrire un utile sistema sperimentale per studiare entrambi i tipi di ramificazione assonale: quando i loro assoni afferenti raggiungere la dorsale zona di ingresso principale (DREZ) del midollo spinale embrionale tra i giorni 10-13 (E10 - E13) che visualizzare un modello stereotipato di T-o Y biforcazione. I due assoni figlia risultante quindi procedere in direzione rostrale o caudale, rispettivamente, al margine dorsolaterale del midollo e solo dopo un periodo di attesa collaterali germogliano da queste assoni staminali di penetrare la materia grigia (interstiziale ramificazione) e il progetto di neuroni in specifiche relè lamine del midollo spinale, dove ulteriori arborize (ramificazione terminale) 3. Tracciati DII hanno rivelato coni di crescita nella zona dorsale voce principale del midollo spinale che sembrava essere in process della scissione suggerendo che biforcazione è causata dalla scissione del cono di crescita in sé 4 (Fig. 2), tuttavia, altre opzioni sono state discusse anche 5. Questo video dimostra come prima di sezionare il midollo spinale dei topi E12.5 lasciare il DRG allegato. A seguito di fissazione degli importi piccolo campione di DII vengono applicati a DRG con aghi di vetro tirato da tubi capillari. Dopo una fase di incubazione, il midollo spinale è montato etichettato come un libro aperto rovesciato preparazione di analizzare i singoli assoni usando la microscopia a fluorescenza.

Le proiezioni stereotipata di afferenze sensoriali nel midollo spinale di roditori offrire un sistema facilmente accessibile sperimentale per studiare ramificazione degli assoni attraverso il tracciamento degli assoni singolo.

DII-Etichettatura di neuroni DRG per studiare Branching assonale in un monte intero Preparazione di Spinal Cord embrionali di topo

Presentiamo qui una tecnica per marcare le traiettorie di piccoli gruppi di neuroni dei gangli delle radici dorsali (DRG) all'interno del midollo spinale embrionale mediante colorazione per diffusione utilizzando il...

