Dissezione e Cultura del mouse dopaminergici e striatali Espianti di saggi di collagene matrice tridimensionale

L'obiettivo generale di questa procedura è coltivare neuronciti dopaminergici e espianati striatali per studiare lo sviluppo delle vie mesencefaliche e striatonigrali. Questo viene ottenuto innanzitutto mediante la microdissezione dello striato e della regione mesencefalica dopaminergica da embrioni di topo a 14,5 giorni di sviluppo (E 14,5). Il secondo passaggio consiste nel tagliare espianati di dimensioni adeguate dal tessuto dissezionato.

Successivamente, gli espianti vengono posizionati all'interno di un gel di collagene in prossimità l'uno dell'altro. Il passaggio finale consiste nel coltivare questi espianti per un periodo di due o tre giorni, in modo da permettere l'uscita degli assoni. Infine, l'immunohistochimica per specifici marcatori neuronali viene utilizzata per evidenziare e quantificare le risposte assonali attrattive o repulsive.

Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come le colture di esplicanti dissociati o a due DX, è che la matrice di collagene fornisce un substrato tridimensionale per gli assoni, imitando l'ambiente extracellulare. Inoltre, la matrice di collagene permette la formazione di gradienti relativamente stabili di proteine rilasciate dagli esplicanti X o da cellule posizionate in prossimità. La procedura sarà dimostrata da Ava Smith e Francesca, altri due studenti laureati del mio laboratorio.

Per iniziare questa procedura, dissezionare gli embrioni di topo E14.5 dall'utero della madre. Mantenerli in mezzo L15 su ghiaccio fino al momento dell'utilizzo. Successivamente, trasferire un embrione al microscopio ed isolare il cervello dall'embrione.

Quindi rimuovere il cefalone tagliando lungo la parte mediale di ciascuna vescicola cefalica. Successivamente, rimuovere la guaina meningea. Effettuare un taglio dorsoventrale appena rostrale alla flessione mesencefalica.

Successivamente, effettuare un altro taglio dorsoventrale subito caudale al flessore cefalico. Quindi eseguire un taglio caudale lungo la linea mediana dorsale utilizzando un coltello per microdissezione, al fine di esporre il tessuto sottostante del mesencefalo ventrale. Prestare attenzione a non danneggiare il tessuto del mesencefalo ventrale, poiché contiene i neuroni dopaminergici.

In seguito, effettuare due incisioni parallele e laterali alla linea mediana ventrale per rimuovere il tessuto del mesencefalo dorsale. Successivamente, dividere il tessuto rimanente del mesencefalo ventrale in X espianti utilizzando un coltello per microdissezione alla fine della procedura. Mantenere gli X espianti in mezzo L 15 contenente 5%FBS sul ghiaccio fino all'uso.

Ora trasferire le vescicole telencefaliche cefaliche ottenute in precedenza durante la dissezione del mesencefalo al microscopio. Rimuovere il talamo tagliando tra il talamo e il tettun usando una pinzetta. Successivamente effettuare un taglio mediale-laterale in posizione rostrale rispetto al corpo striato per rimuovere le strutture rostrali come il bulbo olfattivo.

Successivamente, ripetere questo passaggio per il tessuto situato adiacente al corpo striato. Dopodiché, posizionare la fetta rimanente in modo da ottenere una vista coronale del corpo striato. Il corpo striato può essere riconosciuto come una parte del tessuto leggermente più trasparente.

Quindi isolare il corpo striato, quindi tagliarlo in impianti utilizzando un coltello per microdissezione. Evitare il tessuto leggermente più scuro vicino alla linea mediana, che contiene neuroni migranti dell'eminenza gangliare laterale e mediale. Aggiungere una goccia di collagene preparato su un coprivetrino nella cavità di una piastra a quattro pozzetti.

Mantenerlo in incubatrice a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica per 30 minuti. Durante questa incubazione, il collagene si gelatinizzerà. Una volta che il collagene si è gelatinizzato, utilizzare una pipetta con una punta da 200 microlitri per trasferire gli espanti dopaminergici o sal negli espanti di collagene.

Quindi spostare gli espianti l'uno vicino all'altro utilizzando un ago. Mantenerli distanziati di circa il diametro di un x espiante. Successivamente, rimuovere il mezzo in eccesso.

Aggiungere 20 microlitri del collagene preparato sopra l'espianto. Questo spesso provoca lo spostamento degli espianti. Riposizionare gli espianti utilizzando un ago.

Lasciare solidificare il collagene a temperatura ambiente per 15 minuti. Successivamente, trasferirlo nell'incubatrice a 37 gradi Celsius con 5% di anidride carbonica per 30 minuti. Dopo che il collagene si è solidificato, aggiungere 400 microlitri di mezzo explant e lasciare crescere per due o tre giorni nell'incubatrice a 37 gradi Celsius.

Per fissare delicatamente l'esplan, aggiungere paraformaldeide al 4% e mantenere a temperatura ambiente per un'ora. Dopo un'ora, lavarli in PBS a temperatura ambiente tre volte, ogni volta per 15 minuti.

Quindi, dopo aver rimosso il PBS, incubare i campioni nel buffer di blocco per due ore. Successivamente, incubarli tutta la notte con l'anticorpo primario in buffer di blocco a quattro gradi Celsius il giorno seguente. Lavare i campioni nel PBS cinque volte a temperatura ambiente, ogni volta per un'ora. Poi incubarli con l'anticorpo secondario coniugato al fluorocromo appropriato.

Quattro in tampone bloccante durante la notte a quattro gradi Celsius. A partire da questo passaggio, coprire gli espianti con carta d'alluminio per minimizzare l'esposizione alla luce. Lavare durante la notte in PBS a quattro gradi Celsius, seguito da diverse lavature il giorno successivo.

Successivamente, montare gli espianti sul vetrino del microscopio utilizzando un mezzo di montaggio prolungato con reagente antiossidante, con il lato dell'espianto rivolto verso il basso. Posizionare delicatamente un coprioggetto sul mezzo di montaggio per evitare di intrappolare bolle d'aria. Quindi acquisire immagini digitali degli x espianti mediante un microscopio a fluorescenza in epifluorescenza.

Utilizzando queste immagini, dividere ciascun esplicant X in quadranti al fine di generare un quadrante prossimale e un quadrante distale. Successivamente, misurare la lunghezza dei 20 neuriti più lunghi che emergono dall'esplicant X, sia nel quadrante prossimale che in quello distale. Utilizzare la lunghezza media dei 20 neuriti più lunghi per calcolare il rapporto prossimale-distale per ciascun esplicant individuale.

Un rapporto prossimale-distale maggiore di uno indica un'attrazione dell'assone. Un rapporto inferiore a uno indica una repulsione dell'assone. Qui è mostrato un espianato di mesencefalo colorato con anticorpo anti-tirosina idrossilasi che rivela la crescita assonica.

La linea tratteggiata indica gli espianti adiacenti. Le frecce indicano singoli neuriti e coni di accrescimento. Di seguito è riportato un esempio di quantificazione del rapporto prossimale-distale.

Sono divisi in quadranti uguali. Il quadrante prossimale è rivolto verso gli espanti X adiacenti, mentre il quadrante distale è rivolto in senso opposto. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come coltivare in co-coltura espanti dopaminergici e stratali per indagare lo sviluppo della via nigrostriatale e per studiare i meccanismi molecolari coinvolti nella formazione di queste vie.