Generazione di culture Raft organotipiche da cheratinociti umani primari

L'obiettivo generale di questa procedura è generare colture organotipiche a rastrello a partire da cheratinociti primari o linee cellulari epiteliali stabilizzate. Questo viene ottenuto innanzitutto preparando tappi di collagene contenenti fibroblasti. Successivamente, le cellule epiteliali vengono stratificate sulla superficie dei tappi.

I tappi vengono quindi trasferiti sulle griglie dei rafter e mantenuti all'interfaccia aria-liquido per 10-14 giorni. Nell'ultima fase, i rafter vengono raccolti. Infine, le variazioni nella differenziazione epiteliale possono essere valutate mediante analisi istologica o immunoistochimica. Questo metodo può fornire informazioni dettagliate sulla differenziazione epiteliale.

Si può applicare anche ad altri sistemi, come i virus che infettano l'epitelio cutaneo o mucosale come parte del loro ciclo vitale. A dimostrare la procedura sarà Dan Anneker, uno studente laureato del mio laboratorio. Per prima cosa, versare l'acido cromosolforico in un becher di vetro e immergervi le griglie metalliche per un'ora.

Quindi risciacquare continuamente le griglie tutta la notte con acqua di rubinetto. Dopo il risciacquo notturno, risciacquare le griglie per altre tre-cinque ore in acqua bidistillata, quindi lasciare asciugare le griglie galleggianti. Successivamente, piegare tre lati della griglia galleggiante, a una distanza di circa 0,5 centimetri l'uno dall'altro, e sottoporre le griglie galleggianti ad autoclave.

Dopo aver preparato il gel di collagene, trattare i due fibroblasti con tripsina, quindi neutralizzare la tripsina con il mezzo. Trasferire i fibroblasti in un tubo conico da 50 millilitri e contare le cellule per determinare il numero di zattere che possono essere preparate. Successivamente, dopo aver centrifugato le cellule per quattro minuti a 244 ×g a temperatura ambiente, aspirare il mezzo dal pellet di fibroblasti e risospendere le cellule in un volume appropriato di buffer di riconstituzione costituito da DMEM e collagene, in base al numero di zattere calcolato.

Aggiungere il collagene per ultimo per evitare che il gel si solidifichi troppo rapidamente. Una volta aggiunto il collagene, mescolare la soluzione rapidamente ma delicatamente per evitare l'introduzione di bolle nel gel. Se la miscela di gel è troppo gialla, aggiungere alcune gocce di soluzione sterilizzata al filtro.

Un normale idrossido di sodio. Mescolare delicatamente fino a quando il gel assume un colore arancio rossastro indicativo del pH corretto. Ora pipettare lentamente tre millilitri della miscela di collagene e fibroblasti lungo il lato di ciascun pozzetto di una piastra da coltura a sei pozzetti, evitando di formare bolle, quindi incubare la piastra per 30 minuti a 37 gradi Celsius per permettere al gel di solidificare.

Quando il gel è solidificato, aggiungere tre millilitri di mezzo E con EGF sulla sommità del gel di collagene solidificato e reinserire la piastra nell'incubatore. Dopo aver coltivato cheratinociti a basso passaggio fino a raggiungere una confluenza di circa il 70%, trattare i cheratinociti con tripsina e quindi neutralizzare la tripsina con eed. In presenza di EGF, contare le cellule per determinare il numero di raft che possono essere prodotti.

Dopo aver centrifugato le cellule, risospendere il pellet in un millilitro di eed con EGF per ogni coltura di raft calcolata. Ora, rimuovere il mezzo dai gel di collagene inclinando la piastra a sei pozzetti sul lato e aggiungere quindi due millilitri di eed fresco con EGF a ciascun gel. Successivamente, aggiungere con attenzione un millilitro di cheratinociti risospesi ai due millilitri di eed già presenti in ciascuno dei pozzetti.

Pipettare delicatamente i cheratinociti insieme ai due millilitri di mezzo e lasciarli cadere goccia a goccia sul tappo di collagene. Posizionare la piastra nell'incubatrice a 37 gradi Celsius per due o quattro giorni, in modo da consentire alle cellule di crescere fino a raggiungere la confluenza. Le cellule sono pronte quando il mezzo diventa giallo un giorno dopo la sostituzione, oppure entro il quarto giorno, utilizzare pinze sterili per posizionare una griglia metallica sterile a forma di zattera, con i lati piegati verso il basso, in una piastra da 10 centimetri.

Aspirare il mezzo da un gel di collagene, quindi far scorrere una spatola sterile lungo il perimetro del gel con un movimento verticale per staccare il gel dai lati della pozzetta. Il trasferimento del tappo di collagene dalla piastra a sei pozzette alla griglia è la parte più delicata di questa procedura. Prestare attenzione a far scivolare delicatamente la spatola sotto il tappo senza dividerlo e appoggiarlo piatto sulla griglia evitando la formazione di bolle d'aria tra il tappo e la griglia.

In seguito, è possibile utilizzare una spatola per livellare le parti che si sono piegate verso l'interno durante questa procedura. Per rimuovere il gel, inclinare leggermente la piastra e inserire la spatola sotto il gel sollevandolo. Posizionare il gel di collagene sulla griglia metallica senza formare bolle tra la griglia e il gel.

Per creare un'interfaccia aria-liquido, aggiungere lentamente EED senza EGF sul fondo della piastra in modo che la griglia dei rafter sia a contatto con il mezzo, ma il gel di collagene no. Infine, incubare i rafter a 37 gradi Celsius. Mantenendo l'interfaccia aria-liquido, raccogliere i rafter dopo 14 giorni. Come mostrato in questa figura, i rafter ottenuti da cheratinociti umani primari immortalizzati con HPV 31 o H fk, 30 sono notevolmente più spessi rispetto ai rafter ottenuti da cheratinociti umani normali della pelle, o hks.

Pertanto, le proteine dell'HPV hanno la capacità di mantenere le cellule in differenziamento attive nel ciclo cellulare. In questo caso, è stata eseguita un'analisi immunohistochimica su sezioni trasversali di colture organotipiche a rasoio ottenute da cellule HK 30 e da cellule HKS normali, utilizzando un anticorpo diretto contro la citocheratina 10 o K 10 in verde. La K 10 non era espressa nello strato basale, indicato qui dalle frecce, ma era presente soltanto negli strati suprabasali, costituiti da cellule che si differenziano progressivamente.

In questa figura, l'espressione della proteina del papillomavirus umano, E uno, E quattro, una proteina tardiva limitata agli strati più superficiali dell'epitelio e rappresentata in verde, è mostrata come previsto. Nessuna colorazione è osservata nelle colture a raffa provenienti da hks normali, come nella figura precedente.

Le frecce indicano nuovamente lo strato basale dell'epitelio dopo il suo sviluppo. Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della biologia del cancro per studiare la patogenesi dei papillomavirus umani utilizzando un sistema che imita la differenziazione epiteliale in vivo. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come preparare colture organotipiche a raffida da cheratinociti primari o da linee cellulari epiteliali stabilizzate.