L'obiettivo generale di questa procedura è visualizzare i modelli di ramificazione degli assoni individuali dei neuroni del ganglio della radice dorsale in una preparazione in toto del midollo spinale embrionale del topo. Per identificare le molecole coinvolte nella ramificazione assonica, le proiezioni dei neuroni del ganglio della radice dorsale nel midollo spinale del topo offrono un sistema sperimentale semplice, agevole e accessibile per lo studio della ramificazione assonica. Quando gli assoni ENT dei neuroni del ganglio della radice dorsale raggiungono la zona di entrata della radice dorsale del midollo, mostrano un modello stereotipato di biforcazione a forma di T o di Y.I due assoni figli risultanti proseguono quindi rispettivamente in direzioni rostrali o caudali al margine laterale dorsale del midollo. Solo dopo un periodo di attesa, si sviluppano ramificazioni collaterali da questi assoni principali che penetrano nella sostanza grigia e proiettano neuroni di raccordo in specifici strati del midollo spinale, dove avviene l'arborizzazione terminale. Questo video mostra innanzitutto come dissezionare il midollo spinale.Con il ganglio della radice dorsale (DRG) collegato, prelevato da un topo al giorno embrionale 12,5, dopo la fissazione del campione, vengono applicate piccole quantità di dii sul DRG utilizzando aghi di vetro ottenuti tirando tubi capillari. Dopo un periodo di incubazione, il midollo spinale marcato viene montato come preparato a libro aperto capovolto per analizzare singoli assoni mediante microscopia a fluorescenza. La ramificazione degli assoni rappresenta un aspetto fondamentale nello sviluppo della connettività neurale. Il metodo qui presentato consente un confronto tra i modelli di ramificazione di topi di tipo Y e quelli di topi mutanti, permettendo così l'identificazione di molecole che regolano la ramificazione assonica.Per prima cosa, preparare il microscopio stereoscopico e disporre gli strumenti chirurgici necessari per la dissezione. Posizionare un foglio di carta da filtro in una piastra di Petri da 100 millimetri rivestita in seta. Successivamente, versare PBS freddo nelle cavità di una piastra a 12 pozzetti, in una piastra di Petri da 100 millimetri e in un tubo da 12 millilitri, quindi lasciare in ghiaccio.Pipettare due millilitri di tampone fissativo al 4% di paraformaldeide in ogni pozzetto di una seconda piastra a 12 pozzetti e porre sul ghiaccio. Dopo aver isolato le corna uterine bilaterali da un topo, trasferirle nella piastra da 100 millimetri contenente PBS freddo di ghiaccio. Dopo aver decapitato gli embrioni, trasferire i tocchi degli embrioni nel 12.Wettaggiare la piastra con la carta filtro nel piatto S guard con alcune gocce di PBS e posizionare un tronco embrionale con il lato dorsale rivolto verso l'alto sulla carta per una migliore stabilità. Raddrizzare la coda e le estremità allontanandole dal corpo, operando sotto un microscopio stereoscopico con un ingrandimento di circa 16 volte. Pinzare con attenzione la pelle dell'embrione sopra il midollo spinale utilizzando due paia di pinze fini, partendo dal centro.Strappare delicatamente la pelle prima verso la coda, quindi riprendere dal centro verso il lato anteriore. Inumidire l'embrione di tanto in tanto con due o tre gocce di PBS per evitare che si secchi e per garantire che i gangli della radice dorsale o DRG non si stacchino dal midollo spinale. Quando viene rimosso, staccare i DRG e il midollo spinale dalla colonna vertebrale cartilaginea circostante partendo dal lato destro centrale dell'embrione e procedendo verso la coda, quindi verso l'estremità anteriore per staccare completamente il midollo spinale ormai sciolto dall'embrione.Prendere la parte cervicale con pinzette fini ed estrarla tutta in un pezzo verso il cordone. Immergere il midollo spinale isolato con i gangli sensitivi dorsali (DRG) attaccati in una pozzetta di una piastra a 12 pozzette riempita con tampone di fissazione, quindi procedere con la preparazione dei midolli spinali dai restanti embrioni.Fissare i midolli spinali per almeno due ore sul ghiaccio per ogni cordone vinilico da etichettare; preparare due aghi di vetro utilizzando un estrattore per micropipette sotto controllo microscopico. Immergere la punta di ciascun ago di vetro da tre a cinque volte in una soluzione al 5% di colorante in etanolo per creare uno strato sottile di cristalli di colorante sull'ago, operando sotto un microscopio stereoscopico con un ingrandimento di circa 40 volte. Posizionare un midollo spinale con il lato ventrale rivolto verso l'alto su un vetrino utilizzando forbici a molla.Aprire il cordone lungo il lato ventrale per tutta la sua lunghezza tagliando la lamina del pavimento, in modo da permettere il montaggio in configurazione "a libro aperto rovesciato". Posizionare il midollo spinale con il lato dorsale rivolto verso l'alto sul vetrino. Quindi avvicinare manualmente al cordone la punta ricoperta di dai dell'ago di vetro e forare con attenzione ogni secondo ganglio radicolare dorsale su un lato del midollo spinale.Dovrebbero essere visibili quasi nessun traccia di dai nel DRG perforato per garantire l'etichettatura di un numero ridotto di neuroni utilizzando il secondo ago. Ripetere per l'altro lato del midollo, mirando soltanto ogni secondo DRG, per evitare sovrapposizioni delle proiezioni assonali etichettate da gangli adiacenti, che potrebbero complicare la differenziazione degli assoni individuali.Riportare il midollo spinale nel buffer di fissazione e incubare al buio per almeno sei ore a temperatura ambiente o tutta la notte a quattro gradi Celsius, in modo da permettere al tracciante di diffondere lungo l'assone all'interno della membrana plasmatica. Dopo la diffusione del tracciante, posizionare un singolo midollo spinale con il lato dorsale rivolto verso il basso su un'immersione in una goccia di PBS, aspirare il liquido in eccesso e appiattire il midollo in modalità "libro aperto rovesciato". Utilizzando pinze.Assicurarsi che i gangli radicolari dorsali (DRG) siano correttamente orientati lateralmente e non si mescolino; montare il preparato su un vetrino utilizzando PBS per prevenire l'aumento di colorazioni di fondo indesiderate. L'analisi microscopica in fluorescenza delle proiezioni assonali marcate deve essere eseguita il giorno del montaggio. Nel frattempo, conservare i vetrini al buio a quattro gradi Celsius.Qui, viste dorsali di gangli della radice dorsale (DRG) marcati con Dai, provenienti da topi di tipo selvaggio, sono mostrate a ingrandimenti crescenti come descritto ogni due secondi. I DRG sono stati marcati con Dai. In questo caso, un piccolo numero di assoni è marcato e, a un ingrandimento maggiore, è possibile identificare la presenza di ramificazioni a forma di T nella zona di entrata della radice dorsale del midollo spinale.Rami a forma di T. Singole rotazioni rostrali R o caudali C vengono quantificate in diversi livelli vertebrali sia in topi di tipo selvaggio che in topi privi del peptide natriuretico di tipo C (CNP) a 13,5 giorni post-coito (E 13,5).Il numero totale di neuroni contati è indicato tra parentesi e la percentuale del tipo di traiettoria è riportata di seguito. A differenza degli assoni di tipo selvatico, i neuroni del ganglio dorsale radicolare nei mutanti della segnalazione CMP ruotano in una sola direzione invece di biforcarsi nella zona di entrata della radice dorsale del midollo spinale. Questo metodo ci ha permesso di identificare una cascata di segnalazione CGP essenziale per la biforcazione degli assoni sensoriali nella zona di entrata della radice dorsale.A differenza degli accenti di tipo selvatico di cgm, il movimento del segnale P si piega solo in una direzione anziché biforcarsi nella zona di entrata della radice dorsale. Questi studi hanno inoltre rivelato che la formazione del co non è alterata nei mutanti del segnale CG P, indicando che il secondo tipo di ramificazione assonica osservato nei neuroni DGen è regolato in modo diverso.

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